异喹啉类生物碱及其衍生物在预防或治疗宫颈癌药物制备中的应用

摘要

本发明涉及一类预防及治疗宫颈癌的异喹啉类生物碱，属于天然药物提取物制备技术及抗肿瘤药用领域。如紫堇碱、异紫堇定碱、异波尔定碱、N-甲基莲叶桐文碱、秃疮花红碱或它们的药物可接受的盐或酯形式，其在预防及治疗宫颈癌药物制备中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种异喹啉类生物碱及其衍生物，及其用途，属于天然药物提取物及药学应用技术领域。

背景技术

宫颈癌是全世界仅次于乳腺癌导致妇女死亡的第二大恶性肿瘤，其特点为恶性程度高，治愈率差。WHO 2006年调查显示全球每年有49万例新增宫颈癌患者，死亡病例超过27万，其中有85%发现于发展中国家，严重危害女性健康，并且流行病学调查显示近年来发病率呈上升趋势发病年龄趋于年轻化。目前对于宫颈癌的临床治疗手段有外科手术切除，药物化疗及放射治疗三大主体手段，此外，还有新兴的生物治疗技术。但是以上几种技术由于存在治疗中或治疗后的不良并发症等缺点，往往很难达到长期的治疗效果。目前仍然缺乏有效的治疗手段。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一种作为预防及治疗宫颈癌的异喹啉类生物碱及其衍生物。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

式Ⅰ或Ⅱ化合物所能接受的盐或酯形式在预防及治疗宫颈癌药物制备中的应用；

Ⅰ

R₁是H、-OH、-OCH₃、-O-C₁-C₈烷基、-NH₂、-NO₂、-COOH、-COOCH₃、-COOCH₂CH₃、-COO-C₁-C₈烷基、-COO-氟烷基、C₁-C₈烷基、C₃-C₆环烷基、C₁-C₈羧酸、C₁-C₈羧酸酯、1-3个独立自选卤素/HSCH₂-、CH₃SCH₂CH₂-；

R₂是H、-OH、-OCH₃、-O-C₁-C₈烷基、-NH₂、-NO₂、-COOH、-COOCH₃、-COOCH₂CH₃、-COO-C₁-C₈烷基、-COO-氟烷基、C₁-C₈烷基、C₃-C₆环烷基、C₁-C₈羧酸、C₁-C₈羧酸酯、1-3个独立自选卤素/HSCH₂-、CH₃SCH₂CH₂-；；

R₃是H、-OH、-OCH₃、-O-C₁-C₈烷基、-NH₂、-NO₂、-COOH、-COOCH₃、-COOCH₂CH₃、-COO-C₁-C₈烷基、-COO-氟烷基、C₁-C₈烷基、C₃-C₆环烷基、C₁-C₈羧酸、C₁-C₈羧酸酯、1-3个独立自选卤素/HSCH₂-、CH₃SCH₂CH₂-；；

R₄是H、-OH、-OCH₃、-O-C₁-C₈烷基、-NH₂、-NO₂、-COOH、-COOCH₃、-COOCH₂CH₃、-COO-C₁-C₈烷基、-COO-氟烷基、C₁-C₈烷基、C₃-C₆环烷基、C₁-C₈羧酸、C₁-C₈羧酸酯、1-3个独立自选卤素/HSCH₂-、CH₃SCH₂CH₂-；

 

Ⅱ

R₁是H、-OH、-OCH₃、-O-C₁-C₈烷基、-NH₂、-NO₂、-COOH、-COOCH₃、-COOCH₂CH₃、-COO-C₁-C₈烷基、-COO-氟烷基、C₁-C₈烷基、C₃-C₆环烷基、C₁-C₈羧酸、C₁-C₈羧酸酯、1-3个独立自选卤素/HSCH₂-、CH₃SCH₂CH₂-；

R₂是H、-OH、-OCH₃、-O-C₁-C₈烷基、-NH₂、-NO₂、-COOH、-COOCH₃、-COOCH₂CH₃、-COO-C₁-C₈烷基、-COO-氟烷基、C₁-C₈烷基、C₃-C₆环烷基、C₁-C₈羧酸、C₁-C₈羧酸酯、1-3个独立自选卤素/HSCH₂-、CH₃SCH₂CH₂-；

R₃是H、-OH、-OCH₃、-O-C₁-C₈烷基、-NH₂、-NO₂、-COOH、-COOCH₃、-COOCH₂CH₃、-COO-C₁-C₈烷基、-COO-氟烷基、C₁-C₈烷基、C₃-C₆环烷基、C₁-C₈羧酸、C₁-C₈羧酸酯、1-3个独立自选卤素/HSCH₂-、CH₃SCH₂CH₂-；

R₄是H、-OH、-OCH₃、-O-C₁-C₈烷基、-NH₂、-NO₂、-COOH、-COOCH₃、-COOCH₂CH₃、-COO-C₁-C₈烷基、-COO-氟烷基、C₁-C₈烷基、C₃-C₆环烷基、C₁-C₈羧酸、C₁-C₈羧酸酯、1-3个独立自选卤素/HSCH₂-、CH₃SCH₂CH₂-。

优选地，紫堇碱、异紫堇定碱、异波尔定碱、N-甲基莲叶桐文碱、秃疮花红碱或它们的药物可接受的盐或酯形式在预防及治疗宫颈癌药物制备中的应用。

一种药物组合物，该组合物包括含药物有效量的权利要求1-2任一项的化合物可接受的盐或酯形式和药物可接受的赋形剂或载体。

本文中化合物的优选的盐形式包括那些与本领域已知的药物可接受的无机和有机酸所形成的盐。使用无机酸制得的盐形式包括治疗上可接受的卤酸盐及硫酸盐，例如盐酸盐、马来酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐。这些盐形式可以使用式Ⅰ或Ⅱ的碱性化合物和本领域已知的方法制备。

本发明化合物的酯形式包括具有1-6个碳原子的直链烷基酯或含有3或6个碳原子的支链烷基酯或苄基酯，包括甲基、乙基、丙基、丁基、2-甲基丙基和1,1-二甲基乙基酯。本文使用的输入烷基包括直链和支链的碳链。优选，C1-C3全氟烷基取代基是-CF3；-O-C1-C3全氟烷基取代基是-OCF3和-S-C1-C3全氟烷基取代基是-SCF3。

本发明的化合物是宫颈癌细胞抑制剂，因此用于在哺乳动物、优选人体中治疗、抑制、防止或预防那些涉及宫颈癌发生发展的病理的过程。因此，本发明化合物用于治疗或预防治疗不典型增生病变、原位癌、早期浸润癌、鳞状上皮浸润癌、腺癌。

本发明的化合物也用于预防及治疗其他因宫颈癌引发的合并并发症。

因作用机制不同，本发明化合物可以与其他抗肿瘤药物及其辅助药物联合使用。

本发明化合物可以增强机体自身免疫功能。本发明化合物可用于提高机体免疫力方面的治疗。

治疗、抑制、防止或预防本文所列出的不同动物每种疾病的方法是本发明的一部分。每种方法包括给予需要治疗的哺乳动物有效治疗剂量的本发明化合物或其药物可接受的盐或酯形式及各种药物载体赋形剂形式。

本发明还包括本发明中所涉及的化合物结构式Ⅰ、Ⅱ相关的药物组合。这些组合单独含有有效治疗剂量的本发明化合物或其药物可接受的盐或酯形式，或者与一种或多种药物载体或赋形剂相混合形式。本文中化合物的药物或治疗有效量是指所述化合物的量能充分抑制需治疗的哺乳动物中纤溶亢进，从而在相当程度上对所述症状提供改善，进而防止、抑制或限制所述疾病或症状的病理基础。

本发明化合物所使用的精确剂量取决于包括所给药对象、所治疗疾病的症状及严重程度、给药方法及所使用的赋形剂等因素。可以通过任何常规途径给予所述化合物、其盐或酯形式及含所述化合物、盐或酯形式的药物载体和赋形剂形式。给药形式包括口服给药、静脉给药、皮肤给药、经肠道给药、外用给药。所给予的化合物可以是游离的或以适当的药物盐或酯的形式。本发明化合物在治疗纤溶亢进和出血性疾病时，可以以任何同纤溶酶接触的方式起作用。它们可以以任何适用于给药的常规方式施用，或者作为单独的治疗剂型、或者以治疗制剂的组合形式施用。它们可以单独施用，但优选与合适的药物载体或赋形剂一起施用。药物载体是根据所选择的给药途径选择的，可使是固体、液体或固体和液体的混合物。

固体包括散剂、片剂、胶囊及纳米制剂。固体载体可以是一种或多种可以作为调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、粘合剂或片剂崩解剂的物质。在散剂中，所述载体是精细粉碎的固体，它与活性成分粉末混合。在片剂中，活性成分与具有必需的粘合特性载体以合适的比例混合并压制成所需的形状和大小。明胶胶囊含有活性成分和粉末载体，例知乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁和硬脂酸等。类似地，可以使用稀释剂压片。可以将片剂和胶囊制成缓释制剂，以持续数小时连续释放药物。压片可以用糖包衣或膜包衣，以掩盖令人不快的味造和使片芯与空气播离，或者进行肠溶包衣以在胃肠道中选择性崩解。 口服液体剂型可以含有着色剂和矫味剂以增加患者的依从性。合适的固体载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。薄膜衣、成囊材料、纳米材料也可以与本发明化合物及其盐或酯形式一起使用，术语“组合物”是指包括活性组分与成囊材料作为配方，有或没有其他载体。

无菌液体组合物包括溶液、悬浮液、乳液、浆剂、酊剂和醑剂。本发明的化合物可溶于或悬浮在药物可接受的载体中，例如灭菌注射用水。当化合物充分可溶时，它们可直接溶于使用或不适用合适的有机溶剂如聚乙二醇的生理盐水中。如果需要，化合物可分散在淀粉溶液、羧甲基纤维素钠水溶液或合适的环糊精水溶液中。为无菌溶液或悬浮液的液体药物组合物，可以通过肌肉、皮下、皮内、腹腔、静脉注射使用。在许多情况下，可以使用液体组合物形式代替固体口服给药方式。

优选配制所述化合物的单位剂型进行标准给药。可以将单位剂量配制成包装散剂、管形瓶或安瓿，并优选为胶囊或片剂形式。活性化合物的日剂量可以根据具体药物的药效特征、给药途径、患者的体重、年龄和性别、健康状况、疾病状态的性质和严重程度、同时治疗的其他药物、治疗的频率以及通过对血液药物浓度分析和患者恢复情况及对治疗的反应而做出相应调整。活性成分的日剂量是0.1至100 mg/kg，优选的日剂量是约1.0至约10 mg/kg。适于给药的组合物剂型包含约 l mg至约 10 mg活性成分/单位。在这些药物组合物中，活性成分通常的含量占组合物总重量的0.5-95 %。活性成分可以以固体剂型例如胶囊、片剂和粉末的形式，还可以以无菌液体制剂给药。

本发明的化合物可通过下面的实验方法，确定本发明化合物抑制宫颈癌细胞增殖的能力：

1. 提取与分离 

取干燥秃疮花（5.0 kg）粉碎，用95%乙醇提取3次（每次7 天），减压回收溶剂，得浸膏200.0 g。浸膏混悬于2000 ml 2% H₂SO₄水溶液中，依次氯仿萃取部分FA (12 g)，水溶液PH值用氨水调制9，氯仿萃取，萃取物FB（25 g），FB用硅胶25g拌样，500 g硅胶上柱，氯仿/甲醇/三乙胺（10:1:0.1到2:1:0.1）梯度洗脱，流速, 10 ml/min，薄层色谱检测，合并相同组分，得4个组分，FB1（5000 ml，4.0 g，100:1），FB2（4000 ml，4.0 g，50:1），FB3（5000 ml, 2.0 g，25:1）和FB4（3000 ml，3.5 g，5:1）；FB1以40g硅胶，氯仿/甲醇/三乙胺20:1:0.1、10:1:0.1、8:1:0.1、6:1:0.1为流动相，上柱洗脱，分别得到不同的异喹啉类生物碱化合物。

2. MTT实验

原理：利用MTT实验检测不同浓度的异喹啉类生物碱异紫堇定碱对Hela（携带18HPV）,Siha（携带16HPV）,C33A（无HPV感染）三种宫颈癌细胞增殖活力的影响。

每孔以5000个将细胞种进96孔板里，生长24h后，给予不同浓度的异紫堇定碱，分别培养24h,48h和72h后，每孔加入MTT 20 μl(终浓度为5 mg/L)，细胞被继续培养4h后，吸净孔内液体，加入150 μl DMSO(Sigma公司),水平振荡器振荡10min后，用Multiskan MS ELISA reader（Labsysterms,Helsinki,Finland）在490nm处检测吸光度值(OD值)。实验重复3次。

结果：异紫堇定碱抑制人宫颈癌细胞的MTT实验表明，如图1、图2所示，对hela细胞而言，表现出明显的抑制作用；对Siha细胞而言，表现出相类似的抑制作用；而C33A细胞来说是三种宫颈癌细胞系中表现最敏感的，抑制效果最强。总体来说异紫堇定碱表现出对宫颈癌细胞的明显抑制效应，并且随时间的推移这种效应将延续。此外，细胞的存活能力与异紫堇定碱的浓度存在依赖关系。将通过单因素方差分析证明具有统计学意义(P﹤0.05)。

如图3所示，三种细胞分别给予1000 mg/L的异紫堇定碱作用24h,48h,72h后表现出对于异喹啉类生物碱感性不同，在72h时，不如24h和48h。C33A发现对异紫堇定碱更为敏感，存活率均值间的差异用在24h,48h,72h三个时间点运用单因素方差分析中的Tukeys post hoc analysis，均值间的差异具有统计学意义(P﹤0.05)。

3. 透射电镜观察：

原理：电镜是观察超微结构病理学改变最直接的手段，可以直观的观察到细胞核，细胞质的细微结构的改变。通过透射电镜观察不同浓度异紫堇定碱(750mg/L, 1500mg/L, 3000mg/L)对宫颈癌细胞Hela, Siha, C33A超微结构的影响，并观察凋亡小体。

步骤：细胞以5×10⁶的密度被种进75cm²的培养瓶中，培养24h后，加入不同浓度的异紫堇定碱，同时设空白对照组，培养48h后, 分别用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，离心管收集，2000 rmp离心15min，再以PBS洗一遍，弃上清，缓慢加入0.25%的戊二醛固定液4℃固定过夜，系列脱水，浸透和包埋，超薄切片及染色观察。

    结果：如图4所示，培养48后。电镜结果显示：在Hela细胞中，H1少部分细胞溶解坏死，部分细胞核内异染色质增多，染色质边集，或见胞质内染色质团块皱缩，部分细胞胞质内见大量的自噬泡；H2见较多凋亡的细胞，且细胞胞膜不完整；H3见少量的凋亡细胞，大部分细胞溶解，坏死。在Siha细胞中，S1组细胞核变化不明显，但细胞质内见大量的自噬泡；S2细胞既有染色质的变化：核异染色质增多，染色质边集，及胞质内染色质团块，同时又有胞质变化，出现大量的早期凋亡细胞；S3变化同S2组，不同的是S3期溶解，坏死的是细胞数量多于S2组；C1组较多细胞溶解，坏死，细胞核无明显的变化，胞质内见大量的自噬泡；C2组，C3组大部分细胞膜不完整，胞质内见崩解的和染色质碎块，大量的凋亡细胞出现。

4. hochest33258荧光染料观察：

原理：通过hochest33258荧光染料对不同浓度异紫堇定碱(750mg/L，1500mg/L， 3000mg/L)作用的宫颈癌细胞Hela,Siha,C33A的形态进行观察。

步骤：将细胞以2.5×10⁶的密度种进24孔板中，培养24h后,刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养基，加入0.5 ml固定液，4℃过夜固定，去固定液，用PBS洗两遍，每次摇床摇动3 min，再加入0.5 ml Hoechest 33258染色液，染色5min,去染色液，用PBS洗两遍，每次3 min,吸尽液体，滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，在激发波长350 nm左右，发射波长460 nm左右的荧光显微镜下观察细胞核形态，结果如图5所示。

5. 流式细胞仪观察细胞凋亡：

原理：通过流式细胞仪可观察肿瘤细胞的凋亡情况，以此来判断药物对肿瘤细胞的抑制作用。

步骤：以1×10⁵的密度将细胞种进25cm²培养瓶中，培养24h后，弃去旧培养液，加入含不同药物浓度的异紫堇定碱(750mg/L, 1500mg/L, 3000mg/L)干预，分别培养24h, 48h, 72h，收集细胞（数目约1～5×10⁶个/ml），1000 r/min离心5min，弃去培养液，再用PBS洗涤一次，离心弃去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，40℃过夜，离心弃去固定液，PBS重悬5 min，400目的筛网过滤一次，1000 r/min离心5 min，弃去PBS，加入1 ml PI染液染色，40℃避光30 min，流式细胞仪检测，结果如图7所示。

6. TUNEL法检测细胞凋亡：

原理：TUNEL法利用TdT酶的作用，对凋亡细胞中的片断化DNA的3′-OH游离末端进行高效特异性标记FITC-dUTP，然后使用荧光显微镜直接进行观察。对掺入的FITC,同时也可以通过过氧化物酶标记的抗体FITC抗体进行检出，与显色化学物质反应后可以使用光学显微镜进行观察。

步骤：肿瘤细胞被种进24孔板进行爬片，培养24小时后弃掉旧培养基，用PBS清洗，用4%的中性甲醛（PBS配制PH=7.4）室温固定15-30 min，然后使用PBS清洗固定细胞2遍后，室温下使用0.3% H₂O₂甲醇处理细胞15-30 min,其目的是封闭内在性过氧化物酶，使用PBS清洗细胞后，再使用Permeabilisation Buffer 100 μl冰上反应2-5min,PBS清洗细胞，把预先配制好后冰冷放置的反应液50 μl (TdT Enzyme 5 μl+Labeling Safe Buffer 45 μl)加至载玻片上，在37℃保温箱中反应60-90 min,用PBS清洗停止反应，使用70 μl的Anti-FITC HRP Conjugate在37℃反应30 min后，再用PBS清洗，使用DAB.H2O2反应液室温下进行10-15 min显色反应。最后用灭菌蒸馏水清洗停止反应，再用3%甲基绿（Methyl Green）染色通过光学显微镜观察细胞染色情况，如图6所示。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1 正常空白组人宫颈癌细胞Hela, Siha, C33A的普通光镜形态学观察图；

图2不同浓度异紫堇定碱处理Hela, Siha, C33A48h的光镜形态学观察图；

图3所示，Hela,Siha,C33A分别给予1000 mg/L的异紫堇定碱作用24h, 48h, 72h后表现出的感性统计学数据图；

图4是不同浓度异紫堇定碱对宫颈癌细胞Hela, Siha, C33A超微结构影响的透射电镜观察图；

图5是不同浓度异紫堇定碱对宫颈癌细胞Hela, Siha, C33A影响的hochest33258的荧光染料观察图；

图6是TUNEL检测观察图；

图7是流式细胞仪观察细胞凋亡的观察图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实例1

异紫堇定碱抑制荷瘤裸鼠宫颈癌的作用

药物名称：异紫堇定碱

化学名称：

1,2,10-trimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-tetrahydro-4H-dibenzo[de,g]quinolin-11-ol

药物结构：

剂型：注射剂、粉针剂

给药途径：静注、静滴

实验动物：雌性Balb/C小鼠

探讨异紫堇定碱对人宫颈癌Hela细胞和Siha细胞裸小鼠肿瘤生长是否存在抑制作用，能否诱导细胞凋亡，从而评价异紫堇定碱在治疗人宫颈癌的应用价值。

实验方法：雌性BALB/C裸小鼠，6~8周龄，体重20~30g，0.25%胰酶消化呈对数生长的Hela细胞、Siha细胞，再用无血清的培养液离心洗涤2次，将细胞密度调整为1x10⁷个细胞/ml，并悬于PBS中备用。用碘伏消毒裸鼠接种部位，6号注射针头(l ml注射器)吸取0.2 ml的Hela细胞或Siha细胞悬液(约含有2×10⁶个细胞)，将细胞接种于裸鼠的颈背部皮下。①接种Hela细胞的裸鼠成瘤后(直径约0.2 cm)，随机分为3组，每组10只。A组瘤内注射无菌PBS，0.l ml/次; B组瘤内注射异紫堇定碱0.25 mg/次(浓度2.5 mg/ml，0.l ml/次); C组瘤内注射异紫堇定碱0.5 mg/次 浓度0.5 mg/ml，0.l ml/次。1周3次，持续3周。②接种siha细胞裸鼠成瘤后(直径约0.2 cm)，随机分为3组，每组10只。各组处置方法同Hela细胞。定期观察小鼠精神、活动力、反应、饮食及排便等情况，以及肿瘤体积和生长速度。分组处理3周后，行颈椎脱臼处死。

结果显示，治疗组裸鼠饮水、进食基本正常，无腹泻、消瘦、活动迟缓等不良反应，对照组裸鼠部分出现食欲减退、消瘦、懒动、反应能力下降等情况。各组瘤内注射部位皮肤无红肿、破溃。肿瘤组织从裸鼠上剥离时进行肉眼观察，呈结节状，各组大小不一，灰白色，质地偏硬，不易和周围组织分离。治疗期间，异紫堇定碱治疗组与对照组比较，肿瘤生长速度明显减慢，大部分治疗组肿瘤在用药中期不再长大，有的变小，部分肿瘤基本消退。治疗2l 天后，测量发现Hela细胞和Silia细胞治疗组肿瘤的体积和重量较对照组明显缩小和降低，差异有统计学意义。实验动物的组织病理切片示：对照组瘤细胞密集，排列紊乱，呈片状、不规则巢状分布，细胞具有明异型性，以圆形或椭圆形为主，核大深染，染色质成团状，有明显核仁，浆丰富，可见较多核分裂像，间质较少。治疗组瘤细胞排列较稀疏，可见片无结构坏死区，细胞分化程度较对照组瘤细胞成熟，细胞核深染，固缩，较小且规则，核质比减小，核仁减少，可见凋亡小体。说明异紫堇定碱提高宫颈癌细胞株分化能力，分化趋于成熟，增殖活性降低。以上动物实例说明：异紫堇定碱能抑制宫颈癌细胞的增殖，具有抗肿瘤作用。

实例2

紫堇定碱抑制荷瘤裸鼠宫颈癌的作用

药物名称：紫堇定碱

化学名称：

(6aS)-2,10,11-Trimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-tetrahydro-4H-dibenzo[de,g]quinolin-1-ol

药物结构：

剂型：注射剂、粉针剂

给药途径：静注、静滴

实验动物：雌性Balb/C小鼠

探讨紫堇定碱对人宫颈癌Hela细胞和Siha细胞裸小鼠肿瘤生长是否存在抑制作用，能否诱导细胞凋亡，从而评价紫堇定碱在治疗人宫颈癌方面的应用价值。

实验方法：雌性BALB/C裸小鼠，6~8周龄，体重20~30g，0.25%胰酶消化呈对数生长的Hela细胞、Siha细胞，再用无血清的培养液离心洗涤2次，将细胞密度调整为  1x10⁷个细胞/ml，并悬于PBS中备用。用碘伏消毒裸鼠接种部位，6号注射针头(lml注射器)吸取0.2ml的Hela细胞或Siha细胞悬液(约含有2×10⁶个细胞)，将细胞接种于裸鼠的颈背部皮下。①接种Hela细胞的裸鼠成瘤后(直径约0.2cm)，随机分为3组，每组10只。A组瘤内注射无菌PBS，0.l ml/次; B组瘤内注射紫堇定碱0.25 mg/次(浓度2.5 mg/ml，0.l ml/次); C组瘤内注射紫堇定碱0.5 mg/次 浓度0.5 mg/ml，0.l ml/次。1周3次，持续3周。②接种siha细胞裸鼠成瘤后(直径约0.2 cm)，随机分为3组，每组10只。各组处置方法同Hela细胞。定期观察小鼠精神、活动力、反应、饮食及排便等情况，以及肿瘤体积和生长速度。分组处理3周后，行颈椎脱臼处死。

实验结果显示，治疗组裸鼠饮水、进食基本正常，无腹泻、消瘦、活动迟缓等不良反应，对照组裸鼠部分出现食欲减退、消瘦、懒动、反应能力下降等情况。各组瘤内注射部位皮肤无红肿、破溃。肿瘤组织从裸鼠上剥离时进行肉眼观察，呈结节状，各组大小不一，灰白色，质地偏硬，不易和周围组织分离。治疗期间，紫堇定碱治疗组与对照组比较，肿瘤生长速度明显减慢，大部分治疗组肿瘤在用药中期不再长大，有的变小，部分肿瘤基本消退。治疗2l 天后，测量发现Hela细胞和Silia细胞治疗组肿瘤的体积和重量较对照组明显缩小和降低，差异有统计学意义。以上动物实例说明：紫堇定碱能抑制宫颈癌细胞的增殖，具有抗肿瘤作用。

实例3

异波尔定碱抑制荷瘤裸鼠宫颈癌的作用

药物名称：异波尔定碱

化学名称：

(6aS)-2,10-Dimethoxy-5,6,6a,7-tetrahydro-4H-dibenzo[de,g]quinoline-1,9-diol

药物结构：

剂型：注射剂、粉针剂

给药途径：静注、静滴

实验动物：雌性Balb/C小鼠

探讨异波尔定碱对人宫颈癌Hela细胞和Siha细胞裸小鼠肿瘤生长是否存在抑制作用，能否诱导细胞凋亡，从而评价异波尔定碱在治疗人宫颈癌方面的应用价值。

实验方法：雌性BALB/C裸小鼠，6~8周龄，体重20~30g，0.25%胰酶消化呈对数生长的Hela细胞、Siha细胞，再用无血清的培养液离心洗涤2次，将细胞密度调整为  1x10⁷个细胞/ml，并悬于PBS中备用。用碘伏消毒裸鼠接种部位，6号注射针头(l ml注射器)吸取0.2ml的Hela细胞或Siha细胞悬液(约含有2×10⁶个细胞)，将细胞接种于裸鼠的颈背部皮下。①接种Hela细胞的裸鼠成瘤后(直径约0.2 cm)，随机分为3组，每组10只。A组瘤内注射无菌PBS，0.l ml/次; B组瘤内注射异波尔定碱0.25 mg/次(浓度2.5 mg/ml，0.l ml/次); C组瘤内注射异波尔定碱0.5 mg/次 浓度0.5 mg/ml, 0.l ml/次。1周3次，持续3周。②接种siha细胞裸鼠成瘤后(直径约0.2 cm)，随机分为3组，每组10只。各组处置方法同Hela细胞。定期观察小鼠精神、活动力、反应、饮食及排便等情况，以及肿瘤体积和生长速度。分组处理3周后，行颈椎脱臼处死。

实验结果显示，治疗组裸鼠饮水、进食基本正常，无腹泻、消瘦、活动迟缓等不良反应，对照组裸鼠部分出现食欲减退、消瘦、懒动、反应能力下降等情况。各组瘤内注射部位皮肤无红肿、破溃。肿瘤组织从裸鼠上剥离时进行肉眼观察，呈结节状，各组大小不一，灰白色，质地偏硬，不易和周围组织分离。治疗期间，异波尔定碱治疗组与对照组比较，肿瘤生长速度明显减慢，大部分治疗组肿瘤在用药中期不再长大，有的变小，部分肿瘤基本消退。治疗2l 天后，测量发现Hela细胞和Silia细胞治疗组肿瘤的体积和重量较对照组明显缩小和降低，差异有统计学意义。以上动物实例说明：异波尔定碱能通过抑制宫颈癌细胞的增殖。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。