一种红王子锦带花药诱导花粉植株培养基

摘要

一种红王子锦带花药诱导花粉植株培养基，它涉及植物组织培养技术领域，是一种红王子锦带花药愈伤组织诱导的专用培养基，它解决了红王子锦带获得纯系育种材料的问题，通过花药培养获得红王子锦带纯系，从而加速优良绿化树种红王子锦带育种进程。一种红王子锦带花药诱导花粉植株培养基由MS培养基、激素和碳源组成。本发明采用红王子花药作为外植体，采用光照培养和暗培养相结合的方法交替培养，进行花药愈伤组织的诱导，并获得花粉植株。本发明培养基愈伤组织增殖明显，易形成花粉植株，从而加快红王子锦带育种速度，缩短培育周期。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，是一种红王子锦带花药诱导花粉植株 的专用培养基。

背景技术

我国北方的苗木市场，植物种类和色彩与南方相比较为单调，适合东北栽 种的花灌木品种很少，为了弥补这一缺憾，园林工作者近年来从美国引进红王 子锦带，以此来丰富我国北方园林绿化品种，提高城市绿化的色彩水平和档次。 红王子锦带(Weigela florida cv.‘Red-prince’)为忍冬科锦带花属，落叶灌木， 系锦带花的一个变种，株高1.5-2.0m，冠幅1.5m，叶椭圆形至卵状长椭圆形， 花冠胭脂红色，花期长，其性喜光，耐荫，耐寒，对土壤要求不严，适应性和 抗逆性强，园林中可孤植、丛植，对氯化氢气体抗性强，是一种极具潜力的抗 污染园林绿化新品种。

近年来，红王子锦带在东北地区人工栽培规模不断扩大，种苗需求量也随 之不断增长。但引种后由于地理环境的改变，其呈花粉退化趋势，栽培后不易 结籽，目前生产上红王子锦带主要是采用扦插分株方法繁殖种苗，严重阻碍这 一优良品种的推广应用及新品种选育。

关于红王子锦带离体培育的报道很少，就目前的资料来看，仅限于红王子 锦带无菌苗体系的建立、增殖培养、生根培养、培养条件的研究以及无性繁育 等相关报道。目前对红王子锦带的研究都以茎、芽和叶为研究对象，进行再生 植株的研究，但对于红王子锦带花药离体培养及诱导花粉植株尚未见报道。

发明内容

本发明为了解决红王子锦带获得纯系育种材料的问题，从而加速优良绿化 树种红王子锦带育种进程，为红王子锦带育种工作奠定基础。采用红王子花药 作为外植体，进行花药愈伤组织的诱导，通过明、暗交替培养，便可获得花粉 植株，从而增加了红王子锦带新类型，加快育种速度。

本发明从筛选花粉发育时期、基本培养基、调整植物生长调节剂及碳源入 手，合理配比各种激素和碳源，目的是提供一种诱导红王子锦带花粉愈伤组织 的专用培养基，以解决诱导花粉植株。

本发明利用正交试验设计筛选基本培养基、激素及碳源水平，并经过各 种单因子的多次试验，最终确定适宜的培养基与激素种类及用量。实验表明， 本发明培养基愈伤组织增殖明显，易形成花粉植株。

本发明采取以下技术方案实现：

红王子锦带花药诱导花粉植株培养基由MS培养基、激素和碳源组成。

本发明诱导花粉愈伤、诱导花粉植株及诱导花粉植株生根培养基配方如 下：

i诱导花粉愈伤培养基：MS+6-BA1.0+2，4-D0.2，蔗糖2％，PH＝5.8

ii诱导花粉植株培养基：MS+ZT1.0+NAA0.05，蔗糖2％，PH＝5.8

iii诱导花粉植株生根培养基：1/2MS+NAA0.2+IBA0.1，蔗糖2％，PH＝5.8

所述的MS培养基包括大量元素、微量元素、铁盐和有机质。大量元素包 括：NH₄NO₃，KNO₃，，KH₂PO₄，MgSO₄.7H₂O，CaCl₂.2H₂O；微量元素包括： KI，H₃BO₃，MnSO₄.4H₂O，ZnSO₄.7H₂O，Na₂MoO₄.2H₂O，CuSO₄.5H₂O， CoCl₂.6H₂O；铁盐包括：Na₂.EDTA，FeSO₄.7H₂O；有机质包括：肌醇，烟 酸，盐酸硫胺素，盐酸呲哆醇，甘氨酸。

所述的激素包括：6-BA(6-苄基腺嘌呤)，NAA(萘乙酸)，IBA(吲哚丁酸)， ZT(玉米素)和2，4-D(二氯苯氧乙酸)；

所述的碳源为蔗糖。

花药培养具有重要的意义：

一是获得纯系育种材料和进行单倍体育种，以利用杂种优势，缩短育种年 限和提高育种效率；

二是用所获得的纯合二倍体材料进行遗传变异规律研究；使园艺植物育种 有坚实的遗传理论依据，减少育种的盲目性；

三是克服远缘杂种的不育性，获得具有双亲优良特性的可育远缘杂种。

四是利用在远缘杂交F1代的花药培养中出现的混倍体和丰富的染色体变 异材料，进行园艺植物细胞遗传学等基础性研究。

另外，在分子生物技术迅速发展和日趋成熟的今天，花药培养的应用领域 不断扩大，其研究意义日益突出。

本发明提供了一种诱导红王子锦带花粉植株的专用培养基，采用红王子花 药作为外植体，进行花药愈伤组织的诱导，采用光照培养和暗培养相结合的方 法交替培养，获得花粉植株。本发明培养基愈伤组织增殖明显，易形成花粉植 株，从而获得红王子锦带新类型，加快育种速度。

表-1本发明营养元素配方

表-2本发明激素配方

具体实施方式

本发明技术资金来源于黑龙江省科技厅重点科技攻关项目“优良景观树种 高效扩繁技术研究”课题(GB07B303-02)。课题组经过2年的研究，利用红 王子锦带花药作为外植体，进行花药愈伤组织的诱导，通过明、暗交替培养， 从而获得花粉植株。

材料采集与处理：红王子锦带花药采自黑龙江省森林植物园珍贵树种园， 母树为3年生，生长健壮。花蕾采集于6-8月生长季节进行，这时的花粉处于 生长旺盛期，采集时间选在晴朗的天气，上午9-10点进行。花蕾采集从现蕾 到开花期间每隔2d采集一次花蕾，采集后将花蕾放置4℃的冰箱内冷藏处理 48h备用。接种前，通过镜检进行花粉发育时期的鉴定，以确定花粉所处的发 育时期。花粉所处的发育时期，是花药培养成败的关键，单核早期诱导率高， 因此花粉植株诱导采用处在单核早期的花药。

培养条件：培养条件采用光照培养和暗培养相结合的方法。光照培养光源 采用日光灯，培养室内白天温度为24℃-28℃，照明12h-14h，光照强度 15μmol·m-²·s-¹-20μmol·m-²·s-¹。暗培养温度控制在24℃-26℃。

消毒方法：将低温预处理后的花蕾取出，先用洗涤剂作表面清洗，去除表 面尘土，清水冲洗，然后放在超净工作台上用75％乙醇灭菌30s，无菌水冲洗 3-5次后放在滤纸上吸干花蕾表面水分。

接种方法：接种选择单核早期的花药。首先用镊子剥开花蕾，取出花药， 接种到MS+6-BA1.0+2，4-D0.2，蔗糖2％，PH＝5.8诱导培养基上，并将花丝、 空瘪的花药剔除。每瓶接种6-12个。接种后，先放入黑暗条件下培养，待诱 导出愈伤组织后将其转入光照培养，当愈伤组织由淡黄色变成淡绿色后转接到 MS+ZT1.0+NAA0.05，蔗糖2％，PH＝5.8培养基中，诱导花粉植株。

细胞学观察：花粉发育时期的观察。用镊子撕去花冠，取出花药放入醋酸∶ 洋红(3∶1)固定液中，固定2小时，然后取出花药，用蒸馏水冲洗3-4次， 将花药置于洁净的载玻片上，用解剖刀将花药切开，滴上1滴醋酸洋红，并将 花药壁碎片弃去，对花药进行染色1-2分钟，盖上盖片，制作成临时压片，在 酒精灯上轻烤后，在显微镜下观察花粉所处的发育时期，同时拍照。

实验结果表明：基本培养基对诱导花药愈伤组织存在明显的差异，MS培 养基诱导率较高达43.33％；诱导红王子锦带花药愈伤组织的最好时期为单核 早期，诱导率达48％；诱导花药愈伤组织选用2，4-D，但浓度对愈伤组织的 诱导影响较大，高浓度的2，4-D并不利于愈伤组织的诱导；诱导芽分化选择 ZT效果较好，当愈伤组织表面形成绿色光亮的芽点，将其转入含ZT的培养 基中，小芽点逐渐长大，长出嫩茎和小叶，形成无根花粉植株。

将花粉植株转入继代分化培养基上继续增殖培养，经过20d培养，可获得 花粉植株的丛生苗。