添加剂预混料样品中酿酒酵母的快速定性、定量测定方法

摘要

本发明属于饲料科学与饲料添加剂检测技术领域，具体涉及一种添加剂预混料样品中酿酒酵母的快速定性、定量测定方法。本发明利用cDNA的梯度稀释物作为外标准品可以用于区别死活菌，更准确的检测待测样品中的活菌数。本发明可以在不进行酿酒酵母菌纯培养的基础上，简便、快速、准确地定性、定量检测预混料样品中的酿酒酵母，整个过程对预混料样品中酿酒酵母的检测程序简单、检测效率高、准确性好，检测周期短；从而为微生态制剂产业的长远发展提供技术保障。

说明书

技术领域

本发明属于饲料科学与饲料添加剂检测技术领域，具体涉及一种添加剂预 混料样品中酿酒酵母的快速定性、定量测定方法。

背景技术

微生态饲料添加剂因其丰富的营养价值和特殊的益生功效以及绿色环保特 性而成为预混料领域人们关注的热点。目前市场上的微生态饲料添加剂种类繁 多，并且每年以高速度增长。尽管微生态饲料添加剂在畜牧养殖业上的应用日 益广泛，但尚未形成统一的质量标准和完善的管理机制，对其质量的监管和认 证，尤其在定性、定量检测方面缺乏科学、合理、快速的方法，究其原因是基 础研究薄弱，现有检测技术或检测周期长、或不能区分死菌活菌、或成本高， 难以建立标准化检测技术。传统方法中对酿酒酵母菌的定性、定量检测，仍采 用生理生化反应和选择性培养基纯培养分离技术的方法。传统方法易受外界环 境因素和培养性能的影响，检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时耗力。现阶 段急需从生产实际出发，逐步建立起科学有效的、易于推广的饲用菌种快速高 效标准化检测技术，促进微生态饲料添加剂行业的可持续发展。

PCR技术一经出现就被广泛应用于分子生物学和微生物学等领域。实时荧光 定量PCR(Real-time PCR)的出现更是实现了PCR技术从定性到定量的飞跃， 避免了传统PCR定量鉴定中交叉污染的问题。具有特异性强、重复性好、准确、 快速等优点，成为了分子生物学和微生物领域定量检测的重要方法。

发明内容

【要解决的技术问题】

本发明的目的在于提供一种添加剂预混料样品中酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)的快速定性测定方法。

本发明的另一个目的是提供一种添加剂预混料样品中酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)的快速定量测定方法。

本发明采用酿酒种属特异性PCR和实时荧光定量PCR技术，建立简便、快 速、准确的添加剂预混料中酿酒酵母快速分子检测方法，可简化酿酒酵母的检 测程序、提高检测效率。

【技术方案】

本发明是通过下述技术方案实现的：

本发明提供一种添加剂预混料样品中酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)的快速定性测定方法，该方法使用酿酒酵母的DNA为模板，以酿 酒酵母的26s rDNA基因序列的种属特异性引物进行种属特异性PCR反应，扩增 片度长度为134bp，进而快速定性酿酒酵母；所述的种属特异性引物如下：上游 引物DZf5’-CGAGAGACCGATAGCGAACA-3’，下游引物DZr5’- AAGGAGCAGAGGGCACAAA-3’。

进一步，该方法的步骤如下：

A.模板DNA的制备

采用玻璃珠法制备饲料样品模板DNA：

(1)取1g含有酿酒酵母菌的预混料样品于1.5mL离心管中，加入500μLPBS 悬浮样品，2500×g离心3min；

(2)弃上清，加入适量酸洗过的玻璃珠，剧烈震荡2min；

(3)加入400μL TE及等体积的Tris饱和酚，翻转混匀，15000×g离心 5min；

(4)转移水相至一新离心管，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1 的混合物，颠倒混匀，15000×g离心5min；

(5)吸上清至一新离心管，加入1/10体积3mol/L NaAc及2.5倍体积95％ 冰乙醇，-20℃过夜；

(6)4℃15000×g离心10min，弃上清；

(7)加入1mL70％乙醇，15000×g离心5min，弃上清；

(8)37℃放置15min干燥沉淀，沉淀溶于60μL TE中，-20℃保存备用；

B.PCR扩增

反应体系25.0μL：12.5μL 2×PCR-mix、各1μL 10mmol/L上、下游引物、 1μL 50ng/μL DNA模板、二次蒸馏水补足至25.0μL；

PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃30s，60℃45s，72℃40s，进 行35个循环，72℃最终延伸7min，得到的PCR产物，在温度4℃下保存；

取5μLPCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳进行检测；

C.结果及判断

检测时设以目的扩增片度的胶回收产物作为模板为阳性对照，以灭菌水作 为模板为阴性对照；根据在134bp处出现预期特征条带，确定该预混料样品中 含有酿酒酵母，相反地则不合有酿酒酵母。

本发明还提供一种添加剂预混料样品中酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)的快速定量测定方法，该方法以待测样品cDNA和标准品的cDNA 为模板，使用定性测定方法中所述的上游引物和下游引物，以相同的体系同时 进行酿酒酵母26s rDNA D1/D2的基因片段的荧光定量PCR扩增；通过标准曲线 和待测样品的Ct值进行预混料样品中酿酒酵母的快速定量检测。

进一步，该方法的步骤如下：

A.样品总RNA的制备

采用酶法破除酿酒酵母细胞壁，高纯总RNA，快速提取试剂盒提取样品总 RNA：样品0.5-1.0g加入到1.5mL离心管中，加入600μL山梨醇Buffer，加入 50U Lyticase，充分混匀30℃处理30min，1500×g离心10min后，弃上清， 收集沉淀，提取样品RNA，然后用DNase I处理两次，得到纯化的RNA样品，使 用紫外分光光度仪测定浓度，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，然后 将样本保存于-80℃；

B.反转录扩增

(1)在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：

1-5μg总RNA、2μL Oligo(dT)15、2μLdNTP(2.5mM each)、补RNase-free ddH2O定容至14.5μL；

(2)70℃加热5min后迅速在冰上冷却2min，快速离心反应液后加入以下 组分：4μL 5×First-Strand Buffer(含有DTT)；0.5μL RNasin；

(3)加入1μL(200U)TIANScript M-MLV，轻轻用移液器混匀；

(4)42℃温浴50min；

(5)95℃加热5min，终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存；

(6)用RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50μL。-20℃保存备用；

C.荧光定量PCR

反应体系25.0μL：12.5μL 2×SuperReal PreMix(含SYBR Green I)、各 0.75μL 10μmol/L上下游引物DZf和DZr，2.0μL cDNA模板、0.5μL 50×ROX Reference Dye、补RNase-free ddH2O至25μL体系；

荧光定量PCR反应参数：95℃预变性15min；95℃变性10s，60℃退火32s， 40个循环；4℃保存；每个样品重复3次；

D.外标准品的制备和标准曲线的绘制

外标准品的制备：利用分光光度计将过夜培养的酿酒酵母菌发酵液稀释至 1OD，按照上述提取总RNA步骤并通过反转录扩增获得cDNA，进行10倍系列稀 释，梯度稀释至107-1个酵母cDNA/μL的浓度，以此作为外标准品进行荧光定 量PCR反应；

标准曲线的绘制：以不同浓度的模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中 到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到的酿酒酵母菌的标准曲线，作 为待测样品定量测定的参照标准；

E.结果及判断

以待测样品cDNA和标准品的cDNA为模板，用酿酒酵母菌的种特异性引物， 以相同的体系同时进行酿酒酵母菌26s rDNA D1/D2的基因片段的荧光定量PCR 扩增；通过标准曲线和待测样品的Ct值进行饲料样品中酿酒酵母菌的快速定量 检测。

【有益效果】

本发明的有益效果是：

本发明所提供的引物具有特异性强，扩增效率高的特点，可用于快速定性 鉴定酿酒酵母菌。本发明利用cDNA的梯度稀释物作为外标准品可以用于区别死 活菌，更准确的检测待测样品中的活菌数。本发明可以在不进行酿酒酵母菌纯 培养的基础上，简便、快速、准确地定性、定量检测预混料样品中的酿酒酵母 菌，整个过程对预混料样品中酿酒酵母的检测程序简单、检测效率高、准确性 好，检测周期短的优点；从而为微生态制剂产业的长远发展提供技术保障。

附图说明：

图1：经酿酒酵母菌的种属特异性引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结 果。

图2：以DNA为模板的实时荧光定量检测酿酒酵母的标准曲线。

图3：以cDNA为模板的实时荧光定量检测酿酒酵母菌的标准曲线。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：预混料样品中酿酒酵母的快速定性检测：

该实施例使用目的扩增片段的胶回收产物作为阳性对照；无菌水作阴性对 照；另外使用从市场收集的两份饲料样品1#和2#、粪肠球菌、毕赤酵母菌作为 样品进行。

A.模板DNA的制备

采用玻璃珠法制备饲料样品模板DNA，具体步骤如下：

(1)取1g含有酿酒酵母菌的饲料样品于1.5mL离心管中，加入500μLPBS 悬浮样品，2500×g离心3min；

(2)弃上清，加入适量酸洗过的玻璃珠，剧烈震荡2min；

(3)加入400μL TE及等体积的Tris饱和酚，翻转混匀，15000×g离心 5min；

(4)转移水相至一新离心管，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，颠 倒混匀，15000×g离心5min；

(5)吸上清至一新离心管，加入1/10体积3mol/L NaAc及2.5倍体积95％ 冰乙醇，-20℃过夜；

(6)4℃15000×g离心10min，弃上清；

(7)加入1mL70％乙醇，15000×g离心5min，弃上清；

(8)37℃放置15min干燥沉淀，沉淀溶于60μL TE中，-20℃保存备用。

B.PCR扩增

反应体系25.0μL：12.5μL 2×PCR-mix、各1μL 10mmol/L上下游引物、1μL 50ng/μL DNA模板、二次蒸馏水补足至25.0μL；

PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃30s，60℃45s，72℃40s，进 行35个循环，72℃最终延伸7min，得到的PCR产物，在温度4℃下保存；

取5μLPCR产物使用1％琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压电泳20-30min，EB染 色，紫外拍照。

C.目的片段的胶回收纯化

采用胶回收试剂盒对目的片段进行切胶、回收、纯化，获得纯化的目的片 段。

D.结果及判断

经酿酒酵母菌的种属特异性引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果见图 1。泳道1以目的片段的纯化PCR产物作为阳性对照，泳道2以灭菌水作为阴性 对照。一般认为阳性特征在134bp处出现预期扩增条带，说明此样本中含有酿 酒酵母菌；阴性对照无特征条带。泳道3-4为从市场中收集到的饲料样品，结 果为阳性性说明这2份饲料样品中含有活的酿酒酵母菌。泳道5-6为酿酒酵母 菌外的毕赤酵母和粪肠球菌，结果为阴性，说明引物特异性好，与预期结果一 致。

实施例2：预混料样品中酿酒酵母的定量测定

对实施例1中提到的不同样品进行酿酒酵母菌的定量测定。其测定步骤如 下：

A.样品总DNA的制备

采用酶法破除酵母细胞壁高纯总DNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取样 品总DNA：样品0.5-1.0g加入到1.5mL离心管中，加入600μL山梨醇Buffer， 加入50U Lyticase，充分混匀30℃处理30min，1500×g离心10min后，弃上 清，收集沉淀，按高纯总DNA快速提取试剂盒说明书提取样品DNA，使用紫外分 光光度仪测定浓度，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，然后将样本保 存于-20℃。

B.荧光定量PCR

反应体系25.0μL：12.5μL 2×SuperReal PreMix(含SYBR Green I)、各 0.75μL 10μmol/L上下游引物DZf和DZr，2.0μL DNA模板、0.5μL 50×ROX Reference Dye、补RNase-free ddH2O至25μL体系。

荧光定量PCR反应参数：95℃预变性15min；95℃变性10s，60℃退火32s， 40个循环；在温度4℃保存；每个样品重复3次。

D.外标准品的制备和标准曲线的绘制

外标准品的制备：利用分光光度计将过夜培养的酿酒酵母菌发酵液稀释至 1OD(约10⁷cells)，按照上述步骤提取总DNA，进行10倍系列稀释，梯度稀释 至10⁷-1个酵母DNA/μL的浓度，以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应。以 不同浓度的模板为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct) 为纵坐标得到的酿酒酵母菌的标准曲线，见附图2。

E.结果及判断

由图2可见，Ct值和不同梯度稀释的模板浓度呈较好的线性关系，以不同 浓度的模板为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制出的荧光定量PCR标准曲线方程： Y＝-1.802X+26.115(Y代表Ct值，X代表模板初始DNA浓度)，模板初始DNA的 浓度与Ct值之间线性相关系数为0.994，斜率为-1.802，所建立的标准曲线符 合Real-Time PCR定量的要求。

以待测样品的DNA和标准品DNA为模板，用实施例1描述的酿酒酵母菌的 种特异性引物，以相同的体系同时进行酿酒酵母菌26s rDNA D1/D2的基因片段 荧光定量PCR扩增。通过标准曲线和采用ABI公司的7500实时荧光定量PCR 仪的计算机软件software v2.0.1进行饲料样品中酿酒酵母菌的快速定量检测。 这些样品的测定结果与分析误差结果一并列于下表1中。

表1样品的Real-time测定结果

实施例3：饲料样品中酿酒酵母的定量测定

对实施例1中提到的不同样品进行酿酒酵母菌的定量测定。其测定步骤如 下：

A.样品总RNA的制备

采用酶法破除酵母细胞壁高纯总RNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取样 品总RNA：样品0.5-1.0g加入到1.5mL离心管中，加入600μL山梨醇Buffer， 加入50U Lyticase，充分混匀30℃处理30min，1500×g离心10min后，弃上 清，收集沉淀，按高纯总RNA快速提取试剂盒说明书提取样品RNA，然后用DNase I处理两次，确保完全消除RNA中的DNA污染，得到纯化的RNA样品，使用紫 外分光光度仪测定浓度，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，然后将样 本保存于-80℃；

B.反转录扩增

(1)在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：

1-5μg总RNA、2μL Oligo(dT)15、2μLdNTP(2.5mM each)、补RNase-free ddH2O定容至14.5μL；

(2)70℃加热5min后迅速在冰上冷却2min。简短离心书记反应液后加入 以下组分：4μL5×First-Strand Buffer(含有DTT)；0.5μL RNasin；

(3)加入1μL(200U)TIANScript M-MLV，轻轻用移液器混匀；

(4)42℃温浴50min；

(5)95℃加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存；

(6)用RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50μL。-20℃保存备用。

C.荧光定量PCR

反应体系25.0μL：12.5μL 2×SuperReal PreMix(含SYBR Green I)、各 0.75μL 10μmol/L上下游引物DZf和DZr，2.0μL cDNA模板、0.5μL 50×ROX Reference Dye、补RNase-free ddH2O至25μL体系。

荧光定量PCR反应参数：95℃预变性15min；95℃变性10s，60℃退火32s， 40个循环；在温度4℃保存；每个样品重复3次。

D.外标准品的制备和标准曲线的绘制

外标准品的制备：利用分光光度计将过夜培养的酿酒酵母菌发酵液稀释至 1OD(约10⁷cells)，按照上述步骤提取总RNA并通过反转录扩增获得cDNA，进 行10倍系列稀释，梯度稀释10⁷-1个酵母cDNA/μL的浓度，以此作为外标准 品进行荧光定量PCR反应。以不同浓度的模板为横坐标，以PCR反应过程中到 达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到的酿酒酵母菌的标准曲线，见附 图3。

E.结果及判断

由图3可见，Ct值和不同梯度稀释的模板浓度呈较好的线性关系，以不同 浓度的模板为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制出的荧光定量PCR标准曲线方程： Y＝-3.661X+29.837(Y代表Ct值，X代表模板初始cDNA浓度)，模板初始cDNA 的浓度与Ct值之间线性相关系数为0.993，斜率为-3.661，所建立的标准曲线 符合Real-Time PCR定量的要求。

以待测样品的cDNA和标准cDNA为模板，用实施例1描述的酿酒酵母菌 的种特异性引物，以相同的体系同时进行酿酒酵母菌26s rDNA D1/D2的基因片 段荧光定量PCR扩增。通过标准曲线和采用ABI公司的7500实时荧光定量PCR 仪的计算机软件software v2.0.1进行饲料样品中酿酒酵母的快速定量检测。 这些样品的测定结果与分析误差结果一并列于下表2中。

表2样品的Real-time测定结果

实施例4：两次荧光定量计数结果与平板计数结果相关性实验

对实施例1中提到的不同预混料样品进行梯度稀释平板计数。其步骤如下：

A.梯度稀释涂平板

(1)以无菌操作将经过充分摇匀的检样25g移入含有225ml灭菌生理盐水 的灭菌三角瓶内做成1∶10的均匀稀释液，混合均匀；

(2)取1∶10稀释液10.0ml加到含有90.0ml无菌生理盐水的稀释瓶中， 充分摇匀制成1∶100的稀释液；

(3)用无菌吸管吸取1∶10的稀释液1.0ml加到含有9.0ml无菌生理盐水 带玻璃珠的试管中，进行10倍梯度稀释，并于微型振荡器上混合3min。每个稀 释度换用一支1.0ml灭菌吸管；

(4)选择三个合适连续稀释度，分别在做10倍稀释的同时，各取0.1ml 分别加到计数培养基平皿，均匀涂布，各个稀释度作两个平皿，最好同时作2～ 3种培养基(麦芽汁琼脂培养基、豆芽汁葡萄糖琼脂培养基，分别按本标准附录 B.2、B.3规定执行)，同时作灭菌生理盐水空白对照。以上操作全过程需在20min 内完成；

(5)待琼脂凝固后将平板倒置于28℃的恒温箱中培养，培养2～3天后观 察菌落形态。酿酒酵母在豆芽汁琼脂培养基上生长缓慢，在麦芽汁琼脂培养基 上生长良好，适宜温度25～30℃，菌落为乳白色，圆形，有光泽、边缘整齐、 粘稠、易挑起。显微镜下观察，菌体细胞呈椭圆形，5.4×(3.86～7.85)μm， 两端出芽。

B.菌落计数

选取具有30～200个典型或可疑酿酒酵母菌苔在平板上进行菌落计数，并 计算同一稀释度下的两个平板的平均菌落数。按比例计算出该平皿内的酿酒酵 母菌落数，然后乘其稀释倍数再乘以10，即为每克样品所含酿酒酵母数。

C.结果及判断

对两份饲料样品1#和2#以及酿酒酵母的过夜发酵纯培养物的平板计数结果 与实施例2和实施例3中待测样品的荧光定量结果比较研究，实施例3的定量 结果与平板计数结果呈较好的线性关系，结果列于下表3。三种样品的相关系数 分别为0.983、0.991和0.987。而实施例2中两个待测样品定量结果与样品的 实际平板计数结果相差了3个数量级，其原因可能为饲料样品中的死菌通过DNA 做模板的荧光定量也被记数出来，因此以DNA做模板的荧光定量PCR计数不能 很好的区分死活菌，而以梯度稀释的cDNA为外标准品制作的标准曲线以及待测 样品的cDNA为模板，计数待测样品准确可信，能够正确的区分死活菌，且全程 只用5个小时左右，相比较传统的活菌计数方法大大缩短了检测时间。本发明 的以cDNA为模板的荧光定量PCR计数方法可以用来代替传统的菌落计数，并具 有缩短检测时间且计数准确。

表3酿酒酵母样品的平板计数与荧光定量计数检测结果