发作性运动诱发性运动障碍致病基因

摘要

本发明涉及一种发作性运动诱发性运动障碍致病基因-PRRT2及其相关的突变基因。本发明还涉及含有所述发作性运动诱发性运动障碍相关基因的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、所述发作性运动诱发性运动障碍相关基因的编码蛋白。本发明还提供了一种检测来源于人体的生物样本是否存在所述基因的突变的试剂盒，该试剂盒方法能够精确地诊断遗传性PKD。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种人体变异的基因，具体地说是一种发作性运动诱发性运动障碍 致病基因-PRRT2。本发明还涉及含有所述发作性运动诱发性运动障碍相关基因的重 组载体、含有该重组载体的重组细胞、所述发作性运动诱发性运动障碍相关基因的编 码蛋白。

背景技术

发作性运动诱发性运动障碍(paroxysmal kinesigenic dyskinesia，PKD)又称为发 作性运动诱发的舞蹈手足徐动症(paroxysmal kinesigenic choreoathetosis，PKC)。 PKD最具特征的临床表现为静止状态下突然运动(突然运动指的是毫无准备的动作、平 稳运动中突然增加负荷、改变方向等)诱发发作，另外突然的惊吓、过度换气、紧张、 焦虑、疲劳、月经、失眠、气候异常等非特异性因素也可诱发。PKD可分为继发性和原 发性，继发性PKD最常见于多发性硬化、脑血管病、代谢紊乱(如高血糖、低血糖、高 钙血症)、脑外伤等；原发性分为散发和遗传，其中遗传性PKD呈常染色体显性遗传，可 外显不完全。

PKD一般在儿童期或是青春期早期起病，发病年龄多在6～16岁，平均发病年龄± 12岁。PKD以男性发病多见，男女患者之比为3～4∶1。2004年，Bruno提出了PKD的诊 断标准：发作由运动触发；发作持续时间短，不超过1分钟；发作时意识清楚，无疼痛 感觉；神经系统检查正常，排除其他器质性疾病；抗癫痫药物治疗有效；无家族史者， 多在1～20岁发病，若有家族史，发病年龄范围可放宽。

现阶段关于PKD的发病机制尚不清楚，主要有基底节病变、癫痫学说和离子通道障 碍这三种学说，近几年学者们不断从神经影像学，分子生物学，脑电图等方面收集资 料，寻找PKD的发病机制。几十年来，国内外许多研究人员都对PKD家系进行研究，希 望克隆出其致病基因，但都未成功。本发明首次发现并克隆了PKD的致病基因PRRT2， 对PKD的诊断和治疗、发病机制提供了分子及理论基础。

PRRT家族包括PRRT1、PRRT2、PRRT3、PRRT4，其中PRRT2(proline-rich  transmembrane protein 2)包含4个外显子，共3794bp，编码一个由340个氨基酸组成 的跨膜蛋白/膜蛋白，UCSC上的序列编号为NM_145239。PRRT2主要在大脑表达，尤其是 基底节区，其功能不详，编码的蛋白与SNAP25(synaptosomal-associated protein) 是互做蛋白。SNAP25蛋白是一种突触相关膜蛋白，参与轴突发生、钙离子依赖性神经递 质胞吐作用、神经递质(乙酰胆碱、GABA、谷氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素、胰岛素) 等的分泌和循环过程、突触发生的调节，且SNAP25的过表达可抑制钾离子通道蛋白的 活性。

PKD治疗主要依靠卡马西平、苯巴比妥、苯妥英钠、丙戊酸、托吡酯、拉莫三嗪 等抗癫痫药物控制发作。进行早期诊断，将使患者有机会获得及时、有效、合理的 治疗；也只有在实现对PKD患者早期诊断的基础上，相关药物的开发才真正能体现 出意义。鉴于PKD的发病年龄较早，因此PKD可能的疾病相关基因突变位点的检测， 将对潜在PKD患者的超早期诊断成为可能。

发明内容

本发明的目的之一在于提供与PKD相关的致病基因。

本发明再一目的是提供含有所述PKD致病基因PRRT2及其突变型的重组载体、含 有上述重组载体的重组细胞、以及所述PKD相关基因的编码蛋白。

发明人通过候选基因筛查的方法在一个PKD显性遗传家系中发现PRRT2基因的一种 新的突变——487位碱基C突变为T，使得PRRT2基因编码的氨基酸序列第163位赖氨 酸突变为终止密码子(c.487C＞T(p.Q163X))，具体序列如SEQ ID NO：2所示。通过对 家系所有成员进行PRRT2基因突变检测，发现A家系中的其他患者均有c.487C＞T (p.Q163X)突变，而家系中的正常人均未发现该突变，说明PRRT2基因突变在该家系中 与疾病表型共分离。发明人又对另外四个PKD家系，进行PRRT2基因的突变检测，其中 B、D、E三个家系中均发现PRRT2基因的另一种新的突变——649位C插入突变，使得 PRRT2基因编码的氨基酸序列自217位开始框移突变，翻译7个氨基酸后终止，最终形成 一段由223个氨基酸组成的肽链c.649_650InsC(p.P217fsX7)，具体序列如SEQ ID NO：3 所示。在C家系中发现PRRT2基因上存在796位碱基C突变为T，使得PRRT2基因编码 的氨基酸序列第266位精氨酸突变为色氨酸(c.796C＞T(R266W))，具体序列如SEQ ID  NO：4所示。通过对以上家系其他成员进行PRRT2以上基因突变位点检测，发现PRRT2 基因突变在这三个家系中均与疾病表型共分离。随后的500名正常人的PRRT2基因突变 检测中也未发现此突变，排除了单个核苷酸多态性(single nucleotide  polymorphism，SNP)的可能性，从而确定PRRT2基因是PKD的致病基因。

本发明提供了一种如SEQ ID NO：2所示的人类PRRT2基因突变序列，其特征在于， 所述PRRT2基因第487位碱基突变为T。正常人的PRRT2基因序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供了一种如SEQ ID NO：3所示的人类PRRT2基因突变序列，其特征在于， 所述PRRT2基因第649位C插入突变。正常人的PRRT2基因序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供了一种如SEQ ID NO：4所示的人类PRRT2基因突变序列，其特征在于， 所述PRRT2基因第796位碱基突变为T。正常人的PRRT2基因序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种PRRT2基因编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)。

本发明进一步提供了如SEQ ID NO.2所示基因突变序列对应的氨基酸序列(SEQ ID  NO.6)，其特征是PRRT2基因编码的氨基酸序列第163位赖氨酸突变为终止密码子；如 SEQ ID NO.3所示基因突变序列对应的氨基酸序列(SEQ ID NO.7)，其特征是PRRT2基 因编码的氨基酸序列自217位开始框移突变，翻译7个氨基酸后终止，最终形成一段由 223个氨基酸组成的肽链；以及如SEQ ID NO.4所示基因突变序列对应的氨基酸序列(SEQ  ID NO.8)，其特征是PRRT2基因编码的氨基酸序列第266位精氨酸突变为色氨酸。

本发明还提供了一种检测来源于人体的生物样本是否存在所述基因的突变的试剂 盒，包括：聚合酶链反应试剂，如dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液；聚合 酶链反应扩增体系中所适应的引物对，序列如SEQ ID NO：9-12所示。本领域技术人员 已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述的引物可以依据已知的核苷酸序列设计，通 常为15-30个碱基，GC含量为45-50％左右，在适当的温度下与末端特异性结合，其可 利用专门的计算机程序设计，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的 酶。

本发明还提供了一种根据上述试剂盒检测来源于人体的生物样本是否存在所述基 因的突变的方法，其包括

步骤：

(1)从所述样本中提取和纯化基因材料；

(2)对所述基因材料进行聚合酶链扩增反应，获取产物；

(3)对所述产物进行核苷酸序列测定，以确定所述生物样本中是否含有PRRT2 基因的突变。

优选地，所述生物样本为体液，所述体液包括但不限于：血液、血清、羊水、淋巴 液等。

优选地，所述体液为血液。

优选地，在所述聚合酶链扩增反应使用的引物对为：SEQ ID NO：9-12；本领域技 术人员还可以根据聚合酶链扩增反应的要求，设计更多种的引物，以扩增出包含本发明 所述变异的核苷酸序列。

根据本发明提供的PRRT2基因序列变异的位点，应用本发明提供的检测来源于人体 的生物样本中是否存在所述基因的突变的方法，对五个PKD家系中的个体进行了检测。 结果显示一个家系所有的PKD患者都具有SEQ ID NO.2所示突变，三个家系中所有的PKD 患者都具有SEQ ID NO.3所示突变，还有一个家系中所有的PKD患者都具有SEQ ID NO.4 所示突变，而各家系内正常人个体和500名正常对照都没有上述突变。证明本发明提供 的方法能够精确地诊断遗传性PKD。

附图说明

图1为突变序列SEQ ID NO.2、3、4的示意图，其中图示从上至下依次为SEQ ID NO.2、 3、4。

图2为A、B、C、D、E五个家系的家系图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行更为详细的描述，但是以下描述仅用于对本发明进行 解释性说明，并不对本发明的保护范围进行任何的限制，本发明的保护范围仅以权利要 求书限定的范围为准。

实施例1：PRRT2基因c.487C＞T(p.Q163X)突变的检测方法

(1)标本采集与处理。发明人对家系A中15名正常人(男8名、女7名)、7名 PKD患者(男4名，女3名)进行详细的病史、家族史的调查及全面的体格检查和 相关辅助检查。在签署知情同意书以后，每人取肘静脉血10ml(枸橼酸钠抗凝)，4 ℃保存，两周内依照《分子克隆》第二版从血液中提取DNA的方法提取DNA。

(2)对样本DNA目标片段进行PCR体外扩增。根据PKD相关基因序列SED ID NO.13 设计如下引物；

正向引物；5′CTAgCAggggTACCAgACCA  3′(SED ID NO.9)

反向引物；5′TCATTCgATCCTCCTCAACC  3′(SED ID NO.10)

反应体系和反应条件如下表1、2所示：

表1 PCR反应体系(TaKaRa Taq^TM Hot Start Version)

  试剂名称   试剂量(ul)   ddH2O   6.55   10Xbuffer   1.0   2mM dNTP   0.8   引物   0.3   Taq酶   0.05   DNA模板   1.0   总体积   10

表2 PCR反应程序

实例2：突变分析

(1)对这15名正常人、7名PKD患者的PCR扩增产物进行DNA测序。

(2)测序结果分析

应用SEQUENCE ANALYSIS软件对测序结果进行分析。将发现的突变序列与基因组 序列进行比较，对测序结果进行对比分析。

测序分析显示：

1)7名PKD患者的PCR扩增产物上的376位碱基C突变为T(SED ID NO.13)。

2)15名正常人PRRT2基因上均未发现上述突变及其他有意义的突变(SED ID  NO.14)。

实例3 PRRT2基因c.649_650InsC(p.P217fsX7)突变的检测方法

家系B内有6名正常人(男4名，女2名)、5名PKD患者(男3名，女2名)。

基本方法和步骤参见实施例1，在具体方法中针对该突变位点及邻近序列进行 PCR扩增，使用的PCR引物序列为：

正向引物；5′gCTggTgATggggAAgAg  3′(SED ID NO.11)

反向引物；5′CTCCAgAggCTCTATTgCAg  3′(SED ID NO.12)

实例4 突变分析

对这6名正常人、5名PKD患者的PCR扩增产物进行DNA测序。

测序结果分析

应用SEQUENCE ANALYSIS软件对测序结果进行分析。将发现的突变序列与基因组 序列进行比较，对测序结果进行对比分析。

测序分析显示：

1)5名PKD患者的PCR扩增产物上有306位碱基C插入突变(SED ID NO.15)。

2)6名正常人PRRT2基因上均未发现上述突变及其他有意义的突变(SED ID  NO.16)。

实施例5 PRRT2基因c.796C＞T(R266W)突变的检测方法

家系C内有1名正常人(男)、2名PKD患者(男1名，女1名)。

基本方法和步骤参见实施例1，在具体方法中针对该突变位点及邻近序列进行 PCR扩增，使用的PCR引物序列为：

正向引物；5′gCTggTgATggggAAgAg  3′(SED ID NO.11)

反向引物；5′CTCCAgAggCTCTATTgCAg  3′(SED ID NO.12)

实例6 突变分析

对这1名正常人、2名PKD患者的PCR扩增产物进行DNA测序。

测序结果分析

应用SEQUENCE ANALYSIS软件对测序结果进行分析。将发现的突变序列与基因组 序列进行比较，对测序结果进行对比分析。

测序分析显示：

1)2名PKD患者的PCR扩增产物上有452位碱基C突变为T(SED ID NO.17)。

2)1名正常人PRRT2基因上均未发现上述突变及其他有意义的突变(SED ID  NO.16)。

此外，本发明人还进一步对这三个家系外的500个正常人的PRRT2基因进行了 突变筛查，未发现上述的三种突变，排除了单个核苷酸多态性的可能性，确定上述 的三种突变是这些常染色体显性遗传PKD家系的致病基因突变。

虽然本发明是通过优选的具体实施例进行说明，但是对本领域技术人员来说，可用 根据本发明进行各种改变，而不脱离本发明的目的和精神，所有这些修改都包括在所附 权利要求的范围内。