一种啤酒花矮化类病毒的检测方法

摘要

本发明公开了一种啤酒花矮化类病毒的检测方法，该方法是将纳米磁珠进行分子标记、封闭后，加入到待测样本中，纳米磁珠特异性的结合类病毒核酸，形成纳米磁珠-类病毒核酸复合物，外加磁场将复合物从溶液中分离，将复合物重新分散到水溶液中并加热，类病毒核酸就释放到水溶液中，从而实现啤酒花矮化类病毒核酸的快速提取。然后通过实时荧光RT-PCR方法对提取产物进行检测。本发明所述方法实用性强、快速、特异、灵敏、能有效的防止RNA核酸的降解。

说明书

技术领域

本发明属于检验检疫领域，具体涉及一种基于纳米磁珠分子标记技术进行啤酒花矮化类病毒检测的方法。

背景技术

啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid, HSVd)属于马铃薯纺锤块茎类病毒科，最早在日本矮化的啤酒花上发现，后经研究发现其有广泛的自然寄主，包括啤酒花、桃、杏、李、石榴、葡萄、黄瓜等。该类病毒在某些寄主, 如葡萄和杏上呈潜伏侵染，而对某些寄主却会造成严重病害，如啤酒花矮化、李和桃果实斑驳、柑橘矮化等。

啤酒花矮化类病毒是一类高度碱基配对的具有自我复制能力的单链闭合环状小分子致病性RNA，大小为299nt，不编码蛋白，不具有蛋白外壳，是目前发现的最小病原物。由于类病毒没有外壳蛋白，不能利用ELISA等血清学方法进行检测，目前所采用的主要技术检测方法是生物学鉴定（草本植物和木本植物）、分子生物学鉴定（聚丙烯酥胺凝胶电泳、核酸杂交、RT-PCR、单链构象多态性分析）。生物学鉴定是目前初步鉴定植物类病毒的常用方法，但是该方法在实际应用过程中存在检测周期长，有的类病毒难以接种，容易出现假阳性判读结果，不能满足目前口岸快速检测的要求。聚丙烯酥胺凝胶电泳是目前植物类病毒检测常规方法，在实际检测过程中存在检测步骤繁琐，所用检测有毒有害化学试剂种类繁多，不利于该技术的广泛应用。RT-PCR技术是应用最广泛的分子生物学新技术之一，利用RT-PCR技术检测相比其它检测方法具有灵敏度高的优点。目前在RT-PCR技术基础上不断衍生出许多新的技术，例如实时荧光RT-PCR技术，基因芯片技术等，使其应用范围不断扩大，特异性和敏感性也不断提高，但是这些分子生物学技术存在RNA抽提繁琐并且容易降解，PCR反应容易受寄主中多酚、多糖物质的干扰，限制了植物病原的快速、简便、高效检测。

纳米生物技术是运用纳米技术的理论与方法，在传统生物学和现代分子生物技术的基础上，开展生物医学研究。在分子、细胞和个体水平上为疾病的机理研究、检测、诊断和治疗等方面提供新的材料、技术和方法。待测样品的分离和纯化是检测、诊断的前提。纳米磁珠在生物样品的分离分析中有着重要应用价值：（1）高效富集：纳米磁珠比表面积大，显著增加反应界面能够高效富集生物样品；（2）可操纵性：纳米磁珠具有超顺磁效应，外加磁场能够快速对其进行移动和分离;（3）标记性质：生物分子标记方法简单、可靠；（4）人体安全：对人体无毒、可生物代谢、可生物降解、生物相容性好。总之，磁性生物分离兼具磁性载体的超顺磁性和亲和配基的生物特异性特点，集磁性分离的快速简便和亲和分离的高选择性双重优势于一体，在核酸的分离纯化，痕量RNA、DNA分子 的富集，蛋白的纯化，病毒、细胞的分离等方面有应用。纳米磁珠技术与植物检疫检测相结合，在植物病原微量检测方面具有实用性。

关于纳米磁珠（magnetic nano particles，MNP）的合成，国外在80年代末开始超顺磁性氧化铁超微颗粒的研究，基于纳米磁珠的生物分离材料国外已经有市场化产品。最近纳米磁珠在动物病毒检测得到应用，抗体标记的纳米磁珠从液相中捕获目标病毒，可以高灵敏度地检测动物病毒。但是目前还没有关于利用纳米磁珠分子标记技术进行啤酒花矮化类病毒快速检测的方法的报道。

本发明是在纳米磁珠表面固定一段寡核苷酸，特异性的与啤酒花矮化类病毒核酸结合，从而实现啤酒花矮化类病毒核酸的快速提取。这种方法步骤少，时间短，能有效的防止RNA核酸的降解，且提取的RNA中干扰物质少，有利于下一步的反应，实现了啤酒花矮化类病毒的快速、简便、高效检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种啤酒花矮化类病毒的快速检测方法。该方法是在纳米磁珠表面偶联一段寡核苷酸，特异性的与啤酒花矮化类病毒核酸结合，从而实现啤酒花矮化类病毒核酸的快速提取。这种方法步骤少，时间短，能有效的防止RNA核酸的降解，且提取的RNA中干扰物质少，有利于下一步的反应，实现了啤酒花矮化类病毒的快速、简便、高效检测。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种啤酒花矮化类病毒的检测方法，该方法包括以下步骤：

（1）将纳米磁珠进行分子标记；

所述将纳米磁珠进行分子标记是将一段寡核苷酸序列偶联到纳米磁珠表面，该寡核苷酸序列是根据啤酒花矮化类病毒RNA核酸保守序列设计的一段互补核苷酸序列，即：

1）5'(NH₂)- TTTTTTCTTT GCTTGCCTTA TGCGGCAACT CGAGAATTCC CCAG -3'（SED ID No: 1），其中，5’端用氨基修饰；

（2）用封闭剂对分子标记后的纳米磁珠进行封闭；以封闭掉纳米磁珠上未结合寡核苷酸的活性位点；

（3）采用封闭后的纳米磁珠通过特异性结合反应富集待测样本中的啤酒花矮化类病毒，得到纳米磁珠-啤酒花矮化类病毒核酸复合物；

所述步骤（3）中利用纳米磁珠富集待测样本中的啤酒花矮化类病毒的原理是：封闭后的带有分子标记的纳米磁珠可以特异性结合啤酒花矮化类病毒核酸，形成纳米磁珠-啤酒花矮化类病毒核酸复合物，再通过外加磁场将纳米磁珠-啤酒花矮化类病毒核酸复合物从待测样本的溶液中分离出来，即可得到纳米磁珠-啤酒花矮化类病毒核酸复合物；

（4）将所述纳米磁珠-啤酒花矮化类病毒核酸复合物分散到水溶液中并加热，得到啤酒花矮化类病毒核酸水溶液；在该步骤中，通过加热可以使啤酒花矮化类病毒核酸释放到水溶液中，这样就可以得到含有啤酒花矮化类病毒核酸的水溶液，已备检测使用；

（5）将得到的啤酒花矮化类病毒核酸水溶液进行实时荧光RT-PCR检测。

本发明对啤酒花矮化类病毒RNA的检测是采用实时荧光RT-PCR的方法，利用现有技术中已知的检测啤酒花矮化类病毒的引物和探针均可以实现本发明，但是本发明提供了一组特异性更强、灵敏度更高的检测啤酒花矮化类病毒的引物和探针，如序列表SED ID No: 2~4所示：

2）5’-CCGCGGATCCTCTCTTGA-3’（SED ID No: 2）

3）5’-CCGGGGCTCCTTTCTCAG-3’（SED ID No: 3）

4）5’-[FAM]CTGGGGAATTCTCGAGTTGCCGCA[BHQ1]-3’（SED ID No: 4）

其中序列2）和3）分别为正义引物和反义引物，序列4）为荧光探针，探针的5’端标记报告荧光基团为FAM（6-羧基荧光素），3’端标记淬灭荧光基团为BHQ1。

以啤酒花矮化类病毒RNA全长序列为靶区域，在多重序列比对的基础上，选择保守区域设计引物和探针。引物长度为18个碱基，GC含量为55%~70%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于2℃。探针的长度为24个碱基，GC含量为58.3%，Tm值比引物的Tm值高7℃左右。

进一步地，所述将纳米磁珠进行分子标记的具体方法是：

a. 将偶联剂1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（简称EDC）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺（简称Sulfo-NHS）分别溶于MES活化缓冲液中，配制成浓度为20mM EDC和50mM Sulfo-NHS；

b. 取5mg纳米磁珠，用MES活化缓冲液清洗两次，重悬于400 μL的MES活化缓冲液中，各取50μL 20mM EDC和50mM Sulfo-NHS加入到磁珠悬浮液中，混匀，避光反应25 min，得到活化的纳米磁珠；

c. 将所述活化的纳米磁珠与500 μL 反应缓冲液和20 μL浓度为10 μM的寡核苷酸混合均匀，避光反应8 h，得到分子标记的纳米磁珠；

其中，所述MES活化缓冲液为含有0.1M 2-吗啉乙磺酸，0.5M NaCl，pH6.0的溶液；所述反应缓冲液为含有0.137mol/L NaCl，0.003mol/L KCl，0.013mol/L Na₂HPO₄，0.004mol/L KH₂PO₄，pH7.2~7.4的溶液，所述寡核苷酸序列如序列表SED ID No: 1所示，其5’端用氨基修饰。 

进一步地，所述步骤（2）中，封闭剂为含有0.05M~0.2M Tris-HCl，0.05M ~0.4M NaCl，pH7.4的溶液，封闭时间为1~5小时。

进一步地，所述步骤（3）中，所述纳米磁珠与啤酒花矮化类病毒进行特异性结合反应时，所需的反应缓冲液为含有0.137mol/L NaCl，0.003mol/L KCl，0.013mol/L Na₂HPO₄，0.004mol/L KH₂PO₄，pH7.2~7.4的溶液。

进一步地，所述步骤（4）中，加热温度为50℃~100℃，加热时间为2~5分钟。

本发明是根据实时荧光RT-PCR反应体系的荧光强度，判断样本中是否存在啤酒花矮化类病毒：阴性对照的检测结果为阴性；阳性对照的Ct值应小于28.0；否则，此次实验视为无效；无Ct值的样本为阴性样品；Ct值≤30.0的样本为阳性样本；Ct值大于30.0的样本建议重做，重做结果无Ct值的为阴性，否则为阳性。

本发明的有益效果：

1）快速：用分子标记纳米磁珠方法可以提取类病毒RNA，将传统方法的2～3天提取时间缩短为3个小时；

2）特异：由于不仅分子标记的纳米磁珠可以特异性的吸附啤酒花矮化类病毒RNA，而且实时荧光PCR反应中采用了特异性强的引物和探针，使该方法的特异性高于传统检测方法；

3）灵敏：由于采用了特异性的荧光探针和高灵敏度的荧光PCR仪，使该方法比传统PCR方法灵敏度高100～1000倍；

4）稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；

5）不易污染：全封闭反应，无需PCR后处理，操作安全。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，不以任何方式限制本发明。凡是依照本发明公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1纳米磁珠分子标记技术检测啤酒花矮化类病毒的实时荧光PCR图，其中， 1号是带有啤酒矮化类病毒的阳性样本，2号是不带有啤酒矮化类病毒的阴性样本。

具体实施例方式

    本发明所使用的试剂来源如下：

感染有啤酒矮化类病毒的植物组织叶片（阳性样本）或健康植物组织叶片（阴性样本）由北京出入境检验检疫局植物检疫中心保存。

纳米磁珠：Bio-Rad

NaCl、KCl：北京化工厂

Na₂HPO₄、 KH₂PO₄：北京化学试剂公司

EDC： Thermo 公司 Prod#22980

Sulfo-NHS： Thermo 公司 Prod#24510

MES：Amresco  Cat.No.CSJ411

三羟甲基氨基甲烷（Tris）：北京欣经科生物技术有限公司，货号：2021-250g

5×buffer：TaKaRa公司，TaKaRa code：D2640A

10mM d NTP: TaKaRa公司，TaKaRa code：D4030RA

RNA酶抑制剂: TaKaRa公司，TaKaRa code：D2310A

M-MLV:TaKaRa公司，TaKaRa code：D2640A

2×premix: TaKaRa公司，TaKaRa code：DRR037S

实施例1  

1. 待测样本的制备

将感染有啤酒矮化类病毒的植物组织叶片（阳性样本）或健康植物组织叶片（阴性样本）用液氮研磨成粉末，然后加入1~5ml反应缓冲液（0.137mol/L NaCl，0.003mol/L KCl，0.013mol/L Na₂HPO₄，0.004mol/L KH₂PO₄，pH7.2~7.4），研磨均匀，转移至无RNA酶污染的离心管中，5000rpm离心3三分钟，取上清备用。

2. 纳米磁珠的分子标记

（1）根据啤酒花矮化类病毒RNA核酸保守序列设计的一段互补寡核苷酸序列，即：5'(NH₂)- TTTTTTCTTT GCTTGCCTTA TGCGGCAACT CGAGAATTCC CCAG -3'（SED ID No: 1）。由宝生物工程（大连）有限公司合成。

（2）分别称取一定量的 EDC和Sulfo-NHS溶于MES活化缓冲液（0.1M 2-吗啉乙磺酸（MES），0.5M NaCl，pH6.0）中，分别配制成20mM EDC和50mM Sulfo-NHS。

（3）取5mg纳米磁珠，用MES活化缓冲液清洗两次，重悬于400 μL的MES活化缓冲液中；各取50μL 20mM EDC和50mM Sulfo-NHS加入到磁珠悬浮液中，混匀；28℃，150 rpm摇床避光反应25 min。

（4）磁铁吸附，弃上清，用反应缓冲液（0.137mol/L NaCl，0.003mol/L KCl，0.013mol/L Na₂HPO₄，0.004mol/L KH₂PO₄，pH7.2~7.4）清洗一次。

（5）加入500 μL 反应缓冲液（0.137mol/L NaCl，0.003mol/L KCl，0.013mol/L Na₂HPO₄，0.004mol/L KH₂PO₄，PH7.2~7.4）和20 μL（10 μM）寡核苷酸，混匀，28℃，150 rpm摇床避光反应8 h，再放置于4℃冰箱放置1-2星期。

3．纳米磁珠的封闭

将标记后的纳米磁珠用300μL封闭剂（0.1M Tris-HCl，0.15M NaCl，pH7.4）清洗2次，加入1000μL封闭剂，28℃，150 rpm摇床上封闭2小时。

4．富集待测样本中的啤酒花矮化类病毒

将封闭后的1mg纳米磁珠用500μL溶液（0.137mol/L NaCl，0.003mol/L KCl，0.013mol/L Na₂HPO₄，0.004mol/L KH₂PO₄，pH7.2~7.4）清洗2次，然后加入500μL步骤1中制备的研磨液上清，室温结合15分钟，然后用磁铁吸附，弃掉上清，再用反应缓冲液（0.137mol/L NaCl，0.003mol/L KCl，0.013mol/L Na₂HPO₄，0.004mol/L KH₂PO₄，pH7.2~7.4）清洗一次，得到纳米磁珠-啤酒花矮化类病毒核酸复合物。

5．核酸的洗脱

将上述纳米磁珠-啤酒花矮化类病毒核酸复合物加入50μL DEPC 水，混合均匀，80℃水浴加热2分钟后，立即取出离心管，用磁铁吸附，将上清转移至一无RNA酶污染的离心管中，得到啤酒花矮化类病毒核酸水溶液，备用。 

6. 进行实时荧光RT-PCR检测

（1）引物和探针

正义引物 5’-CCGCGGATCCTCTCTTGA-3’（SED ID No: 2）

反义引物 5’-CCGGGGCTCCTTTCTCAG-3’（SED ID No: 3）

荧光探针5’-[FAM]CTGGGGAATTCTCGAGTTGCCGCA[BHQ1]-3’（SED ID No: 4）是由宝生物工程（大连）有限公司合成。

（2）实时荧光RT-PCR检测

a) 反转录

取一PCR管，加入1μL 反向引物，5μL RNA，置于PCR仪上，70℃，10min，运行完毕将PCR管马上置于冰上。然后向离心管中加入2μL 5×buffer，0.5μL 10mM d NTP，0.2μL RNA酶抑制剂，0.2μL M-MLV，1.1μL DEPC 水。混合均匀，离心，使管中没有气泡。 于PCR仪上运行程序：42℃，60分钟；70℃，10分钟, 运行完毕将PCR管马上置于冰上。

b)实时荧光PCR

于PCR管中加入 10μL 2×premix，0.5μL 正向引物，0.5μL反向引物，0.2μL 探针，6.8μL Depc处理过的水，2μL 反转录产物。

于实时荧光PCR仪上运行程序：95℃：10sec；95℃：5sec；60℃：20sec；40个循环，60℃时设置收集荧光。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。 

序列表

<110>  中华人民共和国北京出入境检验检疫局

       武汉哇哇噻纳技术开发有限公司

<120>  一种啤酒花矮化类病毒的检测方法

<130> 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  44

<212>  DNA

<213>  人工合成寡核苷酸

 

<400>  1

ttttttcttt gcttgcctta tgcggcaact cgagaattcc ccag                      44

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工合成正义引物

 

<400>  2

ccgcggatcc tctcttga                                                   18

 

<210>  3

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工合成反义引物

 

<400>  3

ccggggctcc tttctcag                                                   18

 

<210>  4

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工合成探针

 

<400>  4

ctggggaatt ctcgagttgc cgca                                            24