一种制备DL2000 DNA分子量标准的方法及其产品和应用

摘要

本发明公开了一种制备DL2000 DNA分子量标准的方法，其特征在于，采用质粒酶切法，包括以下步骤：(1)DL2000 DNA分子量标准包括6个DNA片段：100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb，将该6个片段分配到两个载体中进行扩增：载体1中包含片段100bp，拷贝数10；片段250bp，拷贝数4；片段500bp，拷贝数2；片段750bp，拷贝数1；和片段1kb，拷贝数1；载体2中包含2kb，拷贝数1；和片段750bp，拷贝数4；(2)将载体1和载体2用限制性内切酶进行酶切，然后混合，即得。本发明最终得到的产品中各条带亮度均一，生产方便，便于大规模生产，各批次质量稳定。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一种制备DL2000DNA分子量标准的方法及其产品和应用。 

背景技术

DNA分子量标准俗称DNA Marker，是由一系列已知长度的DNA片段混合而成，是分子生物学实验中最常用的一种试剂。通过将实验中所得的DNA片段与DNA Marker在同一块琼脂糖凝胶中进行电泳，通过将样品片段与DNA Marker比较，就可以大致估计出实验所得的DNA片段的大小。 

DNA Marker的各条带通常有两种制备方案：PCR扩增和酶切质粒。 

PCR扩增的方案就是设计多套PCR引物进行扩增，得到相应大小的DNA片段。然后再对各片段进行纯化，定量。最后按比例将各片段混合，就得到了所需的产品。PCR扩增法制备DNA Marker存在着较大的缺陷，一是扩增的体积会有一定的限制。现在的PCR仪每个孔最多扩增体积不会超过70微升，以一台PCR仪96孔为例，最多一次可以扩增7毫升。更大的量就需要增加PCR仪及进行多次扩增。二是PCR扩增受多种条件影响较大，如仪器，模板，扩增用酶，不同批次的引物，及其他试剂，因此不同扩增批次之间差异会较大。三是PCR扩增的成功率相对较低，有较多的时间所扩增的条带可能有杂带，或目标条带专一性不太强，所扩增的条带较宽，或扩增产率较低，以及其他的不成功情况。 

常规质粒酶切的方法，由于DNA的条带亮度与其大小有正比例关系，在一个质粒中各片段酶切后其亮度可能会有较大差异，大片段比小片段亮。因此会导致所制备的终产品各条带之间亮度不均匀。 

DNA分子量标准是分子生物学实验室中最常用的一种试剂，而且属于消耗型的产品，市场用量很大。而DL2000类型的DNA分子量标准，由100bp，250bp，500bp，750bp(加亮作为指示带)，1kb，2kb共6条DNA片段组成。它是实验室中用得最方便，也是使用最多的一种产品，消耗量很大。许多公司都有类似的产品出售。由于该DNA分子量标准中包含了小片段DNA，许多公司均采用PCR的方案进行产品制备。由于PCR生产中需要消耗大量人力资源及PCR仪，而且像100bp这种很小的DNA片段采用PCR扩增的方案效率特别低，扩增后的每个条带均需要进行纯化，并定量。然后再逐条带进行配制调整，得到最终产物。因而PCR扩增中不同批次之间会存在较大差别，并且很耗费人力及试剂，生产流程难于标准化。 

发明内容

本发明针对现有的DL2000DNA分子量标准的制备方法过程烦琐，批次之间质量不稳定，难以大规模生产的不足，提供一种新的制备DL2000类型的DNA分子量标准的方法及其产品和应用，其生产方便，可大规模生产，各批次之间质量稳定，DL2000 DNA分子量标准的各条件亮度均一。 

本发明通过下述技术方案解决了上述问题： 

本发明的第一技术方案是：一种制备DL2000 DNA分子量标准的方法，采用质粒酶切法，包括以下步骤：(1)DL2000 DNA分子量标准包括6个DNA片段：100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb，将该6个片段分配到两个载体中进行扩增，并且使它们在载体中具有特定的拷贝数，其中该6个片段的分配和拷贝数具体如下：载体1中包含片段100bp，拷贝数10；片段250bp，拷贝数4；片段500bp，拷贝数2；片段750bp，拷贝数1；和片段1kb，拷贝数1；载体2中包含2kb，拷贝数1；和片段750bp，拷贝数4；(2)将载体1和载体2用限制性内切酶进行酶切，然后混合，即得。 

其中，步骤(1)中可以采取本领域常规的质粒酶切方法，使载体中包 含各拷贝数的DNA片段，DNA片段之间是限制性内切酶酶切位点。当载体扩增后，用限制性内切酶酶切载体，即得到各拷贝数的DNA片段。将这些片段混合，即得本发明的DL2000 DNA分子量标准。其中，使用的载体可以是本领域常规载体，如质粒等。所述的载体1较佳的是基因工程质粒pTZ19R-250，核苷酸如序列表中SEQ ID NO：3所示；载体2较佳的是基因工程质粒pUCS1-2k-750，核苷酸如序列表中SEQ ID NO：4所示。pTZ19R-250和pUCS1-2k-750中DNA片段之间的酶切位点是Hind III。也可以是其他本领域常用的酶切位点，优选Hind III。将pTZ19R-250和pUCS1-2k-750分别用内切酶Hind III进行酶切；然后，pTZ19R-250和pUCS1-2k-750的酶切产物经电泳检测合格后，采用亲和柱层析法进行纯化，再进行混合，混合比例较佳的是以pTZ19R-250和pUCS1-2k-750两质粒质量比为2.5∶1～1.5∶1，最佳的为1.9∶1。以1.9∶1的量进行混合，可保证1kb的条带的浓度与2kb的条带的浓度相等。 

本发明的第二技术方案是：由上述本发明的方法制备的DL2000 DNA分子量标准。 

本发明的第三技术方案是：如上所述的本发明的DL2000 DNA分子量标准的应用，一般用于琼脂糖凝胶电泳。 

本发明的第四技术方案是：一种基因工程质粒pTZ19R-250，核苷酸如序列表中SEQ ID NO：1所示。 

本发明的第五技术方案是：一种基因工程质粒pUCS1-2k-750，核苷酸如序列表中SEQ ID NO：2所示。 

本发明的要点及优势如下： 

1、构建特殊的质粒，将其中的各条带做相应的拷贝调整，使之相互之间浓度更合理。所提取的质粒经酶切后直接就得到了每条DNA片段所需要的比例，不必像PCR所得的各条带之间还需要仔细进行浓度调整。 

2、将PCR的工作转化成DNA质粒的提取和DNA的酶切操作。这样的 转化，在实际生产中便于生产的标准化和规模的扩大化，PCR扩增限于每次扩增的体积及各扩增批次之间的较大差异，失败率较高，不容易规模化及扩大化。 

3、由于质粒提取及酶切操作是非常成熟的分子生物学操作，而且非常容易扩大规模，并进行标准的质量控制，因此本发明可以大批量进行DNA分子量标准的生产，并保证各批次之间具有几乎完全一致质量标准。 

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。 

图1是pTZ19R-250载体构建流程图。 

图2是pUCS1-2k-750载体构建流程图。 

图3是pTZ19R-250载体结构图。 

图4是pUCS1-2k-750载体结构图。 

图5是本发明DL2000 DNA分子量标准产品的1.2％琼脂糖电泳图。 

具体实施方式

本发明人将DL2000 DNA分子量标准中包含的6个长度不同的DNA片段分别构建于两个载体中，该两载体扩增后直接用限制性酶切，将酶切产物混合后，就得到了由该6个不同长度DNA片段组成的DL2000 DNA分子量标准，并且仅仅只要调整两质粒的混合比例，就能使得到的DL2000 DNA分子量标准的5条带亮度一致，指示带(750bp)亮度为其它带的两倍，在电泳中清楚的显示每条带。具体实施方式如下： 

1、两个载体DNA的构建 

a)总述 

本发明中两个载体均以产量非常高的商品载体pTZ19R(购自Fermentas life sciences，目录编号：SD0141)为基础，采用常规的实验方法， 进行适当的点突变操作，并从Lambda DNA上扩增适当的片段，作系列的点突变构建基本片段。然后将基本片段与突变改造的载体相连构建最终载体。 

b)6个片段的分配 

载体1：pTZ19R-250，包含100bp*10,250bp*4,500bp*2,750bp*1,1kb*1。 

载体2：pUCS1-2k-750，包含2kb*1,750bp*4。 

其中星号*后表示该长度的片段在载体中的拷贝数。 

c)突变骨架载体 

i.实验方法：采用的突变方法按照分子生物学上通用的突变方案进行操作，这些方案已经是非常成熟的，并且有相应的试剂盒可供选用。本发明实验中采用最成熟的PCR法进行点突变，针对每个待突变的位点合成一对引物，进行常规的PCR法进行扩增，并进行常规的分子克隆方法筛选得到所需的质粒。最终的质粒通过测序进行验证结果符合实验设计的要求。 

突变过程中所需的四对突变引物序列如下： 

855F：tgcccgctttccaagcttgaaacctgtcgtgccagctgcattaatga； 

855R：gcacgacaggtttcaagcttggaaagcgggcagtgagcgcaacgca； 

1359F：aggtcgttcgctccaagcttggctgtgtgcacgaaccccccgt； 

1359R：ggggttcgtgcacacagccaagcttggagcgaacgacctacaccga； 

1858F：tctaaagtatatatgagtaagcttggtctgacagttaccaatgctt； 

1858R：tggtaactgtcagaccaagcttactcatatatactttagattgattt； 

2858F：cccgaaaagtgaagcttgacgcgccctgtagcggcg； 

2858R：cagggcgcgtcaagcttcacttttcggggaaatgtgcgcgga。 

ii突变pTZ19R载体的多克隆位点，将序列aagctt改成cagctt，除去多克隆位点的HindIII。 

iii.依次突变pTZ19R载体上的其他位点，1858：aaactt→aagctt，1359：aagctg→aagctt，855：agtcgg→aagctt，2858：ccacct→aagctt。 

iv.经过上面四个位点的突变，获得的载体编号为250-3。其核苷酸序列 如序列表中SEQ ID NO：1所示。 

d)构建插入片段 

插入片段以Lambda DNA序列为基础，通过点突变的方法得到预期的序列，并将该序列克隆到常用的pGH载体上。其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：2所示。 

e)终载体的制备 

采用分子克隆的常规操作，将改造好的载体和突变好的片段，用KpnI和XhoI两个位点进行连接，转化，筛选，最终得到所需要的终载体pTZ19R-250。其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。pTZ19R-250载体的构建流程示意图见图1，pTZ19R-250的结构图见图3。 

f)载体2：pUCS1-2k-750的构建 

pUCS1载体2023bp长，是以pUC18载体为基础去除不必要的序列改造而成。具体构建方法是采取常规突变的方法，以pUC18载体为基础，用下面一对引物pUCS1F：aggatccgtcgactctagaactagtagaggcggtttgcgtattgggcgctc，pUCS1R：tctcgagaggcgcgcctctgcaggaatggtttcttagacgtcagg，进行扩增，得到2kb的片段，扩增产物经磷酸化处理，自连，然后进行转化，筛选，得到需要的载体，并经测序方法进行确认。pUCS1载体的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：5所示。 

pUCS1-2k-750以小载体pUCS1为基础，扩增合适的片段，连接插入到pUCS1载体中，最终得到pUCS1-2k-750载体。pUCS1-2k-750载体大小5.0kb，主要的特征是包含5个特定位点的HindIII限制性酶切位点。该载体的构建方案与pTZ19R-250类似，均采取常规的分子生物学技术进行构建，在此略去具体构建步骤。pUCS1-2k-750的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。pUCS1-2k-750载体构建流程示意图见图2，pUCS1-2k-750的结构图见图4。 

2、生产条件的优化 

g)质粒制备 

构建好的载体pTZ19R-250和pUCS1-2k-750采用常规的实验方法进行质粒DNA的制备。采取常规实验室三角瓶摇菌的方案进行含所需质粒的工程菌培养。这两种质粒均为高产质粒，采用常规方案进行质粒制备，平均每升培养菌液可以制备5～10mg的质粒。采用扩大培养体积或采取发酵培养的方法，也可以进行更大规模的制备。本工作中，质粒提取采取离心柱型质粒大量制备试剂盒(捷瑞生物)，制备流程简洁，所提取的质粒质量足够高，可以满足后续酶切工作的要求。 

h)酶切 

本构建中采用了最常用的HindIII限制性内切酶，价格足够便宜，活性有所保证。pTZ19R-250平均每264bp包含一个HindIII位点，优选的平均酶切1μg质粒用4个单位的HindIII内切酶。pUCS1-2k-750平均每1000bp包含一个HindIII，经优化，平均酶切1μg质粒用1个单位的HindIII内切酶。经电泳检测合格。 

i)纯化 

酶切产物经柱亲和层析法进行纯化，所得产物溶于适量TE中，经定量后用于成品DNA Marker的配制。 

3、终产品的制备方案 

j)经理论计算，pTZ19R-250经HindIII酶切后，100bp，250bp，500bp，1kb片段的含量是相等的。pUCS1-2k-750中750bp片段与2kb片段的质量比为3∶2。 

k)将pTZ19R-250和pUCS1-2k-750两个质粒酶切，纯化。然后以pTZ19R-250和pUCS1-2k-750两质粒一定的质量比进行混合。该质量比可以是2.5∶1～1.5∶1。最佳的是1.9∶1，可保证2kb的条带与1kb的条带的浓度相同，这样理论计算750bp的加量带是其他条带浓度的2.25倍。由于该DNAMarker只有6条带，这样的加亮浓度可以接受。更多条带的DNA Marker一 般将加亮带的浓度做成其他条带的3倍或更多一些，以便更加突出加亮指示带。调整好浓度后，将酶切的片段溶于1xLoading Buffer，作为终产品，即可进行质量检测，分装包装发货。较佳的在最终的产物中，使100bp，250bp，500bp，1kb，2kb的各条带终浓度为10ng/μL，750bp的条带的浓度是22.5ng/μL，Loading buffer稀释成1x的浓度。 

本发明重点解决了常规DNA Marker制备中的产量和批次稳定性问题，用分子生物学技术构建的工程质粒分离制备并酶切替代较传统的PCR扩增每条单带配制DNA Marker，使得产品的质量和稳定性大幅度提高。本发明中以两个高拷贝数的质粒为基础，依托本实验室的基因合成技术，巧妙构建了两个工程质粒，经验证，这两个质粒均是高产质粒，并且设计的各HindIII位点均可以充分地进行酶切。经适当的优化后，平均1L菌液所提取的质粒可以处理得到200支以上的成品DL2000产品。所得的产品批次间差异极小，产品非常稳定。在1xLoading buffer中，本发明的产品只要在常温放置即可达到足够的稳定性，这将给日常实验工作带来极大方便性。 

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。 

实施例1PCR法定点突变改造载体 

实验方法：采用的突变方法按照分子生物学上通用的突变方案进行操作，这些方案已经是非常成熟的，并且有相应的试剂盒可供选用。本发明实验中采用最成熟的PCR法进行点突变，针对每个待突变的位点合成一对引物，进行常规的PCR法进行扩增，并进行常规的分子克隆方法筛选得到所需的质粒。最终的质粒通过测序进行验证结果符合实验设计的要求。这里以pTZ19R载体的855位点的点突变进行具体叙述，其他位置的点突变方法完全一样，只是用对应位置的引物即可。 

所用的引物人工合成，其他相关试剂均来自实验室平常自用的试剂，这 些试剂常规实验室也是具备的，除特别说明外，所用的试剂没有特定要求。 

855位置待突变的引物序列如下： 

855F：tgcccgctttccaagcttgaaacctgtcgtgccagctgcattaatga； 

855R：gcacgacaggtttcaagcttggaaagcgggcagtgagcgcaacgca。 

PCR体系：(50μl) 

855F/855R引物各10pmole，dNTP 200μM，pfu：3单位，模板：50ng，整个体系在1x pfu缓冲液中进行。 

PCR扩增条件：94℃20秒，60℃20秒，72℃3分钟，共15个循环。 

需要注意的是在选择延伸时间时，要根据所选用的pfu酶的性能和模板长度选择合适的时间。本实验中所用的pfu酶可以达到1kb/分钟的扩增速度，模板长度2.9kb，故这里用3分钟的延伸时间。 

PCR法进行片段构建的操作基本相同，只要根据所需要的序列设计相应的引物做实验即可，这里不再进行详细说明。 

后续酶切处理：扩增所得的PCR产物冷却后，加入1μl DpnI内切酶，37℃30分钟。 

转化筛选操作： 

将处理好的PCR产物取5μl进行常规的转化操作，具体操作如下： 

1.100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。 

2.加入5μl PCR产物，轻轻混匀，冰上放置20分钟。 

3.42度水浴热激60秒，冰上放置2分钟。 

4.加500μl SOC培养基，37度200-300rpm震荡培养1小时。 

5.细菌涂布在预先准备好的Amp平板上。 

6.平板在37度下倒置培养过夜。 

筛选： 

从经过夜培养的平板上挑取适当的菌斑，用LB培养基培养进行质粒提 取。提取的质粒用适当的实验方法进行检测拿到阳性克隆，并最终经过测序验证得到预期的质粒。 

实施例2终载体构建 

pTZ19R-250构建： 

酶切载体及片段： 

DNA～1μg 

10xBamHI⁺buffer 5μl 

KpnI：1μl(10u/μl)

XhoI：1μl(10u/μl)

ddH₂O补足至50μl 

                                

总体积：50μl 

酶切约2小时，待检测酶切完全后，用胶回收试剂盒进行回收对应的载体和片段，做连接。具体操作步骤参考试剂盒所提供的说明书即可。 

连接反应： 

载体：～100ng 

片段：100-200ng 

10x T4DNA buffer 1.5μl 

T4DNA ligase 1μl(5u/μl)

ddH2O补足至15μl 

                                  

总体积：15μl 

连接1小时以上，取5μl连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，操作步骤同PCR法定点突变中的转化步骤完全相同。 

转化板挑菌提取质粒进行鉴定，得到所需要的工程菌载体。 

pUCS1-2k-750的构建方法完全同pTZ19R-250，只是换成对应的载体和片段即可。 

转化后筛选鉴定得到的阳性转化子，即含有pTZ19R-250载体的工程菌 和含有pUCS1-2k-750载体的工程菌。 

实施例3质粒的扩增和提取 

工程菌培养： 

250mL培养基接菌种200μL，高速摇菌12-14小时。培养基采用2xYT高产培养基(每升含16g蛋白胨，10g酵母粉，5g NaCl)。 

质粒提取： 

1.收菌：50ml圆底离心管中，倒入3/4管菌液，1500g离心5min，弃上清。收2次菌。倒扣吸水纸上半分钟。两次共收菌约60mL。 

2.加Sol I：加入6ml sol I，漩涡振荡使菌体分散均匀。 

3.加Sol II：加入10ml sol II，温柔颠倒5～10次。 

4.加Sol III：加入7ml sol III，先温柔颠倒3次，再用力摇荡，使充分混匀。静置5min。 

5.沉淀蛋白：10000rpm离心7min。 

6.过滤取上清：用一层擦镜纸折叠成漏斗状，将上清过滤至一干净的50ml圆底离心管中。 

7.加异丙醇：加入13ml异丙醇，摇匀，-20℃放置20min。 

8.沉淀质粒DNA：12000rpm离心10min，弃上清，吸水纸上倒扣半分钟。离心沉淀时，注意将管底做好标记，然后将标记处向上放置，后面将重点在该处洗涤沉淀。 

9.洗涤沉淀：加入10ml 75％乙醇，12000rpm离心5min，弃上清。倒扣于吸水纸上半分钟。37℃或50℃烘干。 

10.溶质粒：每管加入2ml TE缓冲液，用1mL枪充分充分吹沉淀处，然后放置在37℃5分钟充分溶解。 

11.初提质粒进行电泳检测，估计提取情况，然后用于后续的酶切工作。 

得到pTZ19R-250DNA和pUCS1-2k-750DNA。 

实施例4质粒的HindIII大规模酶切(50mL体系) 

pTZ19R-250DNA：5mg(终酶切浓度：100ng/μL)

10xBuffer R  5mL 

HindIII：10000～20000单位，需根据每批HindIII的活性加适当的量 

双蒸水：补足至50mL 

                                             

总体积：50mL 

酶切时间3到6小时，中间取样检测，确认酶切完全后，-20℃保存待纯化。 

pUCS1-2k-750酶切方案与pTZ19R-250相同，只是将HindIII的量减至1/4即可切全。 

实施例5柱亲和层析法纯化质粒酶切产物 

本实验中将两个质粒的酶切产物进行整体纯化，即将pTZ19R-250所切的5个片段一起纯化，将pUCS1-2k-750所切的两个片段一起纯化。每个质粒酶切所得的各片段不必先单独纯化出来，这样既麻烦又没有必要。而且一起纯化还有一个好处就是每个片段的比例保持不变，这样计算总的DNA量就可以推算出每个片段的量。 

纯化的目的是将非DNA的成份均去除掉，保证得到最纯的DNA。 

柱亲和层析采用Qiagen tip 100000的柱子进行纯化，Qiagen订货目录号：12191。柱子容量为10mg。 

具体操作流程如下(更详细步骤及各溶液情况可参考Qiagen相关试剂盒手册)： 

1、用QBT溶液75ml平衡待用的柱子。 

2、样品吸附：将检测确认的酶切产物按照酶切产物与QBT溶液1∶5的比例进行混合，加入到平衡好的柱子进行过柱吸附，柱子最大的体积为140ml，体积大时可进行多次吸附。 

3、漂洗：用总共600mL的QC溶液进行漂洗，将其他杂质洗掉。 

4、洗脱：将漂洗好的柱子用100mL的QF溶液进行洗脱，将DNA从 柱子上洗下来。 

5、沉淀： 

a)将洗脱液加70mL异丙醇(0.7倍上清液体积)混合，室温沉淀20分钟， 

b)用12000g的离心力离心20分钟，小心倒掉上清液， 

c)用20ml 70％乙醇洗涤一次，12000g离心10分钟，小心倒掉上清液， 

d)吸去残余的液体，根据DNA的量用适当体积的TE溶液溶解DNA，用于后续工作。 

6、检测定量： 

a)所得的DNA适当稀释后进行260nm的OD值测量，并换算成DNA浓度。为便于后续操作方便，将样品浓度统一调整至500ng/μl保存。 

b)根据所测的DNA浓度，再进行电泳检测，进一步核实一下所得DNA的浓度及条带质量。 

c)得到的DNA做好记录，于-20℃保存待用。 

实施例6终产品配制 

以实施例5中所得的浓度为500ng/μl的样品为原料配制终产品。以配制100ml成品为例，其配制方案如下： 

5xLoading buffer组成： 

10mM Tris.HCl(pH7.6)，10mM EDTA，0.03％二甲苯菁，0.03％溴酚蓝，30％甘油。 

每批配制好的DL2000成品做好记录，取出小部分进行电泳检测和室温 的稳定性检测。 

电泳检测：取配制好的样品4μl，5μl，6μl与标准样品5μl同时进行1.2％琼脂糖电泳，电泳用1xTAE缓冲液，胶面上直接观察以及拍照记录。电泳图见图5。可见各条带亮度要与标准样品一致。并且电泳条带清晰，条带间无杂带，无背景。这样的样品可以发货。 

室温稳定性检测：将每批配制好的成品，取小部分放置在室温及37℃，在3天，1周，两周的时间点上分别进行检测。检测结果表明，所得的产品批次间差异极小，产品非常稳定。在1xLoading buffer中，只要在常温放置产品即可达到足够的稳定性。 

然后进行成品的分装，分装成0.5ml每支成品DL2000。平均1L菌液所提取的质粒分装后得到200支以上的成品DL2000产品。 

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。