金丽假交替单胞菌新菌株及其应用

摘要

本发明涉及一种金丽假交替单胞菌新菌株及其应用，其中金丽假交替单胞菌JG1菌株，其保藏编号为CGMCC NO.5009；JG1菌株代谢生产出Pfa蛋白。本发明的金丽假交替单胞菌JG1菌株，可通过细菌素蛋白、小分子化合物等多种方式达到抑菌效果，能够抑制多种水产养殖动物常见病原菌；对斑马鱼、虾蛄、扇贝、蛤蜊等动物试验的结果表明JG1对动物本身没有毒副作用，其制备的菌制剂能有效的作为水产养殖中的增效剂在实际生产中得到应用。所代谢生产的Pfa蛋白具有明显的抑菌效果，可用作提高水产动物的免疫制剂。

说明书

技术领域

本发明属于水产有益微生物筛选技术领域，具体涉及一种金丽假交替单胞菌新菌株及其应用。

背景技术

水产养殖业作为当代一个快速发展的产业，在带来丰富水产食品的同时也创造了数万亿美元的经济价值。联合国粮农组织(FAO)的数据报告显示，2006年世界水产养殖业总产量达到5163万吨，占2006年世界渔业总产量的36％。自1970年以来，世界水产养殖业规模以平均每年9.2％的速度增长，而与之形成对比的是，捕捞业和陆地养殖业的年平均增长速度分别只有1.4％和2.8％。

然而在迅速发展、创造巨大财富的同时，水产养殖业也面临着严峻的考验，例如伴随着水产养殖业的集约化生产、养殖动物产品的商业化以及行业内部竞争日益激烈的趋势，水产养殖病害相继发生，给养殖业带来了巨大的损失。由于水产养殖动物始终处于养殖环境中，对养殖水体的组成及环境相当敏感，当养殖水体中的病原菌数量达到一定程度时，会导致水产养殖动物疾病的产生以及养殖环境的失衡。此外，由于养殖密度过高或者投饵不力而造成“宿主动物-致病菌-环境”的平衡被打破，最终引发水产养殖动物一系列疾病的暴发。针对这一情况，各国养殖者普遍采用了施加抗生素的方法。抗生素虽然在一定程度上可抑制或杀死病原菌，提高水产养殖动物的生存率，但是却会产生很多负面效应，因而受到许多专家学者的质疑，Schwarz等针对抗生素在动物中的过量使用和存在的潜在危险做出了具体的论述。抗生素这种化学治疗方法的滥用会增加病原细菌的耐药性，产生大量耐药性菌株。20世纪90年代，许多亚洲国家水产品数量急剧下滑的主要原因之一就是抗生素的滥用，其中也包括我们国家。中国作为世界上水产养殖业最发达的国家之一，在控制水产养殖病害方面，却走过不少弯路。由于抗生素的盲目使用及其它多种因素，对虾病害日益严重，导致1993年暴发性虾病的大流行，致使我国的对虾产量减少了70％，对虾养殖业蒙受了巨大的经济损失。如今，抗生素对发光弧菌病(luminescent vibriosis)已没有任何治疗效果。另一方面，抗生素的滥用会破坏和干扰养殖环境中的正常微生物区系，导致微生态平衡失调。

同时，水产养殖中抗生素的滥用也给人类健康带来了巨大威胁。养殖环境中已产生抗生素抗性的病原菌质粒很有可能转移到一些人类病原菌中，增加人类疾病治疗的困难程度；人们不断食用抗生素残留的水产品，体内抗生素的大量积累也会成为危害健康的一大杀手。因此，许多国家都对抗生素的使用实行了比较严格的控制。

人们在质疑或否定使用抗生素的同时，也在积极寻找更为安全有效的水产养殖病害防治方法。有益菌(probiotics)由于其对病原菌良好的抑制能力而受到越来越多的关注。有益菌作为抗生素的替代品应用于水产养殖体系中，使水环境条件得到修复，病原菌得到控制，养殖动物抗病力得到增强，已逐渐成为水产养殖动物病害防治的一种生物控制模式。利用自然环境中的有益菌对水产养殖环境进行生物调节(microbial intervention)，其抑菌范围宽，针对多种病原菌引起的疾病都有很好的防治效果。当前，许多国家已意识到水产养殖中应用有益微生物和免疫制剂的经济价值及其潜在的社会效益，日益重视有益微生物的研究与开发，加大了这方面的科技投入。我国863科技攻关项目中就有针对这一方面的内容。因此，有益菌的开发以及在水产养殖中的应用已成为国内外研究热点，具有广阔的发展空间。

许多有益菌都能对水产养殖中的病原微生物产生拮抗作用，抑制病原菌的生长，从而达到“以菌治菌”的效果。最初用于水产养殖中的有益菌制剂来自为陆地动物设计的商品制剂，其中以陆生芽孢杆菌(Bacillus)和乳酸杆菌(Lactobacillus)等的使用最为广泛。这些制剂在一定程度上能够抑制病原菌的生长，并促进动物生长。但考虑到水生动物与陆生动物的生存环境、生长发育过程和肠道细菌区系组成存在差异，来自非养殖水体的有益菌制剂可能会对养殖动物造成伤害，或者不能尽快成为优势菌而失去微生态调节的功效。因此，从养殖水体环境以及养殖动物体表或体内分离土著菌来作为潜在有益菌成为国内外的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种金丽假交替单胞菌新菌株及其应用，即一种能抑制水产病害微生物的有益菌，从而弥补现有技术的不足。

本发明的技术方案如下：

本发明的金丽假交替单胞菌(Pseudoalteromonas flavipulchra)的JG1菌株，已于2011年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏号为：CGMCC NO.5009。

金丽假交替单胞菌JG1菌株的培养温度范围为8℃～37℃，最佳培养温度为28℃；生长的pH值范围为5.0～12.0，最适pH值为7.5～8.0，使用的培养基为2216E。

本发明的菌株可用来制成用于抑制水产养殖病原菌的生长或增强水产养殖动物免疫力的菌制剂。

上述的菌制剂中包含有金丽假交替单胞菌JG1菌株的活菌。

上述的菌制剂为饲料添加剂。

本发明还涉及一种产自JG1菌株的Pfa蛋白，其特征在于：

1)所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；

2)将1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白效果，由1)所衍生的蛋白。

本发明还提供一种核苷酸，包括有：

1)所述的核苷酸，用于编码氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白质；

2)所述的核苷酸，用于编码1)中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白质效果的，由1)所衍生的蛋白质。

上述的核苷酸的序列为SEQ ID NO：2。

所述的Pfa抑菌蛋白用作水产饲料添加剂。

本发明的金丽假交替单胞菌JG1菌株，可通过细菌素蛋白、小分子化合物等多种方式达到抑菌效果，能够抑制多种水产养殖动物常见病原菌；对斑马鱼、虾蛄、扇贝、蛤蜊等动物试验的结果表明JG1对动物本身没有毒副作用，其制备的菌制剂能有效的作为水产养殖中的增效剂在实际生产中得到应用。所代谢生产的Pfa蛋白具有明显的抑菌效果，可用作提高水产动物的免疫制剂。

附图说明

图1：本发明的抑菌蛋白Pfa的筛选电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的菌株进行详细的描述。

一、金丽假交替单胞菌JG1菌株的筛选

2006年4月发明人将取自胶南卓越养殖厂的健康大菱鲆养殖海水的水样涂布于海洋细菌培养基2216E平板上，28℃培养7d之后观察发现黄色单菌落周围14mm范围内无其他菌株生长，形成明显的抑菌圈.随即挑取该单菌落进行继代培养，直至得到纯化菌株，命名代号为JG1。

通过观察细胞形态、运动性，进行革兰氏染色、氧化酶等试验以及使用API20E试剂条对细菌进行生理生化鉴定。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)，对菌株JG1进行鉴定，并结合细菌16S rDNA序列确定本发明筛选的菌株为JG1鉴定为金丽假交替单胞菌(Pseudoalteromonas flavipulchra)。

二、金丽假交替单胞菌JG1菌株的形态、理化参数

1、金丽假交替单胞菌JG1菌株的形态特征

菌株JG1在2216E平板上培养24小时的单菌落为圆形、全缘、湿润、半透明、易挑取，直径1～2mm，产生橙黄色色素。于4℃放置10d左右，菌落边缘开始模糊，发生泳动现象。

2、培养条件

本发明筛选的金丽假交替单胞菌JG1菌株的生长温度范围为8℃～37℃，在28℃下菌株能在最短时间内达到平台期；JG1菌株的生长pH值范围为5.0～12.0，最适pH值为7.5～8.0。培养基可以选用2216E液体或固体培养基，也可以用其它的海洋细菌培养基。

3、生化反应参数

菌株JG1的生理生化特征如下表，其与杀鱼假交替单胞菌的比较也列在下表：

+：阳性(positive)；-：阴性(negative)；ND：无数据(not determined)

三、金丽假交替单胞菌JG1菌株的应用

在筛选培养中发现本发明的金丽假交替单胞菌JG1菌株具有抑菌的特性，采用琼脂扩散法对菌株JG1进行体外拮抗实验表明，该菌有比较广泛的抑菌谱，对16株指示病原菌株有抑制作用。其中，JG1对嗜水气单胞菌AHK1、嗜水气单胞菌AHU1、杀鲑气单胞菌有很强的拮抗作用，对哈维氏弧菌VIB286、鳗弧菌VIB72和杀鲑气单胞菌AS42的拮抗作用次之，而对溶藻弧菌VIB283和坎贝氏弧菌VIB285的抑制作用较弱(表2)。

同时，对JG1菌株的致病性进行了检验，结果发明，注射JG1菌液的斑马鱼与对照组的斑马鱼在20天中的生存和生活状况无明显差别，没有发生病害或死亡的现象，具体实验方法如下：

将斑马鱼按8条一组分养在几个水槽中，水槽事先用消毒剂清洗并注入经过晾晒的自来水。JG1的菌悬液按照10⁵，10⁶，10⁷，10⁸cfu/ml的浓度分别腹腔注射20μL入斑马鱼体内，设置一对照组，腹腔注射同量无菌生理盐水。饲养过程中不喂食，每天更换一半的水，14天结束后无死亡。

另外，对于其它的水产养殖动物也进行了致病性实验，具体如下：

虾蛄8条，从体节之间的缝隙注射100μL浓度为10⁷cfu/ml的JG1菌液，对照组注射同量无菌生理盐水。饲养过程不喂食，连续冲氧，7天后无死亡。

扇贝和蛤蜊，每组10只，于10⁶cfu/ml的JG1菌悬液中浸浴1h，然后放入海水中饲养，期间不喂食，连续冲氧，以不开口为判断依据，7天后无死亡。

通过JG1在卤虫体内定植后的PCR-DGGE分析，结果表明卤虫体内优势菌群不发生改变，表明JG1不抑制动物肠道内正常菌群的数量，不破坏动物体内的微生态平衡。

综上，本发明的有益菌JG1对斑马鱼无毒害作用。对于其他海洋动物的致病实验也表明本发明的菌株不会产生病、毒害。考虑到菌株的抑菌性，将本发明的菌株用于水产领域，来增强养殖动物免疫力，例如制备饲料添加剂或免疫增强剂。

实施例1：金丽假交替单胞菌JG1菌株作为饲料添加剂

1)JG1菌株的扩大培养

首先配置1L的2216E液体培养基(蛋白胨5g、酵母膏1g、磷酸高铁0.01g、海水1000ml煮沸后，用5％的氢氧化钠溶液调PH值7.6～7.8)，然后将JG1菌株接种于配置好的培养基中，在28℃振荡培养，至OD₆₀₀为0.5左右时停止培养作为JG1扩大培养液。

2)将JG1扩大培养液作为饲料添加剂喂食成鱼

按照10⁶/g饲料的比例将JG1扩大培养液拌入饲料中喂食红鳍东方鲀，可见摄食量增加50％以上。

按1％接种量将过夜培养的JG1种子液接种到灭菌2216E液体培养基，150r/min，28℃培养24h，使菌株JG1处于较好活性状态和分泌较多的胞外活性物质。按10⁶/g饲料的比例将JG1发酵液拌入饲料中喂食东方红鳍鲀作为实验组，对照组的东方红鳍鲀的饲料中不拌入本发明的菌液，实验结果表明，实验组的可见摄食积极性增强、摄食量增加50％以上，并且在一个月的喂养周期中，死亡率比对照组降低了3/4左右。

同样，将JG1扩大培养液进行灭活后作为饲料添加剂拌入饲料中喂食东方红鳍鲀，在一个月的喂养周期中，死亡率比对照组也有明显的降低，但效果没有活菌制剂的好。

实施例2：金丽假交替单胞菌JG1菌株作为免疫增强剂

1)JG1菌株的扩大培养

首先配置1L的2216E液体培养基(蛋白胨5g、酵母膏1g、磷酸高铁0.01g、海水1000ml煮沸后，用5％的氢氧化钠溶液调PH值7.6～7.8)，然后将JG1菌株接种于配置好的培养基中，在37℃振荡培养，至OD₆₀₀为0.5左右时停止培养作为JG1扩大培养液。

2)将JG1扩大培养液作为免疫增强剂

按照终浓度10⁵/ml将JG1扩大培养液加入半滑舌鳎育苗水体中，结果显示，在不使用抗生素条件下，鱼苗成活率与使用抗生素的对照组相比提高了30％，盐度试验结果表明，鱼苗抗逆性显著增强，与使用了抗生素的对照组相比15h存活率提高50％。

对JG1的扩大培养液进行活性物质的鉴定，发现扩大培养液中存在有对羟基苯甲酸、4-羟基苯乙烯、6-溴吲哚-2-羟酸和3-苯甲基-7-羟基-吡咯哌嗪-1，4-二酮等小分子化合物，正是这些小分子化合物，以及JG1菌合成出的抑菌蛋白使本发明筛选的JG1菌株具有高效的抑菌作用。

四：本发明抑菌蛋白Pfa

1、抑菌蛋白Pfa的序列信息：

本发明从金丽假交替单胞菌(Pseudoalteromonas flavipulchra)的JG1菌株提取液中将明显具有抑菌作用的、分子量约为66kDa的抑菌蛋白从胶块中切下(图1)，置于ep管中，经乙腈脱色及蛋白酶酶解后，经MALDI-T of/Tof质谱分析得到两条肽段，氨基酸序列分别为：SerAspThrMetPheAspValAlaValArg和TyrTyrGln(Lys)AspIleGluProIleIleGln(Lys)Arg。将所得到的氨基酸序列与菌株JG1的蛋白质组序列进行比对，得到此抑菌蛋白的基因序列及氨基酸序列全长，并将此蛋白命名为Pfa。本发明的抑菌蛋白Pfa的开放阅读框ORF共由2085个碱基组成，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1；核苷酸序列为SEQ ID NO：2，起始密码子上游7个碱基处为SD序列AAGGA，且在ORF的5’端发现-10和-35启动子序列，分别为TATATC和TTGTGC。Pfa蛋白共由694个氨基酸组成，预测的理论分子量为77.0kDa，理论等电点为4.63。利用Signal P和Secretome P程序对氨基酸序列进行信号肽分析，发现Pfa中并不存在典型的信号肽，但推测其为一种非典型的分泌蛋白，即在蛋白质序列中不存在信号肽序列但仍可分泌到胞外。

2、与SEQ ID NO：1的抑菌蛋白Pfa具有同源性的蛋白

本发明还保护与SEQ ID NO：1中的蛋白分别具有70％或以上同源性的蛋白，所述的同源性蛋白具有相同或相似的功能。

所述的同源性蛋白为SEQ ID NO：1限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抑菌蛋白Pfa效果的，由抑菌蛋白Pfa所衍生的蛋白质。例如，在抑菌蛋白Pfa的5′端连上保护保护性肽段Ser-Gly-Ser(SGS)形成的稳定性更好的蛋白。或是在3′加上信号肽形成的Pfa衍生蛋白，这些衍生蛋白的编码核苷酸序列与序列为SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有高度同源性。

所述的同源性多肽可以用Applied biosystem合成仪或Pioneer^TM肽合成仪等多肽合成仪器按固相化学技术合成。也可以通过插入目的核苷酸片段的表达载体表达出所需要的蛋白。

由取代、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的Pfa衍生蛋白参照上述的抑菌检测方法检测，只有具有抑菌效果的pfa衍生蛋白才属于本发明保护范围。

3、抑菌蛋白Pfa的抑菌效果检测及应用

采用纸片抑菌法对Pfa蛋白的抑菌效果进行检测，结果显示，Pfa蛋白对嗜水气单胞菌AHK1、嗜水气单胞菌AHU1、杀鲑气单胞菌、哈维氏弧菌VIB286、鳗弧菌VIB72和杀鲑气单胞菌AS42都有拮抗作用。将Pfa蛋白作为水产饲料添加剂，用于提高养殖动物的疾病抵抗力。将Pfa蛋白按质量比1∶10添加到饲料中喂食东方红鳍鲀作为实验组，对照组的东方红鳍鲀的饲料中不拌入本发明的Pfa蛋白，实验结果表明，在一个月的喂养周期中，实验组的死亡率比对照组降低了3/5左右。

因此，本发明的JG1菌株和其代谢产生的Pfa蛋白可以作为有效的抑菌制剂而应用到水产养殖中。