预测晚期非小细胞肺癌铂类化疗疗效的分子标记及其应用

摘要

本发明属于医学分子遗传学和临床医学技术领域，具体为一种预测晚期非小细胞肺癌铂类化疗疗效的分子标记及其应用。所述分子标记包括与晚期非小细胞肺癌铂类化疗疗效相关的ABCB11基因，及该基因上单核苷酸多态位点rs12692889。作为上述分子标记的应用，本发明还提供用以预测NSCLC患者含铂化疗疗效的ABCB11基因多态性检测试剂盒。本发明可用于检测或预测晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗疗效，为此类病患个体化治疗的实现提供依据。

说明书

技术领域

本发明属于医学分子遗传学和临床医学技术领域，具体涉及一种预测晚期非小细胞肺癌患者含铂化疗疗效的分子标记及其应用。

背景技术

肺癌是对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一，全球每年有一百多万人死于肺癌，是目前肿瘤导致死亡的主要病因之一。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）约占肺癌的80%，其中有三分之二的患者在确诊时已经处在晚期，失去了手术机会。晚期NSCLC的标准治疗是以化疗为主的综合治疗，而铂类药物因其较强的抗肿瘤作用成为临床治疗NSCLC的常用药。目前，以铂类药物为主的联合化疗方案在晚期NSCLC的治疗中取得了显著的疗效：有效率30%左右，中位生存期8~10个月，2年生存率10%~15%。然而从临床上来看，不同个体对化疗药物的敏感性存在明显不同，疗效差异显著。因此，深入研究影响NSCLC化疗疗效的相关因素，从而提高药物的有效率，具有重要的临床意义，这也是当今肺癌个性化医疗的研究热点。

随着分子生物学和基因组医学的发展，针对肺癌个体化治疗的研究已由传统的基于体外药敏实验的研究方法逐步发展为建立在功能基因组学和蛋白质组学基础上的高通量筛选肿瘤化疗的生物标志物的研究方法，包括肿瘤组织表达谱、甲基化、miRNA以及单核苷酸多态性（single neucleotide polymorphism, SNP）等。其中，SNP因其存在的普遍性、特异性、以及高通量检测技术的成熟发展，逐渐成为在个体化治疗研究中应用最为广泛的生物遗传标志。在肺癌疗效评估方面，虽然肺癌组织的基因组、转录组和蛋白质组的变化和化疗疗效最直接相关，最有可能筛选得到有效的生物标志物，然而大半的晚期肺癌患者不能手术, 肿瘤组织不易获取，因此常用比较容易获得的外周血进行基因组SNP等多态性检测，探索SNP与药物疗效的关系。总之，通过外周血细胞检测DNA的基因多态性，成为肺癌疗效评估常用的研究方法。

ABC转运蛋白超家族（ATP binding cassette transporter superfamily, ABC transporter superfamily）是人类最大的膜转运蛋白基因家族，它的编码产物是一组跨膜蛋白，即ABC转运蛋白。ABC转运蛋白具有药泵功能，可看作是具有ATP结合区域的单向底物外排泵，以主动转运方式完成多种分子的跨膜转运，因而对于药物的吸收、分布和消除具有非常重要的影响。研究表明，ABC转运蛋白超家族与肿瘤化疗的药物耐受密切相关。目前已知ABC转运蛋白超家族在人类基因组有48个成员，可分为7个亚家族：ABCA, ABCB, ABCC, ABCD, ABCE, ABCF, ABCG。其中，有报道参与肿瘤多药耐药的主要成员为ABCB, ABCC, ABCG等亚家族。

本发明研究了ABCB11基因的多态位点与晚期NSCLC患者含铂化疗疗效的相关性，发现1个SNP位点与NSCLC铂类化疗疗效显著相关，该分子标记可用于检测或预测晚期NSCLC患者含铂化疗疗效，为此类病人的个体化医疗提供依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够检测或预测晚期非小细胞肺癌患者含铂化疗疗效的分子标记及其应用。

本发明提供的预测晚期NSCLC患者含铂化疗疗效的分子标记，该预测功能可通过对患者外周血基因组DNA的分子标记进行检测而实现。上述分子标记包括与晚期非小细胞肺癌铂类化疗疗效相关的ABCB11基因，及该基因上单核苷酸多态位点rs12692889。

作为上述分子标记的应用，本发明还提供用以预测NSCLC患者含铂化疗疗效的ABCB11基因多态性检测试剂盒。

该试剂盒包括：

 检测ABCB11基因上rs12692889多态位点基因型的特异性引物对。所述的特异性引物对是指针对ABCB11基因rs12692889多态位点而设计，能特异性扩增出包含这个SNP位点的DNA片段的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。所述引物对可用如下序列：正向引物—5’ TCTTTGGCTGTTTGGAAATA 3’（SEQ ID NO.1）；反向引物—5’ GCAACCCTTTAACCAGAAAA 3’（SEQ ID NO.2）。

 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）及测序反应组件，包括：1 U Taq酶100μl以及10 x Taq缓冲液1ml、2 mM dNTP混合液1ml、1U虾碱性磷酸酶100μl、1U核酸外切酶100μl、BigDye v3.1测序试剂及其配套缓冲液1ml（Applied Biosystems）、120mM乙二胺四乙酸1ml、95%甲酰胺1ml、无水乙醇和超纯水。

使用上述试剂盒可对晚期NSCLC患者铂类化疗疗效进行预测，具体步骤如下：

（1）采集被检测者的外周血2ml，保存于-20℃冰箱；

（2）采用盐酸胍法从外周血标本中抽提基因组DNA；

（3）使用本检测试剂盒，特异性扩增包含ABCB11基因rs12692889多态位点的DNA片段，并对所获得的DNA片段进行测序，得到rs12692889位点的基因型数据；

（4）根据所得到的rs12692889位点基因型数据对被检测者进行铂类化疗疗效评估。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件进行。

实施例1. 预测晚期NSCLC患者含铂化疗疗效的分子标记。

1、临床样本的采集

研究对象为663名初诊的非小细胞肺癌患者。纳入标准为：病理学确诊的新

发非小细胞肺癌患者；年龄18岁以上；ⅢA-Ⅳ期，病灶可测量；无其它恶性肿瘤史，以往未接受针对非小细胞肺癌的化疗、手术和放疗；接受一线含铂化疗；身体一般状况评分PS 0-2；无主要脏器的功能障碍，血常规、肝肾功能及心脏功能基本正常；能获得完整的随访信息。所有研究对象均为无血缘关系的汉族人群，地理上主要来自上海及其周边地区。所有患者均是首次接受铂类为基础的一线治疗方案。

对上述纳入病患，收集整理其基本信息、临床信息以及治疗信息，并依据知情同意原则签署知情同意书。患者在入组接受两周期治疗后，按照实体瘤疗效评价标准RECIST 1.0版本进行疗效评价（详见附录1），判定标准如下：完全缓解(CR)，部分缓解(PR)，疾病稳定(SD)与疾病进展(PD)。近期客观有效为CR+PR。

2、基因组DNA的抽提

患者化疗前使用EDTA抗凝的采血管收集研究对象的外周静脉血2ml，保存于-20℃冰箱。采用盐酸胍法抽提基因组DNA。

3、SNPs分型

对包含ABCB11基因rs12692889多态位点的DNA片段进行特异性扩增，并对所获得的DNA片段进行测序，得到rs12692889位点的基因型数据。

4、统计分析

以非条件logistic回归模型为rs12692889多态位点计算出优势比（Odds Ratio, OR）及其95%置信区间（95% confidence interval, 95% CI），以此评估该位点多态性对肺癌患者化疗疗效的影响。

5、结果分析 

ABCB11基因rs12692889位点基因型为C/C时，铂类化疗有效率较低，仅

14.2%；基因型为C/T时，有效率为21.7%；基因型为T/T时，有效率为36.8%。C/T与C/C相比，有效率提高了40%；T/T与C/C相比，有效率提高了74%。可见，随着该位点T碱基拷贝数的增加，NSCLC患者铂类化疗的有效率逐渐升高，趋势检验的P值极显著（P=3.09×10^-4，见附录2）。

实施例2. 检测试剂盒的使用。

1、基因组DNA的提取

采用盐酸胍法抽提基因组DNA。

2、分子标记分型

使用检测试剂盒，首先特异性扩增包含ABCB11基因rs12692889多态位点的DNA片段，引物序列如下：正向引物—5’ TCTTTGGCTGTTTGGAAATA 3’（SEQ ID NO.1）；反向引物—5’ GCAACCCTTTAACCAGAAAA 3’（SEQ ID NO.2）。 反应体系（20μl）包含：10 x Taq 缓冲液2μl, 2 mM dNTP 2μl, 1 U Taq 酶1μl，样本DNA(约50 ng) 1 μl和5μM PCR引物1 μl。该扩增反应在PCR扩增仪上进行，反应条件为：95℃ 5分钟；进行30个循环的95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒；72℃ 7分钟；4℃保存。

然后对获得的DNA片段进行测序。具体步骤如下：

 PCR产物纯化。在10μl PCR产物中加入1U虾碱性磷酸酶和1U核酸外切酶，37℃温浴1小时, 然后75℃灭活15分钟。

 测序反应。反应体系（10μl）包含：BigDye v3.1测序试剂及其配套缓冲液（Applied Biosystems），1 μl PCR正向引物（3.2μM）及3 μl纯化产物。该测序反应在PCR扩增仪上进行，反应条件为：96℃ 10秒；进行25个循环的96℃ 10秒，50℃ 5秒，60℃ 4分钟；60℃ 4分钟；4℃保存。

 测序反应产物变性、沉淀。加入1 μl 120mM 乙二胺四乙酸，然后以无水乙醇收集产物，以75%乙醇清洗产物2次，最后加入10 μl 95%甲酰胺溶液，待检测。

 ABI3130XL测序仪上样检测。 

3、基因型分析 

针对上述获得的原始基因型数据，使用Bioedit软件进行判读和分析。

实施例3. 对晚期NSCLC患者进行化疗疗效预测的服务。

1、基因组DNA的提取

收集被检测者外周血标本，采用盐酸胍法抽提基因组DNA。

2、基因分型检测

使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的ABCB11基因rs12692889位点进行分型。

3、个体含铂化疗疗效的预测分析

通过对被检测者rs12692889位点基因型的分析，出具个体铂类药物化疗疗效的评估分析报告单：若基因型为C/C，则有效率为14.2%；若基因型为C/T，则有效率为21.7%；若基因型为T/T，则有效率为36.8%。该结果可供医师参考调整用药方式和剂量。

附录1：疗效评估标准（RESICT）：测量所有靶病灶的最长径, 并计算所有靶病灶的最长径之和, 与基线状态的最长径之和相比, 肿瘤客观疗效评价标准如下： 完全缓解(CR) ——所有靶病灶消失； 部分缓解(PR) ——靶病灶最长径之和与基线状态比较, 至少减少30%； 病变进展(PD) ——靶病灶最长径之和与治疗开始之后所纪录到的最小的靶病灶最长径之和比较, 增加20%, 或者出现一个或多个新病灶； 病变稳定(SD) ——介于部分缓解和疾病进展之间。

附录2：非条件logistic回归模型分析rs12692889位点基因型与NSCLC患者铂类化疗疗效的相关性

基因SNP基因型有效人数/总人数%OR95%CIP趋势检验PABCB11rs12692889C/C54/37914.21  3.09×10^-4  C/T52/24021.70.600.38-0.930.023   T/T14/3836.80.260.12-0.560.001 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  复旦大学

 

<120>  预测晚期非小细胞肺癌铂类化疗疗效的分子标记及其应用

 

<130>  001

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  

 

<400>  1

tctttggctg tttggaaata                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

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<400>  2

gcaacccttt aaccagaaaa                                                 20