一种基于蔗糖纤维模板的载细胞微通道水凝胶的制备方法

摘要

一种基于蔗糖纤维模板的载细胞微通道水凝胶的制备方法，先制备蔗糖纤维，在其表面涂覆一层聚合物膜，然后置于聚甲基丙烯酸甲酯模具中间，再制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合溶液，将溶胶—细胞混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯模具中，改变温度或紫外照射使水凝胶溶胶交联形成水凝胶，于磷酸盐缓冲溶液中溶解掉水凝胶中的蔗糖纤维、蔗糖粉末或聚乙烯吡咯烷酮形成载细胞的微通道水凝胶，在载细胞微通道水凝胶的微通道中通入内皮细胞培养液，培养使内皮细胞生长铺展后形成内皮化的微通道，该方法制备的载细胞微通道水凝胶中微通道结构稳定，内皮细胞不容易脱落，在水凝胶交联过程中能够包裹细胞，微通道形成后注入内皮细胞培养液以形成内皮化的微通道。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，具体涉及一种基于蔗糖纤维模板 的载细胞微通道水凝胶的制备方法。

背景技术

随着人类寿命的增长，临床中对供体器官的需求也在不断增长。 目前，供体器官的严重不足使得许多病人因为不能获得可替代的器官 而死亡。器官缺乏已经成为生物医学领域亟待解决的突出问题，而组 织工程概念的提出和发展为这一问题提供了一种最有潜力的解决方 案。

在组织工程的长足发展过程中，水凝胶得到了越来越多的重视， 也是近些年来组织工程中应用最为广泛的一种生物材料。在组织工程 中，常采用水凝胶作为细胞外基质的模拟物，载有细胞的水凝胶的复 合体系可用于药理和病理模型，也可在体外培养构建成可供临床移植 的组织或器官。不同种类的水凝胶，包括天然和合成水凝胶，已经被 用来构建组织工程化支架或者直接包裹细胞后构建一些较为简单的 组织结构如皮肤、膀胱和软骨等。但是，在构建具有高细胞浓度、细 胞代谢活动旺盛的组织/器官如心脏、肝脏、肾脏时，从表面扩散到 组织内的营养物会很快被细胞耗尽，单纯依靠营养物从表面扩散很难 保证水凝胶内部的细胞获得充足的营养物以及排出代谢产物。营养物 的缺乏和代谢产物的积累均会影响细胞的正常代谢活动以及组织工 程化组织的生理功能，如何加强营养物供应已成为组织工程中亟待解 决的问题之一。

近些年的研究表明，通过在水凝胶中引入微通道网络，可以有效 的提高水凝胶中营养物的输送能力和调控细胞的化学微环境，模拟人 体血管的结构和功能。目前，一些生物微制造技术，如模板法、生物 打印技术、基于光图形化的方法和模块组装法等，已经被用来在不同 的载细胞水凝胶中构造微通道，通过在微通道中种内皮细胞可以形成 内皮化通道。但是，受水凝胶力学性能及细胞生长的影响，载细胞水 凝胶中的微通道在结构上通常并不稳定，存在微通道容易堵塞、裂开 或坍塌，内皮细胞容易脱落；另外，粘附在微通道表面的内皮细胞和 微通道中的大分子异物有可能侵入水凝胶内部，影响细胞的正常生长 和功能表达。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于 蔗糖纤维模板的载细胞微通道水凝胶的制备方法，通过该方法制备的 载细胞微通道水凝胶中微通道结构稳定，内皮细胞不容易脱落，在水 凝胶交联过程中能够包裹细胞，微通道形成后注入内皮细胞培养液能 够形成内皮化的微通道。

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

方案1

一种基于蔗糖纤维模板的载细胞微通道水凝胶的制备方法，包括 以下步骤：

第一步，制备蔗糖纤维，作为构建微通道的模板，将蔗糖晶体加 热至焦化温度以上使之完全熔化，冷却至150～180℃后，用外径 2mm的不锈钢圆管往上牵引蔗糖熔体，控制牵引的速度为0.1～ 1.0m/s，使蔗糖纤维的直径在10μm～1mm，制备好的蔗糖纤维储 存于干燥罐中；

第二步，在蔗糖纤维表面涂覆一层厚度为20～100μm的聚合物 溶液，蘸涂的聚合物溶液中聚合物浓度为2～10wt％，聚合物为质量 比为1～4∶1的聚左乳酸(PLLA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚 乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，溶剂为二氯 甲烷、三氯甲烷或1，4-二氧六环，室温下待纤维表面聚合物层的溶剂 完全挥发后，置于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具中间；

第三步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶 剂按质量比0～1∶3～30∶100混合均匀配置成水凝胶溶胶，光引发 剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮或艳固佳2959，水凝胶单体为琼脂糖、胶 原、透明质酸、壳聚糖、海藻酸纳、聚乙烯醇或聚乙二醇及其衍生物， 水凝胶溶剂为去离子水、纯水或PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS) 缓冲溶液；

第四步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第三步中制 备的水凝胶溶胶与细胞浓度为10⁵～10⁷Cells/mL的细胞培养液按体 积比1～4∶1混合均匀，细胞培养液中的细胞为软骨细胞、造骨细胞、 骨髓基质细胞、肝细胞、成纤维细胞、心肌细胞、间充质干细胞、胚 胎干细胞、脂肪干细胞或神经前体细胞；

第五步，将涂覆聚合物层的蔗糖纤维包裹在水凝胶中，将第四步 制备的混合液倒入第二步准备好的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模 具中，通过改变温度或紫外照射使之交联形成载细胞的水凝胶；

第六步，将载细胞的水凝胶中的蔗糖纤维和聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)于PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液中溶解掉， 在载细胞的水凝胶中形成带有聚合物内层的微通道结构；

第七步，在载细胞水凝胶的微通道中注入细胞浓度为10⁵～ 10⁷cells/mL的内皮细胞培养液0.1～1mL，培养使内皮细胞生长铺 展，最终形成内皮化的微通道。

本发明还可以通过下面的方法来实现：

方案2

一种基于蔗糖纤维模板的载细胞微通道水凝胶的制备方法，包括 以下步骤：

第一步，制备蔗糖纤维，作为构建微通道的模板，将蔗糖晶体加 热至焦化温度以上使之完全熔化，冷却至150～180℃后，用外径 2mm的不锈钢圆管往上牵引蔗糖熔体，控制牵引的速度为0.1～1.0 m/s，使蔗糖纤维的直径在10μm～1mm，制备好的蔗糖纤维储存于 干燥罐中；

第二步，在蔗糖纤维表面涂覆一层厚度为20～100μm的聚合物 溶液，蘸涂的聚合物溶液中聚合物浓度为5～15wt％，聚合物为质量 比为1～4∶1的聚氨酯和蔗糖粉末，溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或 1，4-二氧六环，蔗糖粉末的粒径为1～10μm，室温下待溶剂完全挥发 及聚氨酯固化交联后，置于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具中间；

第三步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶 剂按质量比0～1∶3～30∶100混合均匀配置成水凝胶溶胶，光引发 剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮或艳固佳2959，水凝胶单体为琼脂糖、胶 原、透明质酸、壳聚糖、海藻酸纳、聚乙烯醇或聚乙二醇及其衍生物， 水凝胶溶剂为去离子水、纯水或PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS) 缓冲溶液；

第四步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第三步中制 备的水凝胶溶胶与细胞浓度为10⁵～10⁷cells/mL的细胞培养液按体 积比1～4∶1混合均匀，细胞培养液中的细胞为软骨细胞、造骨细胞、 骨髓基质细胞、肝细胞、成纤维细胞、心肌细胞、间充质干细胞、胚 胎干细胞、脂肪干细胞或神经前体细胞；

第五步，将涂覆聚合物的蔗糖纤维包裹在水凝胶中，将第四步制 备的混合液倒入第二步准备好的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具 中，通过改变温度或紫外照射使之交联形成载细胞的水凝胶；

第六步，将载细胞的水凝胶中的蔗糖纤维和蔗糖粉末于PH值为 5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液中溶解掉，在载细胞的水凝胶中 形成带有聚合物内层的微通道结构；

第七步，在载细胞水凝胶的微通道中注入细胞浓度为10⁵～ 10⁷cells/mL的内皮细胞培养液0.1～1mL，培养使内皮细胞生长铺 展，最终形成内皮化的微通道。

本方法使用聚合物包覆的蔗糖纤维作为模板，简单易行，效率高， 微通道的稳定性好；水凝胶交联过程中能够包裹细胞，而聚合物内层 的引入既可以维持水凝胶中微通道的稳定性，同时也可以防止内皮细 胞及外部大分子异物侵入水凝胶内部；另外，不同的蔗糖纤维能够在 改变湿度或温度的情况下交叉融合，使得本方法也具有快速构造复杂 的三维载细胞微通道水凝胶的潜力。

具体实施方式

下面结合具体实施实例对本发明进行详细说明：

实施例1

一种基于蔗糖纤维模板的载细胞微通道水凝胶的制备方法，包括 以下步骤：

第一步，制备蔗糖纤维，作为构建微通道的模板，将蔗糖晶体加 热至焦化温度以上使之完全熔化，冷却至150～180℃后，用外径 2mm的不锈钢圆管往上牵引蔗糖熔体，控制牵引的速度为0.1～1.0 m/s，使蔗糖纤维的直径在10μm～1mm，制备好的蔗糖纤维储存于 干燥罐中；

第二步，在蔗糖纤维表面涂覆一层厚度为20～100μm的聚合物 溶液，蘸涂的聚合物溶液中聚合物浓度为4wt％，聚合物为质量比为 2∶1的聚左乳酸(PLLA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，溶剂为三氯甲 烷，室温下待纤维表面聚合物层的溶剂完全挥发后，置于聚甲基丙烯 酸甲酯(PMMA)模具中间；

第三步，制备水凝胶溶胶，将水凝胶单体和水凝胶溶剂按质量比 3∶100混合均匀配置成水凝胶溶胶，水凝胶单体为琼脂糖，水凝胶 溶剂为PH值为5.7～8.0的PBS缓冲溶液；

第四步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第三步中制 备的水凝胶溶胶与细胞浓度为3×10⁶cells/mL的细胞培养液按体积 比2∶1在40℃混合均匀，细胞培养液中的细胞为成纤维细胞；

第五步，将涂覆聚合物层的蔗糖纤维包裹在水凝胶中，将第四步 制备的混合液倒入第二步准备好的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模 具中，于4℃冰箱中放置15min，通过改变温度使琼脂糖溶胶交联形 成载细胞的水凝胶；

第六步，将载细胞的水凝胶中的蔗糖纤维和聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)于PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液中溶解掉， 在载细胞的水凝胶中形成带有聚合物内层的微通道结构；

第七步，在载细胞水凝胶的微通道中注入细胞浓度为2×10⁶cells/ml的内皮细胞培养液0.2mL，培养使内皮细胞生长铺展，最终 形成内皮化的微通道。

实施例2

一种基于蔗糖纤维模板的载细胞微通道水凝胶的制备方法，包括 以下步骤：

第一步，制备蔗糖纤维，作为构建微通道的模板，将蔗糖晶体加 热至焦化温度以上使之完全熔化，冷却至150～180℃后，用外径 2mm的不锈钢圆管往上牵引蔗糖熔体，控制牵引的速度为0.1～1.0 m/s，使蔗糖纤维的直径在10μm～1mm，制备好的蔗糖纤维储存于 干燥罐中；

第二步，在蔗糖纤维表面涂覆一层厚度为20～100μm的聚合物 溶液，蘸涂的聚合物溶液中聚合物浓度为4wt％，聚合物为质量比为 1∶1的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)， 溶剂为三氯甲烷，室温下待纤维表面聚合物层的溶剂完全挥发后，置 于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具中间；

第三步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶 剂按质量比0.5∶30∶100混合均匀配置成水凝胶溶胶，光引发剂为 2-羟基-2-甲基苯丙酮，水凝胶单体为聚乙二醇二甲基丙烯酸酯 (PEG-DMA)，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓 冲溶液；

第四步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第三步中制 备的水凝胶溶胶与细胞浓度为3×10⁶cells/mL的细胞培养液按体积 比1∶1在40℃混合均匀，细胞培养液中的细胞为平滑肌细胞；

第五步，将涂覆聚合物层的蔗糖纤维包裹在水凝胶中，将第四步 制备的混合液倒入第二步准备好的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模 具中，紫外光照射3min使之交联形成载细胞的水凝胶；

第六步，将载细胞的水凝胶中的蔗糖纤维和聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)于PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液中溶解掉， 在载细胞的水凝胶中形成带有聚合物内层的微通道结构；

第七步，在载细胞水凝胶的微通道中注入细胞浓度为2×10⁶cells/ml的内皮细胞培养液0.2mL，培养使内皮细胞生长铺展，最终 形成内皮化的微通道。

实施例3

一种基于蔗糖纤维模板的载细胞微通道水凝胶的制备方法，包括 以下步骤：

第一步，制备蔗糖纤维，作为构建微通道的模板，将蔗糖晶体加 热至焦化温度以上使之完全熔化，冷却至160～180℃后，用外径 2mm的不锈钢圆管往上牵引蔗糖熔体，控制牵引的速度为0.1～1.0 m/s，使蔗糖纤维的直径在10μm～1mm，制备好的蔗糖纤维储存于 干燥罐中；

第二步，在蔗糖纤维表面涂覆一层厚度为20～100μm的聚合物 溶液，蘸涂的聚合物溶液中聚合物浓度为8wt％，聚合物为质量比为 2∶1的聚氨酯和蔗糖粉末，溶剂为1，4-二氧六环，蔗糖粉末的粒径为 5μm，室温下待溶剂完全挥发及聚氨酯固化交联后，置于聚甲基丙烯 酸甲酯(PMMA)模具中间；

第三步，制备水凝胶溶胶，将水凝胶的单体和水凝胶溶剂按质量 比3∶100混合均匀配置成水凝胶溶胶，水凝胶单体为琼脂糖，水凝 胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液；

第四步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第三步中制 备的水凝胶溶胶与细胞浓度为3×10⁶cells/mL的细胞培养液按体积 比2∶1在40℃混合均匀，细胞培养液中的细胞为软骨细胞；

第五步，将涂覆聚合物层的蔗糖纤维包裹在水凝胶中，将第四步 制备的混合液倒入第二步准备好的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模 具中，于4℃冰箱中放置15min，通过改变温度使琼脂糖溶胶交联形 成载细胞的水凝胶；

第六步，将载细胞的水凝胶中的蔗糖纤维和蔗糖粉末于PH值为 5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液中溶解掉，在载细胞的水凝胶中 形成带有聚合物内层的微通道结构；

第七步，在载细胞水凝胶的微通道中注入细胞浓度为2×10⁶cells/ml的内皮细胞培养液0.2mL，培养使内皮细胞生长铺展，最终 形成内皮化的微通道。

实施例4

一种基于蔗糖纤维模板的载细胞微通道水凝胶的制备方法，包括 以下步骤：

第一步，制备蔗糖纤维，作为构建微通道的模板，将蔗糖晶体加 热至焦化温度以上使之完全熔化，冷却至160～180℃后，用外径 2mm的不锈钢圆管往上牵引蔗糖熔体，牵引的速度为0.1～1.0m/s， 使蔗糖纤维的直径在10μm～1mm，制备好的蔗糖纤维储存于干燥 罐中；

第二步，在蔗糖纤维表面涂覆一层厚度为20～100μm的聚合物 溶液，蘸涂的聚合物溶液中聚合物浓度为10wt％，聚合物为质量比 为1∶1的聚氨酯和蔗糖粉末，溶剂为1，4-二氧六环，蔗糖粉末的粒 径为5μm，室温下待溶剂完全挥发及聚氨酯固化交联后，置于聚甲 基丙烯酸甲酯(PMMA)模具中间；

第三步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶的单体和水凝胶 溶剂按质量比1∶30∶100混合均匀配置成水凝胶溶胶，光引发剂为 2-羟基-2-甲基苯丙酮，水凝胶单体为聚乙二醇二甲基丙烯酸酯 (PEG-DMA)，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓 冲溶液；

第四步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第三步中制 备的水凝胶溶胶与细胞浓度为3×10⁶cells/mL的细胞培养液按体积 比1∶1在40℃混合均匀，细胞培养液中的细胞为肝细胞；

第五步，将涂覆聚合物层的蔗糖纤维包裹在水凝胶中，将第四步 制备的混合液倒入第二步准备好的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模 具中，紫外光照射3min使之交联形成载细胞的水凝胶；

第六步，将载细胞的水凝胶中的蔗糖纤维和蔗糖粉末于PH值为 5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液中溶解掉，在载细胞的水凝胶中 形成带有聚合物内层的微通道结构；

第七步，在载细胞水凝胶的微通道中注入细胞浓度为2×10⁶cells/ml的内皮细胞培养液0.2mL，培养使内皮细胞生长铺展，最终 形成内皮化的微通道。