五种检疫性线虫传多面体病毒多重检测用引物及其应用

摘要

本发明提供了一种五种检疫性线虫传多面体病毒(南芥菜花叶病毒、桃丛簇花叶病毒、番茄环斑病毒、番茄黑环病毒、烟草环斑病毒)多重RT-PCR检测用引物及其应用，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1～6所示。本发明还进一步提供了检测五种检疫性线虫传多面体病毒的方法，该方法以样品总RNA为模板，利用本发明特异性引物进行RT-PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果。本发明引物特异性好，检测方法快速准确，为进出口安全提供了保证。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及五种检疫性线虫传多 面体病毒(Nepovirus)多重RT-PCR检测用引物及其应用。

背景技术

线虫传多面体病毒属(Nepovirus)是类小RNA病毒目 (Picornavirales)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、豇豆花叶病毒亚 科(Comovirinae)中的一个病毒属，包含亚组A、B和C等3个亚 组，至少有34种病毒。线虫传多面体病毒广泛分布于温带地区，有 些病毒种类具有非常广泛的自然寄主，对农业安全生产造成重大威 胁。12种病毒通过长针线虫(剑线虫属Xiphinema、长针线虫属 Longidorus、或拟长针线虫属Paralongidorus spp)持久性传播、3种 通过花粉传播，一种通过螨类传播，其他种类还没有发现传播介体。 在线虫传多面体病毒中，种子和/或花粉传播非常普遍，已报道21 种病毒可以通过种子传播。根据2007年公布的《中华人民共和国进 境植物检疫性有害生物名录》，该病毒属中被列为检疫性病毒的种类 有：南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)、桃丛簇花叶病毒 (Peach rosette mosaic virus，PRMV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot  virus，TRSV)、番茄黑环病毒(Tomato black ring virus，TBRV)、番茄 环斑病毒(Tomato ringspot virus，ToRSV)，共5种。目前，已建立了 针对南芥菜花叶病毒、桃丛簇花叶病毒、烟草环斑病毒、番茄黑环 病毒、番茄环斑病毒等单个病毒的RT-PCR检测方法，以及同时检 测ToRSV和TRSV等2种病毒的多重RT-PCR检测方法(薛杨等， 2005；吴兴海等，2006)，Digiaro等(2007)建立了亚组A的TRSV、 GFLV、ArMV、GDefV等4种病毒的多重RT-PCR，亚组B的GCMV、 AILV、GARSV和TBRV等4种病毒的多重RT-PCR，但还未见报道 针对我国5种检疫性线虫传多面体病毒的多重RT-PCR检测方法。 本申请发明人根据5种检疫性线虫传多面体病毒RNA1编码的依赖 于RNA的RNA聚合酶基因(RNA-dependent RNA polymerase gene， RdRp)序列设计5条特异性引物，并在其下游区域的保守区域设计 一条可用于5种检疫性线虫传多面体病毒的简并引物，通过反转录 (reverse transcription，RT)和聚合酶链式反应技术(polymerase chain  reaction，PCR)建立了ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV、TRSV的多 重RT-PCR检测方法，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置 判定结果。本发明所建立的多重RT-PCR方法可以同时检测5种检 疫性线虫传多面体病毒，极大提高检测效率，降低检测成本，满足 多目标检测要求。

发明内容

本发明目的在于提供用于ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV和 TRSV等五种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR检测的引物序 列及其应用。

本发明通过分析已报道的ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV和 TRSV等5种检疫性线虫传多面体病毒RNA1上的RdRp基因序列设 计5条特异性引物，并在其下游区域的保守区域设计一条可用于5 种检疫性线虫传多面体病毒的简并引物。所述的引物对由5条正向 引物和1条反向引物组成，其5条正向引物序列为ArMV-342：如 SEQ ID NO：1所示，即为5’-TCC TGT GAG TAA TCA GCA GC-3’、 PRMV-293：如SEQ ID NO：2所示，即为5’-CGC CGC TCTATT TGT  GGT-3’、TBRV-256：如SEQ ID NO：3所示，即为5’-TTG TGG TTT  GCC CTC TGG A-3’、ToRSV-472：如SEQ ID NO：4所示，即为5’- GGA CGG ACA TTT ATC AGC G-3’、TRSV-695：如SEQ ID NO：5 所示，即为5’-GAT GAA TTG CTT GTG GAA CGT-3’；1条反向引 物序列为Nep-21R：如SEQ ID NO：1所示，即为5’-YTT RTC MBT  VCC ATC MGT AAT-3’，其中，Y＝C/T，V＝G/A/C，R＝A/G，B＝G/T/C， M＝A/C。

本发明还进一步给出了应用上述引物的多重RT-PCR检测方法， 其以样品总RNA为模板，进行多重RT-PCR扩增，反应结束后根据 特异性扩增的DNA片段判定结果。

较佳地，RT-PCR的反应过程中反转录反应的温度为42℃，PCR 扩增的退火温度为52℃，延伸温度为72℃。

其中，ArMV扩增的DNA片段大小为342bp、PRMV为293bp、 TBRV为256bp、ToRSV为472bp和TRSV为695bp。

具体地说本发明以样品总RNA为模板，进行RT-PCR反应。 RT-PCR反应包括反转录和PCR扩增两个过程。

首先在25μL反应体系进行反转录反应，即在0.6mL的反应管 中加入4.0μL RNA，2μL Nep-21R(10μmol/L)，5.0μL DEPC处理 水，70℃水浴5min，立即冰浴5min后，加入5μL 5×M-MLV  buffer，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，1μL dNTP(各10 mmol/L)，0.5μL Ribolock^TM RNase Inhibitor，补充DEPC处理水至 25μL，轻轻混匀后42℃水浴1h，70℃灭活10min，合成第一链 cDNA，-20℃保存备用。

PCR反应体系为25μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入2.0μL cDNA，1.0μL上游引物(10μmol/L)，1.0μL下游引物(10μmol/L)， 0.2μL DreamTaq^TM DNA Polymerase，2.5μL 10×DreamTaq^TM PCR  buffer，0.5μL dNTP Mixture(各10mmol/L)，17.80μL灭菌水。反 应条件如下：95℃ 3min；94℃ 45s，52℃ 45s，72℃ 1min， 35个循环；最后72℃延伸10min。取5μL的PCR产物采用2.0％ 的琼脂糖凝胶电泳电泳检测。

进一步，还可以将本发明引物及相关试剂组装成试剂盒，以方 便使用。

所述的引物在五种检疫性线虫传多面体病毒多重检测中的应用 不限于以上所述，例如可以加入其它辅助手段进行联合检测。

本发明根据五种检疫性线虫传多面体病毒RNA1上RdRp基因 序列设计引物，该组引物可用于ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV、 TRSV等五种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR检测。本发明检 测方法能够快速准确地判断样品是否有检疫性线虫传多面体病毒 (ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV、TRSV)，为进出口安全提供了 保证。

附图说明

图1是ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV、TRSV等五种检疫性 线虫传多面体病毒单重及多重RT-PCR方法检测结果。1为空白对照， 2-6分别为TBRV、PRMV、ArMV、ToRSV和TRSV的单重RT-PCR 扩增结果，7为五种检疫性线虫传多面体病毒的多重RT-PCR检测结 果。

图2是ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV、TRSV等五种检疫性 线虫传多面体病毒多重RT-PCR方法的特异性试验结果。1为阳性对 照，2-11分别为同属病毒蓝莓叶斑驳病毒(BLMoV)、樱桃卷叶病 毒(CLRV)、葡萄扇叶病毒(GFLV)、悬钩子环斑病毒(RpRSV) 以及葡萄、黄瓜、桃子、菜豆、普通烟、苋色藜等健康寄主叶片。

图3是ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV、TRSV等五种检疫性 线虫传多面体病毒多重RT-PCR方法的灵敏度试验结果。M：100bp  DNA Marker；1：5⁰倍稀释；2：5^-1倍稀释；3：5^-2倍稀释；4：5^-3倍稀释；5：5^-4倍稀释；6：5^-5倍稀释；7：5^-6倍稀释；8：空白对照。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明 的范围。

实施例15种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR方法的建立

1.引物设计和合成

根据5种检疫性线虫传多面体病毒RNA1上的RdRp基因序列 保守区域设计5条特异性引物，并在其下游区域的保守区域设计一条 可用于5种检疫性线虫传多面体病毒的简并引物。

特异引物(正向)序列为：

ArMV-342(SEQ ID NO：1)：5’-TCC TGT GAG TAA TCA GCA GC-3’

PRMV-293(SEQ ID NO：2)：5’-CGC CGC TCT ATT TGT GGT-3’

TBRV-256(SEQ ID NO：3)：5’-TTG TGG TTT GCC CTC TGG A-3’

ToRSV-472(SEQ ID NO：4)：5’-GGA CGG ACA TTT ATC AGC G-3’

TRSV-695(SEQ ID NO：5)：5’-GAT GAA TTG CTT GTG GAA CGT-3’

简并引物(反向)序列为：

Nep-21R(SEQ ID NO：6)：5’-YTT RTC MBT VCC ATC MGT AAT-3’

其中，Y＝C/T，V＝G/A/C，R＝A/G，B＝G/T/C，M＝A/C。

2.总RNA的提取

1)取0.1g发病叶片，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5ml 离心管中，然后加入1ml的Trizol试剂，剧烈震荡摇匀；

2)室温下保持5min，加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，然后 在室温下保持10min后，4℃，12000g离心15min；

3)将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇， 颠倒混匀，室温下保持10min；

4)4℃，12000g离心10min，RNA就会在管的侧壁和底部形 成沉淀；

5)倒掉上清液，加入1ml 75％的乙醇洗涤沉淀，然后4℃，7500 g离心5min(如沉淀悬浮起来，则用12000g)，弃去乙醇；

6)沉淀于室温下充分干燥后，溶于40μL dH₂O(DEPC处理) 中，55℃水浴10min后，-20℃保存备用。

3.5种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR扩增方法的建立

以总RNA为模板，进行RT-PCR反应。即在0.6mL的反应管 中加入4.0μL RNA，2μL Nep-21R(10μmol/L)，5.0μL DEPC处理 水，70℃水浴5min，立即冰浴5min后，加入5μL 5×M-MLV  buffer，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，1μL dNTP(各10 mmol/L)，0.5μL Ribolock^TM RNase Inhibitor，补充DEPC处理水至 25μL，轻轻混匀后42℃水浴1h，70℃灭活10min，合成第一链 cDNA，-20℃保存备用。

PCR反应体系为25μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入2.0μL  cDNA，2.5μL 10×引物混合物(9.6μM Nep-21R，2.4μM TBRV-256， 2.4μM PRMV-293，1.6μM ArMV-342，1.6μM ToRSV-472和1.6μM  TRSV-695)，0.4μL DreamTaq^TM DNA Polymerase，2.5μL 10× DreamTaq^TM PCR buffer，0.5μL dNTP Mixture(各10mmol/L)，17.10 μL灭菌水。反应条件如下：95℃ 3min；94℃ 45s，52℃ 45s， 72℃ 1min，40个循环；最后72℃延伸10min。取5μL的PCR 产物采用2.0％的琼脂糖凝胶电泳电泳检测。

PCR反应结束后根据特异性扩增的DNA片段判定样品中是否 含有检疫性线虫传多面体病毒。其中，ArMV扩增的DNA片段大小 为342bp、PRMV为293bp、TBRV为256bp、ToRSV为472bp和 TRSV为695bp。

实施例25种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR方法的特异性 确定

取BLMoV、CLRV、GFLV、RpRSV等同属病毒的阳性样品以 及健康寄主葡萄、黄瓜、桃子、菜豆、普通烟、苋色藜叶片，按实 施例2方法分别提取总RNA，再按实施例3的方法进行RT-PCR扩 增，凝胶电泳检测结果。其中，阳性对照可以特异扩增出预期大小 的目的条带。分别为ArMV为342bp、PRMV为293bp、TBRV为 256bp、ToRSV为472bp和TRSV为695bp，而同属病毒阳性对照 以及健康寄主均未扩增出非特异性条带，检测结果如图2所示。表 明建立的多重RT-PCR方法具有良好的特异性，可用于五种检疫性 线虫传多面体病毒属病毒的检测。

实施例35种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR方法的灵敏度 确定

按照实施例2方法分别提取总RNA，再按实施例3的方法进行反转 录，将cDNA模板进行5倍系列稀释，进行多重RT-PCR灵敏性检测。 检测结果如图3所示。表明建立的多重RT-PCR方法的检测灵敏性可以 达到5^-3倍，符合检测的要求。