一种高效异养硝化细菌筛选方法、筛选的菌株及其菌剂的制备方法

摘要

本发明提供了一种高效异养硝化细菌筛选方法、筛选的菌株及其菌剂的制备方法。本发明将选择因子作为富集培养过程中选择压力，淘汰非目标菌群，建立了一种快速、高效获得目标菌株的方法。利用该筛选方法从实验样品中筛选出了一株高效降解亚硝酸盐的菌株，鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏编号为：CGMCC NO.4918。其可以利用亚硝酸盐作为唯一的氮源进行生长繁殖，对环境有较强的适应能力，在实际工程应用中有较大的发展潜力。本发明还公开了以该菌株制备水质净化微生物制剂的生产方法，生产出的菌剂可用于污水处理、水产养殖、水族箱或流动水系等水治理工程。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效异养硝化细菌筛选方法、筛选的菌株以及菌剂的制备方法，生产出 的水质净化微生物制剂可用于污水处理、水产养殖、水族箱或流动水系等水治理工程，属于 利用微生物对污水治理的技术领域。

背景技术

近年来，亚硝酸盐对人和动物毒性己引起重视，对亚硝酸盐中毒的病理学的研究很多。 动物亚硝酸盐中毒最明显的特征是，血液中高铁血红蛋白(MHb)的含量升高，红细胞的载 氧能力下降，造成组织缺氧，神经麻痹，甚至窒息死亡，国外称之为“褐血症”(Brown Blood)。 亚硝酸盐对人类健康的影响集中于二点，一是可引起高铁血红朊症，二是亚硝酸盐在人体内 形成有致癌危害的亚硝胺。

亚硝酸盐是氨转化为硝酸盐过程中的中间产物，在养殖水体中由于大量的投饵而留下的 残饵、水体中水生动物的大量排泄物的累积和定期使用的消毒药剂，把有害和有益的细菌同 时大量杀灭，氧气的供应不足，造成大量累积的氨氮硝化过程受阻，形成养殖时水中氨氮和 亚硝酸氮含量高。据长期在各地养殖塘的监测，发现有50％以上的养殖鱼塘会出现亚硝酸盐 含量超标，国外也有提到亚硝酸盐积累是常见的水质现象。更值得重视的是水中亚硝酸盐含 量超标目前已成为鱼虾养殖水质调控最棘手的问题。现在，控制亚硝酸盐水平是水产养殖的 重要工作方向。解决好水产养殖亚硝态氮问题，将会促进我国经济和环境保护方面的可持续 性发展。

传统对亚硝态氮的处理主要有换水法、化学氧化法及物理吸附法等，但都存在治标不治 本或产生二次污染的问题。微生物修复指利用微生物的生命代谢活动降低环境中的有毒有害 物质的浓度使其无害化，从而使被污染的环境能够部分或完全恢复到初始状态的过程，具有 效果好、投资少、安全性高等特点。目前已报道的亚硝酸盐降解菌主要有硝化杆菌属 (Nitrobacter sp.)、硝化螺菌属(Nitrospira sp.)和硝化球菌属(Nitrococcus sp.)等。但该类 菌均为专性化能自养菌，对底物的要求专一性很强，严格好氧，且其生长缓慢，平均世代时 间在10h以上。正是这些菌的自身特性所局限，目前国内外亚硝酸盐降解菌菌剂的开发和使 用程度较低，国外的产品价格比较昂贵，且主要用于水族箱等观赏水生生物的养殖。但近来 的研究表明，有些异养微生物也能进行硝化作用，如脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、 粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)和红球菌(Rhodococcus sp.)等。 与自养硝化细菌相比，异养硝化细菌具有生长速率快、要求溶解氧浓度低、能耐受更酸环境 的优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对高浓度亚硝酸盐的耐受能力强、亚硝酸盐去除率高的异养 硝化细菌的筛选方法、筛选得到的菌株以及以该菌株制备水质净化微生物制剂的生产方法。 该方法所得到的异养硝化细菌——经中国科学院微生物研究所鉴定为蜡状芽孢杆菌，能够较 快的适应环境，生长速率高，对低浓度和高浓度含亚硝酸盐的污水均有很强的降解能力。本 发明以上述蜡状芽孢杆菌为出发菌株所制得的水质净化微生物制剂，活菌数高，发酵周期短， 发酵工艺简便。所制得的产品能有效的缓解养殖水体中亚硝酸盐超标的现状，降低环境污染。

一种高效异养硝化细菌筛选方法，包括以下步骤：

(1)配制硝化细菌富集培养基，对菌种进行扩培和驯化：

所用富集培养基配方如下：葡萄糖5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.05g、FeSO₄·7H₂O 0.02g、CaCl₂0.01g、NaNO₂0.1～2g、水1L，pH7.2；将10ml含异养硝化细菌的活性污泥接种 于90ml富集培养基中，在30℃、180r/min的条件下恒温震荡培育，1～2d后，取上清液5ml 加至100ml新鲜的富集培养基中相同条件下培养，如此反复5次；每次逐渐提高培养液中 NaNO₂的浓度，其中NaNO₂初始浓度为0.1g/L，然后提高至0.5g/L、1g/L、1.5g/L，最终浓 度为2g/L；

(2)将富集培养后的菌株转至平板培养，分离纯化，获得降解率高的菌株。

一株高效异养硝化细菌是蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏编号为：CGMCC NO. 4918。

一种水质净化微生态制剂的制备方法：以所述蜡状芽孢杆菌为出发菌株，经过摇床种子 培养和液体发酵进行制备。

采用LB培养基，30℃，培养24h，获取新鲜斜面菌种用于种子培养。

所述摇床种子培养条件为pH 7.2、温度30℃，转速180～200r/min，培养10～12h；培养 基的组成为葡萄糖5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄.7H₂O 0.05g、FeSO₄.7H₂O 0.02g、CaCl₂0.01g、 NaNO₂0.5g、H₂O 1L。

所述液体发酵条件为：20L罐装量为12L，搅拌速度200～220r/min，初始pH 7.0～7.2，通 气量1∶(0.9～1)，接种量3％(接种摇床种子培养液)，28～30℃温度下发酵24～28h；培养基组 成为：玉米粉15g/L，豆粕粉10g/L，酵母粉6g/L，NaCl 5g/L，MgSO₄.7H₂O 1g/L，K₂HPO₄2g/L，MnSO₄.H₂O 0.05g/L，CaCO₃ 0.01g/L，其余为水。

本发明的异养硝化细菌筛选方法按照下述具体步骤进行：

一、采集含有土著异养硝化细菌的样品：实验中的样品采集于湖南省长沙市某小龙虾养 殖基地，采集点为塘边3cm深的潮湿活性污泥。

二、配制硝化细菌富集培养基，对菌种进行扩培和驯化：

所用富集培养液主要组分为无机盐，包括微量元素Fe、Mg、Ca等，配方如下：葡萄糖 5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄.7H₂O 0.05g、FeSO₄.7H₂O 0.02g、CaCl₂0.01g、NaNO₂0.1～2g、水 1L，pH7.2。其中微量元素Fe是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的组成部分，亦是 菌体氧代谢不可或缺的元素，该配方中以FeSO₄.7H₂O的形式加入；Mg参与多种辅酶和激活 因子的合成，其对ATP酶有激活作用，可促进细胞内ATP的生成，从而加快菌体的生长，该 培养基中以MgSO₄.7H₂O的形式加入；Ca是一些酶的激活剂，并且参与多种信号传导过程， 该配方中以CaCl₂的形式加入。NaNO₂是该培养基中的唯一氮源，同时亦为细菌的生长提高 能源。

将10ml活性污泥接种于90ml富集培养基中，在30℃、180r/min的条件下恒温震荡培育 1～2d后，利用盐酸萘乙二胺分光光度法(GB/T 5009.33-2008)测剩余亚硝酸盐的浓度，当亚 硝酸盐浓度降到10mg/L以下时，取上清液5ml加至100ml新鲜富集培养基中相同条件培养， 如此反复5次。每次逐渐提高培养液中NaNO₂的浓度，其中NaNO₂初始浓度为0.1g/L，然后 提高至0.5g/L、1g/L、1.5g/L，最终浓度为2g/L。

本发明将NaNO₂作为选择因子作为富集培养过程中选择压力，淘汰非目标菌群，通过逐 渐提高培养液NaNO₂浓度的方法进行富集，其中NaNO₂初始浓度为0.1g/L，最终浓度为2g/L。 本发明方法可使污泥中的碳化菌等杂菌的生长明显受到抑制，有利于硝化细菌成为优势菌群， 并耐受越来越高的亚硝酸盐浓度，最终达到处理浓度高达2g/L的亚硝酸盐废水，使污水中高 浓度亚硝酸盐能够降到0.2mg/L以下。

三、将富集培养后的菌种转至平板培养，分离纯化，以降解率高的菌为优选菌：

富集驯化完成后，取1ml富集培养液以10^-1梯度进行稀释直到10^-7，将各稀释度的菌液涂 布到异养硝化固体培养基上，于恒温培养箱中30℃培养1～2d，挑取形态不同的菌落进行分离 纯化。将分离纯化后的菌株分别挑取1环接种于100ml亚硝酸盐初始浓度为1g/L的异养硝化 培养基中，30℃、180r/min摇床震荡培养24h。菌液在离心机中(5000r/min)离心3min以去 除菌体，利用盐酸萘乙二胺分光光度法(GB/T 5009.33-2008)测其对亚硝酸盐的去除率。将 富集培养物通过多次平板涂布分离，获得1株亚硝酸盐降解效果较好的菌株，接种于LB斜 面上，编号为N419，4℃冰箱中保存。

把降解菌株送至中科院微生物研究所进行菌种鉴定，根据显微形态、生理生化特征 (结果见表1)、16S rRNA基因序列等实验数据，该菌株的鉴定结果为：蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)，并于2011年5月30日在中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心进行了保藏，蜡状芽孢杆菌N419(Bacillus cereus)，保藏号为CGMCC No.4918。本发明筛选所得的异养硝化细菌CGMCC NO.4918可以利用亚硝酸盐作为唯一 的氮源进行生长繁殖，不但能处理低浓度亚硝酸盐，而且对于高浓度的亚硝酸盐去除效 果也非常理想。而且异养硝化细菌相对于自养硝化细菌具有世代周期短，生长繁殖快， 对环境适应能力强的特点，在实际工程应用中有较大的发展潜力。

表1细胞形态和理化试验结果

以上述蜡状芽孢杆菌为出发菌株制备水质净化微生物制剂：

新鲜斜面菌种制备的工艺条件为：LB培养基，30℃，24h。

摇床菌种培养的工艺条件为：pH 7.2、温度30℃，转速180～200r/min，培养10～12h；培 养基的组成为葡萄糖5g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄.7H₂O 0.05g、FeSO₄.7H₂O 0.02g、CaCl₂0.01g、 NaNO₂0.5g、H₂O 1L。

液体发酵条件为：20L罐装量为12L，搅拌速度200～220r/min，初始pH 7.0～7.2，通气量： 1∶(0.9～1)，接种量3％(接种摇床种子培养液)，28～30℃温度下发酵24～28h；培养基组成为： 玉米粉15g/L，豆粕粉10g/L，酵母粉6g/L，NaCl 5g/L，MgSO₄.7H₂O 1g/L，K₂HPO₄ 2g/L， MnSO₄.H₂O 0.05g/L，CaCO₃ 0.01g/L，其余为水。液体发酵后得到的液体就是所需的产品— —水质净化微生物制剂。

该生产方法发酵周期短，发酵流程为3步，菌剂中活菌数可达1.0×10¹⁰cfu/ml，可直接 应用于废水处理。

附图说明

图1是异养硝化细菌CGMCC NO.4918的菌落形态与菌体形态(×1000)；

A为菌落形态，B为菌体形态(×1000)；

图2是异养硝化细菌CGMCC NO.4918对NaNO₂^-初始浓度为0.05g/L的脱氮异养硝化培养基 效果；

图3是异养硝化细菌CGMCC NO.4918对NaNO₂初始浓度为2g/L的异养硝化培养基处理效 果；

图4是模拟水体中异养硝化细菌CGMCC NO.4918的处理效果。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：

一、配制如下培养基：

富集培养基：葡萄糖5g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄.7H₂O 0.05g、FeSO₄.7H₂O 0.02g、CaCl₂0.01g、 NaNO₂0.1～2g，水1L，PH7.2。

异养硝化培养基：葡萄糖1g，NaNO₂0.05～2g，MgSO₄0.02g，柠檬酸钠0.1g，K₂HPO₄0.1g， 蒸馏水定容至1L(固体加2％的琼脂)，pH7.2～7.5；

LB培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水定容至1L(固体加2％的琼脂)， pH7.2。

二、筛选异养硝化细菌：

1.采集含有土著异养硝化细菌的样品：实验中的样品采集于湖南省长沙市某小龙虾养殖 基地，采集点为塘边3cm深的潮湿污泥。

2.微生物富集培养：将10ml活性污泥接种于90ml富集培养基中，在30℃、180r/min的 条件下恒温震荡培育，1～2d后，利用盐酸萘乙二胺分光光度法(GB/T 5009.33-2008)测剩余 亚硝酸盐的浓度，当亚硝酸盐浓度降到10mg/L以下时，取上清液5ml加至100ml新鲜的富 集培养基中相同条件下培养，如此反复5次；每次逐渐提高培养液中NaNO₂的浓度，其中 NaNO₂初始浓度为0.1g/L，然后提高至0.5g/L、1g/L、1.5g/L，最终浓度为2g/L。

3.将富集培养后的菌种转至平板培养，分离纯化，以降解率高的菌为优选菌：富集驯化 完成后，取1ml富集培养液以10^-1梯度进行稀释直到10^-7，将各稀释度的菌液涂布到异养硝 化固体培养基上，于恒温培养箱中30℃培养1～2d，挑取形态不同的菌落进行分离纯化。将分 离纯化后的菌株分别挑取1环接种于100ml亚硝酸盐初始浓度为1g/L的异养硝化培养基中， 30℃、180r/min摇床震荡培养24h。菌液在离心机中(5000r/min)离心3min以去除菌体，利 用盐酸萘乙二胺分光光度法(GB/T 5009.33-2008)测其对亚硝酸盐的去除率。将富集培养物 通过多次平板涂布分离，获得1株亚硝酸盐降解效果较好的菌株，接种于LB斜面上，编号 为N419，4℃冰箱中保存。

4.把降解菌株送至中科院微生物研究所进行菌种鉴定，根据显微形态、生理生化特征、 16S rRNA基因序列等实验数据，该菌株的鉴定结果为：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)保藏 编号CGMCC NO.4918。

实施例2

以上述蜡状芽孢杆菌为出发菌株制备水质净化微生物制剂的方法：

以上述蜡状芽孢杆菌为出发菌株制备水质净化微生物制剂的方法，其生产工艺流程包含 斜面菌种制备、摇床菌种制备和液体发酵。其中：

新鲜斜面菌种获取的工艺条件为：LB培养基，30℃，24h。

摇床种子培养的工艺条件为：pH 7.2、温度30℃，转速180～200r/min，取一环新鲜斜面 菌种培养10～12h；培养基的组成为葡萄糖5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄.7H₂O 0.05g、FeSO₄.7H₂O 0.02g、CaCl₂0.01g、NaNO₂0.5g、H₂O 1L。

液体发酵，其发酵条件为：20L罐装量为12L，搅拌速度200～220r/min，初始pH 7.0～7.2， 通气量：1∶(0.9～1)，接种量3％(接种摇床种子培养液)，28～30℃温度下发酵24～28h；培养 基组成为：玉米粉15g/L，豆粕粉10g/L，酵母粉6g/L，NaCl 5g/L，MgSO₄.7H₂O 1g/L，K₂HPO₄2g/L，MnSO₄.H₂O 0.05g/L，CaCO₃0.01g/L，其余为水。液体发酵后得到的液体就是所需的 产品——水质净化微生物制剂。其菌剂中活菌数可达1.0×10¹⁰cfu/ml，可直接应用于废水处 理。

实施例3

异养硝化细菌CGMCC NO.4918的应用

1.以3％的接种量接入用0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤2次的在LB培养基中培养的 CGMCC NO.4918种子液(A_600nm≈0.5)分别接种于100ml NaNO₂初始浓度为0.05g/L和2g/L 的异养硝化培养基培养基中，对照组不接菌，30℃、180r/min摇床震荡培养48h，每4h测定 一次培养基中剩余亚硝酸盐的浓度。结果表明20h后，菌株CGMCC NO.4918能将初始浓度 为0.05g/L的异养硝化培养基中的亚硝盐浓度降至0.14mg/L；48h后将初始浓度为2g/L的异 养硝化培养基中的亚硝盐浓度降至0.2mg/L以下。

2.为了防止模拟水体中带入杂菌，取鱼塘水，80℃煮沸10min后注入水族缸中，测定其 初始亚硝酸盐浓度为1.22mg/L。水族缸注水量为10L，pH调整至8，恒温培养(30±1)℃。 试验组按添加量1ml/L添加CGMCC NO.4918发酵菌液，对照组不加菌，每隔12h测水体中 剩余亚硝酸盐浓度，实验期间不充氧、不换水。结果表明菌株CGMCC NO.4918在模拟水体 中表现了较强的降解能力，48h后有了明显降解效果，降至0.74mg/L，96h后亚硝酸盐浓度 降至0.2mg/L以下。