提高水稻钾离子外排逆向转运的方法

摘要

一种生物工程技术领域的提高水稻钾离子外排逆向转运的方法，通过突变控制水稻钾离子外排的KEA1基因及其编码蛋白获得水稻钾离子外排逆向转运蛋白的功能变异株，同时利用γ射线对粳稻9522品系进行处理，种植后在F2代挑选叶脉变白的突变体，获得水稻钾离子外排逆向转运蛋白的功能变异株。本发明利用其参与叶绿体钾离子外排逆向转运及其在利用转基因技术控制水稻钾离子运输上的特性，通过抑制该蛋白的表达产生新的水稻抗逆株系，在农业生产上具有十分重要的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的应用，具体是一种利用KEA1基因及其编码蛋白的提高水稻钾离子外排逆向转运的方法。 

背景技术

水稻是我国最主要的粮食作物之一，我国有60％以上人口以稻米为主食，是世界上最大的稻米生产国和消费国。我国水稻年播种面积3000万公顷，占世界的20％；产量1.85亿吨，占世界的近1/3，单位面积产量6.35吨/公顷。比全球平均产量3.85吨/公顷高65％。水稻在我国谷物产量中始终保持在总量的40％左右，占据了近半壁江山。 

光合作用是作物产量的基础，叶绿体作为光合作用的场所，其发育调控机理的研究一直是植物生理和分子生物学研究的热点。土壤盐碱化是导致全球各类粮食作物减产的主要原因，盐胁迫会使光合作用效率降低，导致减产。水稻作为重要的粮食作物之一，对其离子运输以及耐盐机制的研究为在实际育种中培育出新耐盐品种，缓解粮食紧缺问题奠定基础。因此，研究选育新型水稻抗逆株系并对其调控机理进行深入研究，是进一步发掘水稻优质品种的必要前提和基础。 

钾是植物生长发育所必需的矿物质元素，农作物在缺乏钾元素的土壤里不能正常生长发育。提高农作物对钾元素的吸收利用效率是解决钾肥资源短缺问题的重要途径之一。对于钾离子转运蛋白的研究，有助于更清楚地理解离子转运的复杂调控网络，对于促进作物营养循环利用也具有重要的意义。适当高的K⁺/Na⁺比对于维持叶绿体正常的光合磷酸化是十分必要的，当钠离子大量进入细胞内时，就必须用有效的方法来降低胞质中钠离子，维持胞质内离子平衡，保证叶绿体的正常生理功能。植物细胞可以通过增加钾离子的吸收，进而提高胞质中的K⁺/Na⁺比，缓解盐胁迫的伤害。 

现有的转基因工程技术是建立在对植物正常发育过程分子调控机制充分研究和认识的基础上加以应用的，因此，深入研究水稻对于叶绿体钾离子转运机理及调控网络并加以应用是在生产上研发新型抗盐优质株系的基础。 

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种提高水稻钾离子外排逆向转运的方法，利用KEA1基因及其蛋白参与叶绿体钾离子外排逆向转运的特点，及其利用转基因技术控制水稻钾离子运输上的特性，通过突变或抑制该蛋白的表达产生新的水稻抗逆株系，在农业生产上具 有十分重要的应用。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种水稻钾离子外排逆向转运蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第1-3465位所示。 

本发明涉及一种具有钾离子外排逆向转运蛋白活性的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

本发明涉及上述转运蛋白的宿主细胞，该宿主细胞为真核细胞，具体来自水稻。 

本发明涉及一种在水稻中参与叶绿体钾离子外排逆向转运的基因KEA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第1-3465位所示。 

本发明涉及一种基于水稻的KEA1突变体的制种方法，通过利用⁶⁰Coγ射线对粳稻9522品系进行处理，对诱变的F2代中一中脉变白突变体三代回交，获得隐性单基因调控的稳定遗传的KEA1突变体。 

所述的利用⁶⁰Coγ射线对粳稻9522品系进行处理具体操作步骤是指：利用⁶⁰Coγ射线为诱变源，以280Gy处理剂量，处理粳稻9522种子。 

所述的F2代是指：经⁶⁰Coγ射线诱变后的粳稻9522种子经浸种、催芽后播种，在30日龄时，单本移栽入大田，在种子成熟后，每个突变体1代植株，即为F1代，采收3株稻穗；然后对每个F1代株系种子分别播种，并在30日龄时移栽入大田，每个株系单本移栽24株；最后在移栽后，从营养生长一直到生殖生长的全过程中，每个星期在田间观察一次从中筛选出与野生型相比出现表型变化的2代株系，即为F2代，进行编号，记录下表型及分离比。 

本发明涉及上述制种方法得到的KEA1突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

本发明中涉及到的水稻突变体kea1叶片中脉近轴面特异性变白，叶绿体数目减少，排列不规则；盐胁迫条件下，植株中K、Na元素含量明显低于野生型，K/Na比明显高于野生型。 

本发明kea1突变材料是由长江中下游地区推广的常规粳稻9522经过γ射线诱变而来，为隐性单基因的突变，在KEA1基因的第十一个外显子发生四个碱基的缺失(2284～2287bp)，导致基因序列的变化，产生一个如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，从而导致KEA1蛋白提前终止(802aa)，产生一个如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。 

本发明中涉及到基因KEA1，其启动子可以启动KEA1基因在植株的整个维管束组织中表达；KEA1基因在根、茎、叶、叶鞘、花中均有表达；该基因的敲除可以得到该基因突变的表型；该基因的互补及过表达均可以恢复突变体kea1的表型。说明该基因功能确实是影响到水稻的叶片中脉变白，这种影响可能是通过调节叶绿体钾离子外排逆向转运来实现。 

本发明在发掘和利用钾离子外排逆向转运方面具有明显的作用，可以产生新的水稻杂交抗 逆系，用来选育新抗逆品种，在农业生产上具有十分重要的应用。 

附图说明

图1kea1突变体植株的形态学观察示意图。 

图2kea1突变体和野生型9522离子浓度测定示意图。 

图3kea1座位定位示意图。 

图4互补和过表达突变体得到野生型表型示意图。 

图5KEA1启动子的表达模式示意图。 

图6KEA1的亚细胞定位示意图。 

图7RNAi得到突变体表型示意图。 

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 

实施例1：kea1突变体植株的获得和形态学的观察 

该突变体是本实验室用⁶⁰Coγ射线诱变粳稻9522种子，处理剂量为280Gy。对诱变的F2代中一叶片中脉近轴面特异性变白突变体三代回交，获得隐性单基因调控的稳定遗传的突变体kea1。所有植物材料种植于上海市农业科学院试验基地。 

对kea1突变体植株的形态学观察。如图1，野生型和突变型kea1的表型对比显示野生型9522叶色正常(左)(A，B，C)，而kea1突变型叶片中脉近轴面特异性变白(右)(A，B，C)；野生型叶片中脉近轴面叶绿体数目很多，排列规则(上)(D)，突变型kea1叶片中脉近轴面叶绿体数目减少，排列不规则(下)(D)；野生型叶绿体中类囊体数目很多，排列规则(左)(E)，突变体中类囊体数目略有减少(右)(E)。 

实施例2：kea1突变体和野生型9522离子浓度测定 

(1)样品的处理。选取野生型和突变体营养生长旺盛时期(60d)的根、茎、叶、叶鞘和生殖生长时期的花(图2A)，以及正常生长和盐处理(分别用NaCl 300mM和KCl 300mM处理3d)条件下28d小苗的地上部分和根(图2B)，先在5mM的CaCl₂溶液快速洗2次纯水中快速洗两次，在双蒸水中快速洗一次，在超纯水中快速洗三次，然后用吸水纸把苗上的水分吸干，装入牛皮纸袋里，放到90℃烘箱，烘至恒重。 

(2)水稻钾、钠离子浓度的测定。材料烘好后，用电子天平称重，然后放到50ml离心管里，加入0.1M的醋酸溶液，90℃水浴3h，水浴时颠倒混匀5-6次。将提取液倒入2ml离心管，12,000rpm离心5～10min，取上清，用双蒸水稀释到合适的浓度，用Thermo Elemental Sokaar AA型原子吸收分光光度计测定K⁺、Na⁺含量。每个样品重复测定两次。取两次的平均值，计算 每毫克干重的K⁺、Na⁺含量(图2)。 

实施例3：KEA1基因的定位和克隆 

(1)定位群体。将kea1与籼稻品系广陆矮4号杂交，自交获得F2代，选择其中为叶片中脉近轴面特异性变白植株为定位群体。 

(2)水稻DNA提取。采用改进的CTAB法。简单步骤如下：取叶片0.1-0.2克(约半片)放到小研钵中，加入适量的液氮，立刻研磨至粉状，装入2ml离心管，加入700ul 100℃预热的1.5xCTAB溶液于离心管中，小心混匀后放入56℃水浴，20分钟后取出离心管，加入等体积氯仿/异戊醇，猛烈混匀，离心(13000rpm)10分钟，取上清于新管中，加入900ul无水乙醇混匀后-20℃放半小时以上。将析出的DNA离心，14000rpm(10分钟)。去掉上清，将沉淀用1ml70％乙醇清洗一次，离心干燥，溶于200ul 1/10TE或水中，4℃冰箱保存。 

(3)InDel分子标记分析。本实验室设计了132对多态性标记，SSR引物根据已发表的序列合成(http://www.gramene.org/microsat/ssr.html)，其他InDel分子标记设计是根据比较粳稻日本晴和籼稻9311两品系的已公布的核苷酸序列，对差异的部分设计引物，验证2个亲本粳稻9522和籼稻广陆矮之间的多态性，PCR扩增程序为：10ul体系中，1ul模板，1ul 10pmol/ulPrimer1，1ul 10pmol/ul Primer2，1ul 10×Buffer(Mg²⁺)，1ul 2mM dNTP，0.1ul Taq，3.9ul水。通过6％的PAGE胶电泳，银染方法检测。 

(4)群体分离分析(bulked segregant analysis)初定位方法。 

应用这些多态性标记进行PCR扩增分析，在250个定位群体中发现突变基因与4号染色体上的MarkerRM5503和RM2578表现连锁，进一步扩大定位群体(700个)和设计另外的多态性标记定位发现该基因处于距离为122kb的CH413和CH415两个Marker之间；最终将定位群体再扩大2467个隐性单体时，发现该基因处于距离46kb的SN10和SN11两个Marker之间(图3A)。在这46kb范围内，有7个候选基因，其中包括3个预测叶绿体定位基因。通过对这3个候选基因测序分析表明，突变体在Os04g58620基因的编码区有一个4碱基的缺失(图3B)，该基因编码一个钾离子外排逆向转运蛋白KEA1，该缺失突变导致该蛋白表达提前终止。 

用分子标记对定位群体中的叶片中脉近轴面特异性变白单株进行基因型分析，利用MapDraw V2.1构建目标基因区域的分子标记的连锁图谱(图3)。所用标记的序列如表1： 

表1 InDel分子标记及其核酸序列 

实施例4：KEA1基因的功能分析 

为了进一步验证这个基因的功能，将编码KEA1基因的基因组核苷酸序列转入突变体kea1和野生型9522植株，观察是否能够使突变体恢复到野生型表型。从水稻日本晴BAC克隆(OsJNBa0032F06)中用引物COM12-1F：5′ 

cgggatcccgAATGTTTGTATTTCTATGCTGTTGGTT 3′和COM12-3R：5′ 

gtcgacTACGGGATGGTAGAAATGGAT 3′扩增出KEA1基因如SEQ ID NO.4所示的11977bp的基因组序列片段。将该片段通过BamHI和SalI插入到用于转化水稻的双元载体pCAMBIA1301载体中；测序验证正确，该载体通过电击导入野生型农杆菌EHA105，使用遗传转化手段转化突变体kea1和野生型9522成熟胚愈伤，以观察是否会使突变体恢复到野生型表型。T₀代获得互补植株，图4显示T₀代互补和过表达植株表现出的野生型表型。 

所述的野生型农杆菌EHA105为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)COM12-p1301，已经于2011年4月29日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.4820，保藏机构地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101。 

为了进一步验证这个基因的功能，将编码KEA1基因的核苷酸序列转入突变体kea1和野生型9522植株，观察是否能够使突变体恢复到野生型表型以及在野生型过表达KEA1基因出现的表型。从水稻日本晴cDNA克隆(J033101J11)中用引物OVEX12-9F：5′ 

gactagtcATGGATTTGTCTAGGTTTACTGCC 3′和OVEX12-9R：5′ 

ccttaattaaggTCAAATCGCCAATGCTCCA 3′扩增出KEA1基因如SEQ ID NO.1所示的3465bp的cDNA序列片段。将该片段通过SpeI和PacI插入到改造过带有Ubiquitin启动子的用于转化水稻的双元载体pCAMBIA1300载体中。构建得到p1300:Pro_Ubiquitin:KEA1载体，通过电击导入农杆菌EHA105，使用遗传转化手段转化突变体kea1和野生型9522成熟胚愈伤，以观察是否会使突变体恢复到野生型表型以及在野生型过表达KEA1基因出现的表型。T₀代 获得过表达植株，图4显示T₀代互补(com)和过表达(ovex)分别转化9522和kea1植株表现出的野生型表型。 

实施例5：KEA1启动子活性分析 

从水稻9522基因组中用引物KEA1-pF：5′ 

cgggatcccgAATGTTTGTATTTCTATGCTGTTGGTT 3′和KEA1-pR：5′ 

catgccatggCCCCACGCGCCCCCTGTAC 3′扩增出含KEA1启动子序列如SEQ ID NO.3所示的3018bp片段。扩增得到的KEA1启动子通过BamHI和NcoI插入到双元载体pCAMBIA1301中。构建得到p1301:Pro_KEA1:GUS载体，通过农杆菌介导的方法转化至野生型9522水稻愈伤组织中。通过分析B-半乳糖苷酶的活性分析KEA1启动子的表达模式，在转基因的杂合子植株的分蘖芽、根、茎、叶、小穗和小花中通过GUS染色液染色，染色后的组织用75％的乙醇脱色处理，发现KEA1在水稻的分蘖芽(A)、根(B)、茎(C左)、茎节(C右)、叶(D左)、叶鞘(D右)、枝梗(E左)、花(E右)中的维管束均有表达(图6)。 

实施例6：KEA1信号肽活性分析 

从水稻日本晴cDNA克隆(J033101J11)中用引物Sig-1F：5′ 

ccacatgtggATGGATTTGTCTAGGTTTACTGCC 3′和Sig-3R：5′ 

gaagatctCTCGGTATTATCGACTACTGAGCC 3′扩增出KEA1基因cDNA序列如SEQ ID NO.5所示的300bp的包含有编码信号肽的核苷酸序列片段。将该片段通过AflIII/NcoI和BglII插入到改造过带有eGFP标签的双元载体pCAMBIA1301载体中。构建得到p1301:Sig_KEA1:eGFP载体，通过电击导入农杆菌GV3101，使用农杆菌注射瞬时转化手段转化烟草叶片，48h后通过激光共聚焦显微镜观察GFP的荧光与叶绿素自发荧光情况。通过观察分析得到KEA1蛋白定位在叶绿体上，KEA1信号肽包含在该300bp序列片段编码的100aa中(图7，定位情况如箭头所示)。 

所述的农杆菌GV3101为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Sig12-10-3-eGFP-p1301，已经于2011年4月29日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.4823，保藏机构地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101。 

实施例7：KEA1蛋白的应用 

为了对KEA1蛋白进行应用，构建了基因RNAi的载体，并转化野生型9522植株，以期降低KEA1的表达，从而达到改变水稻植株中钾离子外排的水平。从水稻日本晴cDNA克隆(J033101J11)中用引物RI12-1F：5′GAGCTCAAGCTTCGATAATACCGAGGACGAAG 3′和RI12-1R：5′GGATCCCTGCAGCCCGACTGATCCCCTTTT 3′扩增出KEA1基因cDNA序 列的361bp的特异性片段；用引物RI12-3F：5′ 

GAGCTCAAGCTTCTGTGGTGGTCCTGTTGATA 3′和RI12-3R：5′ 

GGATCCCTGCAGAGAGATTGCTGGGAAGTTTG 3′扩增出KEA1基因cDNA序列的437bp的处于离子通道结构域的保守性片段。将这2个片段分别通过HindIII/BamH1和SacI/PstI正反向插入到用于RNAi的pTCK309载体中；测序验证正确，该载体通过电击导入水稻抗逆株系的农杆菌EHA105，使用遗传转化手段转化野生型成熟胚愈伤。T₀代获得RNAi植株，图7显示T₀代RNAi植株表现出的突变体表型，RNAi水稻的叶片中脉变白，这种影响可能是通过调节叶绿体钾离子外排逆向转运、K/Na比明显高于野生型来实现。 

所述的水稻抗逆株系的农杆菌EHA105为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)RI12-1-pTCK309，已经于2011年4月29日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.4821，保藏机构地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101。 

由此可见所克隆的KEA1基因是引起kea1突变体叶片中脉近轴面特异性变白表型的基因。 

综上所述，本实施例通过一新的水稻隐性叶片中脉近轴面特异性变白突变体kea1，通过遗传定位方法，分离到一个新的叶绿体钾离子外排逆向转运蛋白及其基因序列，该蛋白在叶绿体钾离子外排逆向转运和调控叶色方面具有明显的作用，可以利用该基因通过遗传工程的手段产生可以产生新的水稻杂交抗逆株系，用来选育新抗逆品种，在农业生产上具有十分重要的应用潜力。