大水榕、小水榕、尖叶榕、燕尾榕离体快繁体系构建方法

摘要

本发明公开了一种大水榕、小水榕、尖叶榕、燕尾榕离体快繁体系构建方法，其技术要点是以水榕的腋芽或由腋芽新生出来的侧芽作为外植体，诱导产生不定芽，将不定芽接种到固体培养基上继代培养，得到大量的丛生芽，并且，本技术培养的大水榕、小水榕试管苗在培养过程中均能自然生根，不需要转移到生根培养基上；燕尾榕、尖叶榕试管苗在培养过程中需要转移到生根培养基上，用组织培养的方法培养的四种水榕均能在短时间内得到大量健壮的完整植株并出瓶移栽。本技术通过组织培养的方法，既提高了四种水榕的增殖倍数，又缩短了培养时间，简化了培养的程序，并且不受季节影响，可大批供应种苗，从而降低成本。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域，尤其是一种用组织培养快速提高大水榕、小水榕、尖叶榕、燕尾榕快速繁殖的方法。 

背景技术

水榕是非常典型的观赏水草，品种有大水榕、小水榕、尖叶榕、燕尾榕等；大水榕叶片呈倒卵形，株高能达30cm。小水榕叶片呈卵圆形，植株最高只有10cm。燕尾榕叶片较狭长，株高能达20cm。尖叶榕植株比较细小，叶片也较狭长，株高约10-15cm。水榕形状优美，由于叶片坚硬，食草鱼类不会啃食，作为前景水草效果颇佳；水榕还适合在陆生动物饲养箱内种植，例如龟类等。但是多数水榕品种因其雌雄异株且籽株胎生，很难获得正常繁育的种子，常以无性繁殖为主，通过根茎侧芽分蘖而形成新的植株，繁殖速率极低，且受环境和季节限制。这就导致我国的高档观赏水草种苗稀缺，依赖于进口，其价格极高，制约了市场的发展。 

发明内容

本发明的目的是提供一种能大幅提高大水榕、小水榕、尖叶榕、燕尾榕的繁殖速度，且不受环境和季节的影响，易于推广的四种水榕离体快速繁殖体系构建方法。 

实现发明目的技术方案如下： 

大水榕、小水榕、尖叶榕、燕尾榕快繁体系的构建方法，包括如下步骤：外植体的选择与消毒，不定芽的诱导，继代增殖，生根培养、试管苗移栽。 

所述外植体的选择与消毒：选取健壮的上述四种水榕腋芽或者由腋芽新生出来的侧芽为外植体，在无菌条件下进行消毒； 

所述的大水榕、小水榕外植体依序经过不定芽诱导培养、继代培养后获得试管苗；所述的燕尾榕、尖叶榕外植体依序经过不定芽诱导培养、继代培养及生根培养后获得试管苗，所述诱导培养、继代培养及生根培养均在温度为25±1℃，光照时间为12-14h/d，光照强度为20μmol/(m²·s)，湿度为60±10％的条件下进行。 

本发明快繁体系的构建方法中所所涉及到的各种培养基的配制如下： 

不定芽的诱导培养基为： 

①大水榕：MS+6-BA 5mg·L^-1+NAA 1mg·L^-1； 

②小水榕：MS+6-BA 3mg·L^-1+NAA 1mg·L^-1； 

③尖叶榕：MS+6-BA 4.5mg·L^-1+NAA 1.5mg·L^-1； 

④燕尾榕：MS+6-BA 4.5mg·L^-1+NAA 1.5mg·L^-1

继代培养基为： 

①大水榕、尖叶榕、燕尾榕：MS+6-BA 2mg·L^-1+NAA 0.2mg·L^-1

②小水榕：MS+6-BA 3mg·L^-1+NAA 0.3mg·L^-1

尖叶榕生根培养基为：MS培养基 

燕尾榕生根培养基为：MS+6-BA 0.1mg·L^-1+NAA 1.0mg·L^-1。 

以上每升MS培养基中均含有6-8g的琼脂，20g的蔗糖，并且用1mol/L NaOH或1mol/LHCl调pH至6.0，培养基经高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20分钟。 

本发明与已有技术相比，其有益效果体现在： 

(1)本发明提高了大水榕、小水榕、尖叶榕、燕尾榕的繁殖系数，缩短了培养时间，且能提高四种水榕试管苗的质量； 

(2)本发明不受季节和环境的影响，适合于全年繁殖，可大批供应种苗； 

(3)本发明大水榕、小水榕试管苗的培养过程中，能自然生根，不需要转接到生根培养基中；尖叶榕和燕尾榕在继代增殖的过程中生根率较低，但转移到生根培养基中后生根率达91.23％及以上； 

(4)本发明在试管苗移栽时，不需要炼苗，采用直接出瓶的方法，将试管苗移栽入土，简化了程序，降低了成本。 

具体实施方式

现通过下述优选的实施方式对本发明做进一步的说明。 

(1)选取健壮的大水榕、小水榕、尖叶榕、燕尾榕健壮的腋芽或者由腋芽新生出来的侧芽为外植体，洗衣粉洗净表面后经流水冲洗，在超净工作台上先用75％的酒精消毒15-30秒后再用0.1％的HgCl₂消毒5-8分钟，再用无菌水冲洗5-6次。 

(2)将消毒后的大水榕、小水榕、尖叶榕、燕尾榕外植体分别接种到不定芽的诱导培养基中培养，培养基如下： 

①大水榕：MS+6-BA 5mg·L^-1+NAA 1mg·L^-1； 

②小水榕：MS+6-BA 3mg·L^-1+NAA 1mg·L^-1； 

③尖叶榕：MS+6-BA 4.5mg·L^-1+NAA 1.5mg·L^-1； 

④燕尾榕：MS+6-BA 4.5mg·L^-1+NAA 1.5mg·L^-。 

诱导约4-6周后即可出现不定芽。 

(3)将诱导出来的不定芽转接到继代培养基中培养，培养基如下： 

①大水榕、尖叶榕、燕尾榕：MS+6-BA 2mg·L^-1+NAA 0.2mg·L^-1

②小水榕：MS+6-BA 3mg·L^-1+NAA 0.3mg·L^-1

(4)大水榕、小水榕在诱导培养基上培养两个月即可成苗，尖叶榕需转接到不添加激素的MS培养基中培养约30天左右即可成苗，燕尾榕培养两个月后需转接到MS+6-BA 0.1mg·L^-1+NAA 1.0mg·L^-1的生根培养基中培养约30天左右即可成苗。 

以上每升MS培养基中均含有6-8g的琼脂，20g的蔗糖，并且用1mol/L NaOH或1mol/LHCl调pH至6.0。培养基经高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20分钟。 

上述快繁体系构建过程中的不定芽的诱导、继代增殖和生根培养过程中的试管苗均培养在温度为25±1℃，光照强度12-14h/d，光照强度为20μmol/(m²·s)，RH为60±10％的培养室中。 

(5)试管苗移栽：①当大水榕试管苗根条数达到3-10条，根长达到3.20cm及以上，株高达到2.94cm及以上时，即可直接将试管苗移栽入土。②当小水榕试管苗根条数达到3-7条，根长达到1.25cm及以上，株高达到2.32cm及以上时，即可直接将试管苗移栽入土。③当尖叶榕试管苗根条数达到6-7条，根长达到1.87cm及以上，株高达到2.15cm及以上时，即可直接将试管苗移栽入土。④当燕尾榕榕试管苗根条数达到3-5条，根长达到3.32cm及以上，株高达到3.92cm及以上时，即可直接将试管苗移栽入土，要求保持土壤湿润。 

实施例： 

(1)选取健壮的的大水榕、小水榕、尖叶榕、燕尾榕健壮的腋芽或者由腋芽新生出来的侧芽为外植体，洗衣粉洗净表面后经流水冲洗，在超净工作台上先用体积浓度75％的酒精消毒15-30秒后再用体积浓度0.1％的HgCl₂消毒5-8分钟，再用无菌水冲洗5-6次。 

  品种   大水榕   小水榕   尖叶榕   燕尾榕   外植体成活率   26.25％   16.22％   32.45％   22.34％

(2)将消毒后的大水榕、小水榕、尖叶榕、燕尾榕外植体分别接种到不定芽的诱导培养基中培养，培养基如下： 

①大水榕：MS+6-BA 5mg·L^-1+NAA 1mg·L^-1； 

②小水榕：MS+6-BA 3mg·L^-1+NAA 1mg·L^-1； 

③尖叶榕：MS+6-BA 4.5mg·L^-1+NAA 1.5mg·L^-1； 

④燕尾榕：MS+6-BA 4.5mg·L^-1+NAA 1.5mg·L^-。 

诱导约4-6周后即可出现不定芽。6周后统计试验数据，大水榕、小水榕、尖叶榕、燕 尾榕的出芽率分别为：31.58％、16.22％、34.85％、18.23％。 

(3)将诱导出来的不定芽转接到继代培养基中培养，培养基如下： 

①大水榕、尖叶榕、燕尾榕：MS+6-BA 2mg·L^-1+NAA 0.2mg·L^-1

②小水榕：MS+6-BA 3mg·L^-1+NAA 0.3mg·L^-1

  品种   大水榕   小水榕   尖叶榕   燕尾榕   不定芽增殖倍数   8.012   4.333   12.989   6.000

(4)大水榕、小水榕、尖叶榕在诱导培养基上培养两个月即可成苗，尖叶榕培养两个月后需转接到MS培养基上培养约30天左右，燕尾榕培养两个月后需转接到MS+6-BA 0.1mg·L^-1+NAA 1.0mg·L^-1的生根培养基中培养约30天左右即可成苗。 

  名称   平均根条数(条)   平均根长(cm)   生根率(％)   大水榕   13.00±0.02   3.29±0.02   100.00   小水榕   3.12±0.06   1.25±0.03   54.55±0.03   尖叶榕   6.19±0.03   1.82±0.05   100.00   燕尾榕   3.32±0.04   1.56±0.03   91.23±0.05

以上每升MS培养基中均含有6-8g的琼脂，20g的蔗糖，并且用1mol/L NaOH或1mol/LHCl调pH至6.0。培养基经高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20分钟。 

上述快繁体系构建过程中的不定芽的诱导、继代增殖和生根培养过程中的试管苗均培养在温度为25±1℃，光照强度12-14h/d，光照强度为20μmol/(m²·s)，RH为60±10％的培养室中。 

(5)试管苗移栽：①当大水榕试管苗根条数达到3-10条，根长达到3.20cm及以上，株高达到2.94cm及以上时，即可直接将试管苗移栽入土。②当小水榕试管苗根条数达到3-7条，根长达到1.25cm及以上，株高达到2.32cm及以上时，即可直接将试管苗移栽入土。③当尖叶榕试管苗根条数达到6-7条，根长达到1.87cm及以上，株高达到2.15cm及以上时，即可直接将试管苗移栽入土。④当燕尾榕榕试管苗根条数达到3-5条，根长达到3.32cm及以上，株高达到3.92cm及以上时，即可直接将试管苗移栽入土，移栽时要求保持土壤湿润，且温度不能太低，冬季移栽成活率很低，春、夏、秋季移栽，成活率均达97％及以上。