一种结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的检测方法及试剂盒

摘要

一种结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的检测方法及试剂盒。涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术，提供一种设计简单，可简化操作、提高分析灵敏度、成本低廉的结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的检测方法及试剂盒。提取结核分枝杆菌样本的DNA；根据结核分枝杆菌embB基因序列，利用引物设计软件PrimerPremier 5设计引物和探针；构建PCR反应体系，进行PCR检测；进行熔解曲线分析及检测结果判断：通过分析熔解曲线的Tm变化确定该探针所覆盖区域是否发生突变。采用3对引物4条探针建立双管双色体系体系从而实现对位于embB基因上的6个密码子306、368、378、380、406和497的突变检测。

说明书

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术，特别涉及一种结核分枝杆菌乙胺丁醇耐 药突变的检测方法及试剂盒，该方法是一种基于双标记自淬灭探针的探针熔解曲线分析技术， 用于检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变。

背景技术

乙胺丁醇是治疗肺结核的药物之一，它是一种阿拉伯糖类似物，影响细胞壁分枝菌酸- 阿拉伯半乳聚糖-白聚糖复合物形成，发挥抗分枝杆菌作用。据2000年全国结核病流行病学 调查的结果可知，乙胺丁醇的平均耐药率为1.3％。目前其耐药检测仍需进行培养和药敏 实验确认，检测周期长，工作量大，且乙胺丁醇药敏结果符合率偏低(1、Johnson，R.，Jordaan， A.M.，Pretorius，L.，Engelke，E.，van der Spuy，G.，Kewley，C.，et al.Ethambutol resistance testing  by mutation detection.Int J Tuberc Lung Dis.2006，10(1)，68-73)，这极不利于病情治疗及疫情控 制。所以临床需更快、更准、更可靠的新方法。近年来，随着分子生物学理论和技术的发展， 耐药机制及耐药的分子基础逐步被阐明，为各种方法的建立提供一个新的平台。

最近研究表明乙胺丁醇耐药与调控阿拉伯糖基转移酶表达的embABC操纵子基因 突变有关，该操纵子由embA、embB及embC三个基因组成(2、Telenti，A.，Philipp，W.J.， Sreevatsan，S.，Bernasconi，C.，Stockbauer，K.E，Wieles，B.，et al.The emb operon，a gene cluster  of Mycobacterium tuberculosis involved in resistance to ethambutol.1997，Nat Med，3(5)， 567-570.)，其中embB基因的突变是耐乙胺丁醇的主要分子机制，约47％～70％的耐乙 胺丁醇菌株与embB基因突变有关(3、Lee，H.Y，Myoung，H.J.，Bang，H.E.，Bai，G.H.，Kim， S.J.，Kim，J.D.，et al.Mutations in the embB locus among Korean clinical isolates of  Mycobacterium tuberculosis resistant to ethambutol.2002，Yonsei Med J，43(1)，59-64.)，而其中 55％的突变发生在embB 306密码子上，此外embB 406及embB 497(4、Ramaswamy，S. V.，Amin，A.G.，Goksel，S.，Stager，C.E，Dou，S.J.，El Sahly，H.，et al.Molecular genetic analysis  of nucleotide polymorphisms associated with ethambutol resistance in human isolates of  Mycobacterium tuberculosis.2000，Antimicrob Agents Chemother，44(2)，326-336.)也是常见的突 变位点。最新研究embB 368、embB 378及embB 380的突变与乙胺丁醇耐药有一定的 联系(5、Srivastava，S.，Garg，A.，Ayyagafi，A.，Nyati，K.K.，Dhole，T.N.，&Dwivedi，S.K. Nucleotide polymorphism associated with ethambutol resistance in clinical isolates of  Mycobacterium tuberculosis.2006，Curr Microbiol，53(5)，401-405.)。

目前对乙胺丁醇耐药型的基因检测包括两大步骤，即核酸扩增及对扩增产物的分 析。根据对扩增产物处理方式的不同，可分为非均相检测和均相检测。前者主要包括 DNA测序、聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSP)、聚合酶链式反应-限制性片 段长度多态性分析(PCR-RFLP)、线性探针杂交技术、多重连结依赖探针扩增(MLPA) 技术、扩增阻碍突变系统PCR(ARMS-PCR)技术、变形高效液相色谱(dHPLC)技术、 基因芯片等。由于这些方法均需开管操作，所以步骤繁琐，易造成产物污染，同时分析 灵敏度不高，实验结果会受到外界温度、扩增片段长度及序列等客观因素的影响，因此 未得到广泛使用(6、Johnson，R.，Jordaan，A.M.，Pretorius，L，Engelke，E，van der Spuy，G.， Kewley，C.，et al.Ethambutol resistance testing by mutation detection.Int J Tuberc Lung Dis. 2006，10(1)，68-73.)。

近年发展迅速的实时荧光PCR具有诸多优点，由于采用闭管测定方式，消除非均 相方法的产物污染的隐患。同时荧光检测具有信号放大的作用，因此在分析灵敏度、简 便性及等方面更具优势。实时荧光PCR不仅可以用于检测病原体的核酸，同时可通过 设计特异性荧光探针来实时检测基因突变。目前已得到广泛使用的探针主要包括水解探 针(TaqMan探针、MGB探针)，分子信标(Molecular probe)及FRET探针，水解探针和 分子信标针对不同突变类型设计特异探针，只有当探针和模板完全匹配时方可在PCR 扩增的退火阶发出荧光信号，研究表明这两种探针用于检测结核耐药基因突变时，具有 很高特异性(7、Garcia-Quintanilla，A.，Gonzalez-Martin，J.，Tudo，G.，Espasa，M.，&Jimenez de  Anta，M.T.Simultaneous identification of Mycobacterium genus and Mycobacterium tuberculosis  complex in clinical samples by 5′-exonuclease fluorogenic PCR.2002，J Clin Microbiol，40(12)， 4646-4651.)，但是由于一条探针只能检测一种突变类型，对于多基因、多位点的突变检 测，在设计上有一定的难度。相对而言，罗氏专利的FRET探针设计较为简单，它是由 两条和模版互补、且相邻的特异探针组成(距离1-5bp)，上游探针的3′端标记供体荧光基团， 相邻下游探针的5′端标记Red 640受体荧光基团。FRET探针在PCR扩增的退火阶段采集荧 光，同时还可通过Tm熔解进行基因分型，因此只要设计一种探针就能同时检测不同的突变 类型。由于组成FRET探针的两条探针末端要封闭以避免反应，所以合成的成本会比较高， 也比较麻烦。

发明内容

本发明的目的之一是针对现有结核分枝杆菌耐药突变检测方法中存在的问题，提供 一种设计简单，可简化操作、提高分析灵敏度、成本低廉的结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药 突变的检测方法，即一种基于双标记自淬灭探针的探针熔解曲线分析技术。

本发明的另一目的在于提供一种结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的检测方法的试剂盒。

所述结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的检测方法包括以下步骤：

1)提取结核分枝杆菌样本的DNA；

2)根据结核分枝杆菌embB基因序列，利用引物设计软件Primer Premier 5设计引物和 探针；

3)构建PCR反应体系，进行PCR检测；

4)进行熔解曲线分析及检测结果判断：通过分析熔解曲线的Tm变化确定该探针所覆盖 区域是否发生突变。若待测样品熔解曲线峰的Tm比阳性对照的低2℃以上，说明存在突变。

在步骤2)中，所述引物设计的具体方法为：

a，引物设计在所检测的突变两端，探针覆盖突变位点；

b，探针的荧光基团可选择FAM、ROX、HEX、CY5、TET、CAL-Fluor等中的任意一种， 淬灭基团可选择BHQ、Dabcyl等，并且探针可以进行各种类型的修饰(如LNA标记)等；

所述引物和探针的具体序列可为：

306-F：5′-GCGCGAATACGTCGGACAA-3′

306-R：5′-CAGCAGCGACCAGCACACTA-3′

368-406-F：5′-AGCGACGCCAGTCTGTGGAT-3′

368-406R：5′-TGGCTGTACCGCATGGACCTT-3′

497-F：5′-TTGCCGTTGGTGTCGCCGAT-3′

497-R：5′-CGGTGGGCAGGATGAGGTAGTAGT-3′

306-P：5′-FAM-TCGGCATGGCCCGAGTCGCCG-Dabcyl-3′

368-380-P：5′-TET-TTGCCGTTTGCTGGCCTCCACACCTCACGCGGCA-BHQ1-3′

406-P：5′-FAM-TGCGGCAGAGGGCATGATGCCG-BHQ1-3′

497-P：5′-TET-TGTGGGTGTTCCGCGACCAGACCCAC-BHQ1-3′。

在步骤3)中，所述PCR反应体系含有PCR反应液I或PCR反应液II，2U Taq酶，5μL 待测样品，灭菌后纯水作为阴性对照，野生型质粒作为阳性对照。

所述PCR反应液I中含有引物对1：306-F和306-R、引物对2：497-F和497-R、306-P、 497-P、10×buffer(500mM KCl，100mM Tris-HCl(pH＝8.6)，甘油50％(V/V))，dNTP 混合物和去离子水。306-P和497-P分别检测embB 306和embB 497基因突变。

所述PCR反应体系II由引物3(368-406-F和368-406-R)、368-380-P、406-P、10×buffer (500mM KCl，100mM Tris-HCl(pH＝8.6)，甘油50％(V/V))、dNTP混合物和灭菌后纯 水组成。TET标记的368-380-P探针可检测embB 368、embB 378及embB 380三个密码子的 所有突变类型，而FAM标记的406-P探针筛查发生在embB 406上的突变。

所述PCR扩增的程序为：50℃，2min，95℃预变性10min，然后95℃变性15s，58℃退 火15s，74℃延伸20s，共个55循环。

所述结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的检测方法的试剂盒设有盒体、扩增试剂、对照试 剂和提取试剂，所述扩增试剂、对照试剂和提取试剂放置在盒体内，所述扩增试剂包括EMB PCR Mix A、EMB PCR Mix B和TB酶混合液，所述对照试剂包括EMB阳性对照和TB阴性 对照，所述提取试剂为TB DNA提取液。

所述EMB PCR Mix A包括1×buffer(50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH＝8.6)，甘油5 ％(V/V))，dNTP/dUTP Mix(dATP、dCTP、dGTP各200μM，dUTP 400μM)，MgCl₂溶 液3mM，0.4μM 306-F，2μM 306-R，0.2μM 306-P，0.4μM 497-F，2μM 497-R，0.2μM 497-P。

所述EMB PCR Mix B包括1×buffer(50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH＝8.6)，甘油5％ (V/V))，MgCl₂溶液3mM，dNTP/dUTP Mix(dATP、dCTP、dGTP各0.2mM，dUTP 0.4mM)， 0.4μM 368-406-F，2μM 368-406-R，0.2μM 368-380-P，0.2μM 406-P。

所述EMB阳性对照为EMB野生型标准质粒。

所述TB阴性对照可为TB DNA提取液、H₂O、Tris或生理盐水等。

所述TB DNA提取液的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX-100。

所述结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的检测方法的试剂盒检验标本的方法包括以下步 骤：

1)试剂准备——配液区

①首先将所有的试剂从冰箱中取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为：取n×19.6μL EMB PCR Mix A和n×0.4μL TB酶混合液加入到1.5mL离心管中，振荡混匀数秒，3000rpm 离心数秒；另取n×19.6μL EMB PCR Mix B和n×0.4μL TB酶混合液加入到另一1.5mL离心 管中，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。配好的PCR反应液必需贮存在-20℃并在4h内使 用。

②PCR反应液的分装。PCR反应液A/B分别以每管20μL分装于PCR薄壁反应管。

③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间。贮存在-20℃直至样品提取处理完 毕。

2)样品提取及加样——提取区

①固体培养基上生长的结核分枝杆菌，用22SWG标准接种环收集细菌1环，并悬在 250μL TB DNA提取液中。液体培养基中生长的结核分枝杆菌取1mL，10000rpm离心 15min，丢弃上清并在250μL TB DNA提取液中重悬细菌。

②封口膜封口，99℃加热20min。14000rpm离心10min，转移上清到新1.5mL离心 管。上清即为PCR扩增模板。(模板可保存于-20℃，并于1个月内完成试验。注意不要 反复冻融样品。)

③用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品5 μL。立即盖严管盖。

④将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。

3)PCR扩增——扩增区

①仪器的程序设定如下：

第一步：50℃2min，95℃10min；

第二步：95℃15s，58℃15s，74℃20s，55个循环，58℃15s处收集荧光信号；

第三步：95℃1min，35℃5min；

第四步：40～85℃，每0.5℃收集荧光信号，荧光通道选用FAM和TET。

②程序运行完毕，将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染 源处理。

(3)试剂盒的参考值(参考范围)

阳性对照，即野生型在各体系及各通道中的T_m值范围如下：反应体系A中FAM通道野 生型对照峰的Tm值为66.5℃±1℃；TET通道野生型对照峰的Tm值为61.5℃±1℃。反应体 系B中FAM通道野生型对照峰的Tm值为64.5℃±1℃；TET通道野生型对照峰的Tm值为 67.5℃±1℃。

其中各T_m值是在特定Bio-Rad CFX96仪器上所得的常见值，作为参考。当使用其它仪器 时，T_m值可能略有变动，以当次试验阳性对照(野生型)所得的T_m值为准。

T_m值以仪器自动判读所得为准，当仪器给出一个以上T_m值时，请参考阳性对照和阴性 对照的峰型选择有效T_m值。当出现仪器无法自动给出T_m值的情况时，可通过调整基线或直 接人工判读的方法获得T_m值。

(4)结果判读

通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(T_m值)的差异判断样品是否发生 突变。当四个通道中样品的熔点与阳性对照的熔点均一致(误差不超过1℃)时判定为野生 型，试验菌株对乙胺丁醇敏感；四个通道任一通道中样品的熔点低于阳性对照2℃及以上时 (ΔT_m≥2℃)判定为突变型，试验菌株对乙胺丁醇耐药。

关于杂合样品结果的判读：当四个通道中任一通道熔解曲线出现双峰或融合峰时即为杂 合样品，分3种情况：①当样品出现双峰时，即为杂合样品；②样品为一个融合峰，与阳性 对照的熔点一致，但峰型跟阳性对照的峰型有较大差异，在有可能出现突变峰的位置出现小 峰或突起，即为杂合样品；③样品为一个融合峰，为突变熔点，但在野生峰的位置出现小峰 或突起，即为杂合样品。杂合样品对乙胺丁醇耐药，建议出现杂合样品时将样品重复检测， 以确定样品耐药性。

实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果；试剂运输、保存不当或 试剂配制不准确会引起试剂检测效能下降，出现假阴性或检测不准确的结果。

本发明的技术方案包括对待测样品的不对称PCR扩增及对扩增产物进行熔解曲线 分析。本发明采用3对引物4条探针建立双管双色体系体系从而实现对位于embB基因上的 6个密码子306、368、378、380、406和497的突变检测。该体系的的引物设计方案包括： (1)引物对1(306-F和306-R)、引物对2(497-F和497-R)及引物对3(368-406-F和368-406-R) 分别用于扩增embB 306基因、embB 497基因及embB 368-embB 406基因。其中引物对1和 引物对2组成一个双重PCR体系，实验结果表明双重体系中的两条靶序列均得到很好的扩增。 本发明的所采用探针设计方案如下：(1)针对所要检测的位点设计一条与野生型完全匹配的单 链探针，且5′端标记荧光基团，3′端标记淬灭基团。探针与不同的靶序列和结合力的差异 导致熔解曲线Tm的不同。探针与野生型模板完全匹配，结合力最强，所以Tm最高，探针 与突变模板之间存在不匹配碱基，结合力较弱，Tm也随之降低。通过比较待测样品的Tm与 野生对照的Tm就能确定该模板是否存在突变。当探针与野生型靶序列的Tm比突变型的Tm 高3℃以上时，就具备良好的位点突变检测能力。

附图说明

图1为306-P探针检测单基因突变的典型结果图。在图1中，横坐标为温度(℃)，纵坐 标为荧光强度，曲线1代表embB 306 ATG＞GTG、曲线2代表embB 306 ATG＞ATA、曲线3 代表embB 306 ATG＞CTG、曲线4代表野生型。

图2为497-P探针检测单基因突变的典型结果图。在图2中，横坐标为温度(℃)，纵坐 标为荧光强度，曲线1代表embB 497 CAG＞CGG、曲线2代表embB 497 CAG＞AAG、曲线3 代表野生型。

图3为368-380-P探针检测单基因突变的典型结果图。在图3中，横坐标为温度(℃)， 纵坐标为荧光强度，曲线1代表embB 378 GAG＞GCG、曲线2代表野生型。

图4为406-P探针检测单基因突变的典型结果图。在图4中，横坐标为温度(℃)，纵坐 标为荧光强度，曲线1代表embB 406 GGC＞GAC、2代表野生型。

图5为本发明所述结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的检测方法的试剂盒实施例的结构示 意图。

具体实施方式

本发明采用3对引物4条探针建立双管双色体系实现对位于embB基因上的6个与乙胺 丁醇耐药相关的密码突变检测。这6个突变位点及突变类型分别为embB 306(ATG＞CTG、 ATG＞TTG、ATG＞GTG、ATG＞ATA、ATG＞ATT、ATG＞ATC、ATG＞ACG)、embB 368 (GAG＞CAG、GAG＞GCG、GAG＞GAT、GAG＞GAA)、embB 378(GAG＞GCG、GAG＞AAA)、 embB 380(AGC＞AAC、AGC＞CGT)、embB 406(GGC＞GAC、GGC＞AGC、GGC＞TGC、 GGC＞GCC、GGC＞GCG)及embB 497(CAG＞CGG、CAG＞AAG)。

实施例1引物和探针的设计与合成

按实验室常规DNA提取方法提取结核分枝杆菌样本DNA。根据结核分枝杆菌embB基 因序列，设计3对引物4条探针，建立双管双色检测体系，检测位于embB基因上的6个密 码子306、368、378、380、406和497的突变，所述引物的具体序列如下：

引物及探针由上海生工生物有限公司合成。本发明引物和探针还可以为包括以上6条引 物序列及4条探针衍生而来的、差别不大于8个碱基的寡核苷酸序列以及每个序列的反义互 补序列，或它们的变体，或它们的部分序列。

实施例2EMB耐药突变检测试剂盒检测EMB耐药突变

检测分两个反应体系进行双重双色检测：

EMB PCR MIX A每份为19.6μl，每份反应液中含1×buffer(50mM KCl，10mM Tris-HCl (pH＝8.6)，甘油5％(V/V))，dNTP/dUTP Mix(dATP、dCTP、dGTP各200μM，dUTP400μM)， MgCl₂溶液3mM，306-F 0.4μM，306-R 2μM，306-P 0.2μM，497-F 0.4μM，497-R 2μM， 497-P 0.2μM)，检测前加入2U酶混合液(0.4μl)，待测模板加入量为5μl。

EMB PCR MIX B每份为19.6μl，每份反应液中含1×buffer(50mM KCl，10mM Tris-HCl (pH＝8.6)，甘油5％(V/V))，MgCl₂溶液3mM，dNTP/dUTP Mix(dATP、dCTP、dGTP各 0.2mM，dUTP 0.4mM)，368-406-F 0.4μM，368-406-R 2μM，368-380-P 0.2μM，406-P 0.2μM， 检测前加入2U酶混合液(0.4μl)，待测模板加入量为5μl。

EMB野生型标准质粒(10³拷贝/μL)作为阳性对照，TB DNA提取液作为阴性对照。

反应条件：在Bio-rad CFX96实时荧光PCR仪上进行PCR，PCR反应程序为：

50℃，2min，95℃预变性10min；然后95℃变性15s，58℃退火15s，74℃延伸20s，共 个55循环；95℃预变性1min，35℃保温5min，然后以0.5℃/step的升温速率从40℃或增 至85℃，同时在此过程采集FAM与TET通道的荧光。实验结果如图1～图4所示，所有突 变类型都能与野生型对照区分开。

结果判读：

反应体系A中FAM通道野生型对照峰Tm值为66.5℃±1℃；TET通道野生型对照峰Tm 值为61.5℃±1℃。反应体系B中FAM通道野生型对照峰Tm值为64.5℃±1℃；TET通道野 生型对照峰Tm值为67.5℃±1℃。

通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(T_m值)的差异判断样品是否发生 突变。当四个通道中样品的熔点与阳性对照的熔点均一致(误差不超过1℃)时判定为野生 型，试验菌株对乙胺丁醇敏感；四个通道任一通道中样品的熔点低于阳性对照2℃及以上时 (ΔT_m≥2℃)判定为突变型，试验菌株对乙胺丁醇耐药。

图5给出本发明所述结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的检测方法的试剂盒实施例的结构 示意图，设有盒体1、扩增试剂(包括EMB PCR Mix A2、EMB PCR Mix B3和TB酶混合液 4)、对照试剂(包括EMB阳性对照7和TB阴性对照6)和提取试剂(TB DNA提取液5)， 所述扩增试剂、对照试剂和提取试剂放置在盒体1内。

所述EMB PCR Mix A包括1×buffer(50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH＝8.6)，甘油5 ％(V/V))，dNTP/dUTP Mix(dATP、dCTP、dGTP各200μM，dUTP 400μM)，MgCl₂溶 液3mM，0.4μM 306-F，2μM 306-R，0.2μM 306-P，0.4μM 497-F，2μM 497-R，0.2μM 497-P。

所述EMB PCR Mix B包括1×buffer(50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH＝8.6)，甘油5％ (V/V))，MgCl₂溶液3mM，dNTP/dUTP Mix(dATP、dCTP、dGTP各0.2mM，dUTP 0.4mM)， 0.4μM 368-406-F，2μM 368-406-R，0.2μM 368-380-P，0.2μM 406-P。

所述EMB阳性对照为EMB野生型标准质粒。

所述TB阴性对照可为TB DNA提取液、H₂O、Tris或生理盐水等。

所述TB DNA提取液的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX-100。

所述结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的检测方法的试剂盒检验标本的方法包括以下步 骤：

1)试剂准备——配液区

①首先将所有的试剂从冰箱中取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为：取n×19.6μL EMB PCR Mix A和n×0.4μL TB酶混合液加入到1.5mL离心管中，振荡混匀数秒，3000rpm 离心数秒；另取n×19.6μL EMB PCRMix B和n×0.4μL TB酶混合液加入到另一1.5mL离心 管中，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。配好的PCR反应液必需贮存在-20℃并在4h内使 用。

②PCR反应液的分装。PCR反应液A/B分别以每管20μL分装于PCR薄壁反应管。

③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间。贮存在-20℃直至样品提取处理完 毕。

2)样品提取及加样——提取区

①固体培养基上生长的结核分枝杆菌，用22SWG标准接种环收集细菌1环，并悬在 250μL TB DNA提取液中。液体培养基中生长的结核分枝杆菌取1mL，10000rpm离心 15min，丢弃上清并在250μL TB DNA提取液中重悬细菌。

②封口膜封口，99℃加热20min。14000rpm离心10min，转移上清到新1.5mL离心 管。上清即为PCR扩增模板。(模板可保存于-20℃，并于1个月内完成试验。注意不要 反复冻融样品。)

③用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品5 μL。立即盖严管盖。

④将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。

3)PCR扩增——扩增区

①仪器的程序设定如下：

第一步：50℃2min，95℃10min；

第二步：95℃15s，58℃15s，74℃20s，55个循环，58℃15s处收集荧光信号；

第三步：95℃1min，35℃5min；

第四步：40～85℃，每0.5℃收集荧光信号，荧光通道选用FAM和TET。

②程序运行完毕，将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染 源处理。

(3)试剂盒的参考值(参考范围)

阳性对照，即野生型在各体系及各通道中的T_m值范围如下：反应体系A中FAM通道野 生型对照峰的Tm值为66.5℃±1℃；TET通道野生型对照峰的Tm值为61.5℃±1℃。反应体 系B中FAM通道野生型对照峰的Tm值为64.5℃±1℃；TET通道野生型对照峰的Tm值为 67.5℃±1℃。

其中各T_m值是在特定Bio-Rad CFX96仪器上所得的常见值，作为参考。当使用其它仪器 时，T_m值可能略有变动，以当次试验阳性对照(野生型)所得的T_m值为准。

T_m值以仪器自动判读所得为准，当仪器给出一个以上T_m值时，请参考阳性对照和阴性 对照的峰型选择有效T_m值。当出现仪器无法自动给出T_m值的情况时，可通过调整基线或直 接人工判读的方法获得T_m值。

(4)结果判读

通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(T_m值)的差异判断样品是否发生 突变。当四个通道中样品的熔点与阳性对照的熔点均一致(误差不超过1℃)时判定为野生 型，试验菌株对乙胺丁醇敏感；四个通道任一通道中样品的熔点低于阳性对照2℃及以上时 (ΔT_m≥2℃)判定为突变型，试验菌株对乙胺丁醇耐药。

关于杂合样品结果的判读：当四个通道中任一通道熔解曲线出现双峰或融合峰时即为杂 合样品，分3种情况：①当样品出现双峰时，即为杂合样品；②样品为一个融合峰，与阳性 对照的熔点一致，但峰型跟阳性对照的峰型有较大差异，在有可能出现突变峰的位置出现小 峰或突起，即为杂合样品；③样品为一个融合峰，为突变熔点，但在野生峰的位置出现小峰 或突起，即为杂合样品。杂合样品对乙胺丁醇耐药，建议出现杂合样品时将样品重复检测， 以确定样品耐药性。

实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果；试剂运输、保存不当或 试剂配制不准确会引起试剂检测效能下降，出现假阴性或检测不准确的结果。