一种利用海岛棉染色体片段导入系改良棉花马克隆值的分子育种方法

摘要

本发明一种利用海岛棉染色体片段导入系改良棉花马克隆值的分子育种方法，专用于农作物（棉花）定向改良农艺性状和新品种的选育。通过对海岛棉染色体片段导入系进行棉纤维品质检测，筛选出马克隆值显著低于对照TM-1的导入系IL056-A5-7。以此导入系为非轮回亲本，新疆棉区推广品种新陆早41号为轮回亲本，进行杂交，回交2代且自交3代并辅以分子标记辅助选择获得马克隆值优良的棉花新品系。利用这一方法，已经培育出优质、高产的棉花新品系“南农海导4号”。

说明书

 

（一）技术领域：本发明一种利用海岛棉染色体片段导入系改良棉花马克隆值的分子育种方法，专用于快速、有效地选育与生产马克隆值优良的棉花新品系（新品种）。   

    （二）技术背景：

　棉花是世界性的重要经济作物。中国是棉花的生产大国，消费大国和纺织大国。作为棉花生产大国，我国主产棉区覆盖16个省、市（自治区），常年植棉面积7000—8000万亩，总产约600万吨，占世界总产的四分之一。随着纺织技术的进步，纺织产品也从粗支纱发展到高支纱甚至达到100支的细沙，加工对象也有一般中绒棉发展到中长绒棉、长绒棉和超长绒棉。王延琴等（王延琴， 杨伟华， 许红霞， 周大云， 冯新爱， 匡 猛. 中国棉花生产中存在的主要问题及建议. 中国农学通报, 2009, 25(14): 86-90）2003—2007年连续5年在三大主产棉区选取546个基点，2201份棉花样品进行纤维质量检测发现我国陆地棉样品的纤维长度平均28.8 mm，变幅24.0~34.7 mm，主要处于细绒棉的中绒（28.0~31.0 mm） 范围， 即中与长的范围；断裂比强度平均28.3 cN/tex，变幅19.7-38.3 cN/tex，多数处于中等(26.0~29.0cN/tex)范围，即中到强的范围；马克隆值平均4.2，变幅2.0~5.2，多数在（3.7~4.9）范围。中国棉花基本能满足纺织工业的需要， 但缺乏长度在31 mm以上，断裂比强度在34 cN/tex以上，马克隆值在3.7~4.2之间的特优质品种，来满足纺60支以上高支纱的需要。

一般棉花品种纤维品质性状的遗传分析均表现出典型数量性状遗传方式，易受环境条件影响。在不同分离群体中，加性、显性或上位性效应均可能占主导地位。利用野生种的高强力性状和海岛棉的优良品质基因杂交渐渗和转育，是当代育种家获取高强力纤维的主要途径。海岛棉生育期长，成熟晚，铃小，产量低于陆地棉，但纤维细强，是纺高支纱原料；而陆地棉的产量高，适应性广，纤维品质中等，但显著优于亚洲棉和草棉。陆地棉、海岛棉两者杂交的F₁可育，表型正常，且有明显的产量、品质的杂种优势，印度、以色列、中国已成功培育出海、陆杂交种在生产上大面积推广利用。但是，两者杂交的后代表现典型的种间杂交的疯狂分离，棉花育种家一直努力想培育出既具陆地棉的高产，又有海岛棉优质的新品种，一直没有成功。分子标记技术在纤维品质改良育种中的应用大大减少了育种过程中选择的盲目性，快速实现外源优良种质向栽培品种渗透，拓宽了品种的遗传基础。国内外研究人员对纤维品质进行了大量的QTL定位研究，有的已经用于标记辅助选择育种实践。

染色体片段导入系(Chromosome segment introgression lines，CSIL)是利用杂交，回交和分子标记辅助选择(marker-assisted selection, MAS)构建的覆盖作物整个基因组的一系列近等基因系。它的基因组内只有来自供体亲本的一个纯合的染色体片段，而基因组的其余部分与轮回亲本相同。它是进行基因组研究，特别是QTL定位和分子设计育种的理想材料。万建民（万建民. 作物分子设计育种. 作物学报，2006,32（3）：455-462.）已利用由粳稻 Asominori(轮回亲本)和籼稻IR24(非轮回亲本)构建的染色体片段置换系进行了分子育种的实践。

 （三）发明内容

技术问题  一种利用海岛棉染色体片段导入系改良棉花马克隆值的分子育种方法，克服和缓解海陆杂交存在的严重连锁累赘，有利于海岛棉中马克隆值优良的基因资源导入陆地棉中。回交可以恢复轮回亲本的遗传背景，同时保存了非轮回亲本的有利性状，结合分子标记辅助选择目标性状，可以快速高效培育马克隆值优良的棉花新品系。

技术方案  一种利用海岛棉染色体片段导入系改良棉花马克隆值的分子育种方法，包括：

1)        以新疆棉区推广品种新陆早41号为轮回亲本（♀），以IL056-A5-7染色体片段导入系为非轮回亲本（♂），杂交1代，回交2代获得BC₂F₁，每代都是混收混种；

2）分子标记辅助第一次选择：BC₂F₁种植，应用CTAB法提取DNA，采用IL056-A5-7导入片段上的分子标记引物对NAU5347、CIR062、NAU6657、 NAU6207、NAU861、NAU3014进行PCR扩增，选择同时含有6个分子标记条带（分子量分别是600bp；300bp；180bp；300bp；215bp；210bp）的单株自交获得BC₂F₂，种子按单株收获；  

引物对产物大小（bp）正向引物序列（5′—3′）反向引物序列（5′—3′）    NAU5347600AAAGAAGTTCCGTTCAAGGACTGCATACTGTTTGCTCCACIR062300TTTAGAGGAGAAGTTTAGGCAGTCTCTTGTAGTTTCATTNAU6657180TGTTAGTGCGCTTCTGTGATCAGAGAAGATGGCAATGTGANAU6207300AGATATTGTTGGGGTCGAAACAGAGAAGATGGCAATGTGANAU861215CCAAAACTTGTCCCATTAGCTTCATCTGTTGCCAGATCCNAU3014210TCGATAGCATCCAAGAAACAAACTTGCACTCCCCATACAT

3）分子标记辅助第二次选择： 种植BC₂F₂，每株提取DNA后，再利用分子标记引物对NAU5347、CIR062、NAU6657、NAU6207、NAU861、NAU3014确定BC₂F₂单株的基因型，同时只有6个分子标记条带（分子量分别是600bp；300bp；180bp；300bp；215bp；210bp）的单株自交获得BC₂F₃，BC₂F₃即为改良棉花马克隆值的育成品系，从所述的改良棉花马克隆值的BC₂F₃中选择纤维长度29.39-30.63 mm，纤维强度30.2-31.3cN/tex，马克隆值3.63-4.14，单铃重4.68-5.05 g，衣分36.9-38.2%的家系，即为育成品系“南农海导4号”。该品系马克隆值较新陆早41号显著降低，纤维长度、纤维强度和产量与轮回亲本新陆早41号相当。

 有益效果：本发明所提供的一种利用海岛棉染色体片段导入系改良棉花马克隆值的分子育种方法与传统的回交聚合育种技术相比具有如下优点：传统的回交聚合育种技术存在杂交工作量大、选择可靠性差、育种周期长的缺陷。通过分子标记辅助选择目标性状，可在2-3年内快速高效培育出高产、优质等多目标性状的棉花新品系。

“南农海导4号”的主要优点：以海岛棉染色体片段导入系——IL056-A5-7为供体材料，以新陆早41号为轮回亲本，通过分子标记辅助选择获得了棉纤维长度、纤维强度和产量与轮回亲本新陆早41号相当，马克隆值显著降低的棉花新品系“南农海导4号”。 “南农海导4号”的马克隆值3.63-4.14。

（四）附图说明：

图1  分子标记辅助选择马克隆值优良的棉花新品系

 （五）生物保藏：

IL056-A5-7为陆地棉（Gossypium hirsutum.），2011年 3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.4683。

 （六）具体实施方式： 

 选择亲本：南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室棉花研究所以陆地棉遗传标准系TM-1为轮回亲本，抗病、优质的海岛棉海7124品系为供体亲本（非轮回亲本），在回交高世代结合覆盖全基因组的SSR分子标记辅助选择，培育了国内首套陆地棉遗传标准系TM-1背景的海岛棉染色体片段导入系174个，其基因组的覆盖率达83.5%。通过对海岛棉染色体片段导入系进行连续2年的棉纤维品质检测，筛选出纤维长度显著优于对照的导入系IL056-A5-7。该导入系纤维长度28.75-29.4mm，纤维强度29.9-31.0cN/tex，马克隆值3.3-3.5，单铃重6.7-7.1g，衣分37.3-38.2%，单株铃数12-15个，株高95-105 cm。

新疆棉区推广品种新陆早41号是新疆富全新科种业有限公司培育的早熟棉品种，2009年3月通过新疆农作物品种审定委员会审定（品种审定号：新审棉2009年57号）。该品种纤维长度30.30-30.33 mm，纤维强度30.5-31.5cN/tex，马克隆值4.31-4.39，单铃重5.23-5.34 g，衣分38.1-43.3%，单株铃数15-20个，株高100-110 cm。

品种选育：2007年冬季在海南三亚以新陆早41号为母本，IL056-A5-7为父本配制杂交F₁。2008年夏季在南京农业大学江浦试验站分别种植一行新陆早41号和F₁，以新陆早41号为父本，F₁为母本配制杂交组合产生BC₁F₁，成熟后全部混收。2008年冬季在海南三亚分别种植一行新陆早41号和BC₁F₁，以新陆早41号为父本，F₁为母本配制杂交组合产生BC₂F₁，成熟后全部混收。田间管理按常规方法进行。

分子标记辅助选择：2009年夏季在南京农业大学江浦试验站种植3行BC₂F₁，每行10-12株，每株采集3-4片未展开的叶片放入1.5ml的eppendorf管中，并加入预冷的新鲜配制的提取缓冲液600 μl，电钻研磨，应用CTAB法（Paterson AH, Brubaker CL, Wendel JF. A rapid method for extraction of cotton （Gossypium spp.） genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis [J]. Plant Mol Biol Rep, 1993, 11, 2: 122-127）提取DNA，采用IL056-A5-7导入片段上的分子标记（表1）进行PCR扩增，扩增体系10μl，DNA模板1μl，94℃预变性5min，94℃变性0.5min，57℃复性0.5min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃再延伸10 min，扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶浓度为8%，电泳缓冲液为0.5倍TBE，170V恒压电泳1.5小时。选择含有6个分子标记的5个单株自交获得BC₂F₂，种子按单株收获。

2009年冬季在海南三亚每个BC₂F₂种植3行，每行10-12株，共计15行，150-180株，每株采集叶片，提取DNA后，利用表1提供的分子标记确定BC₂F₂单株的基因型，选择6个标记都是纯合的单株自交获得10株BC₂F₃。

田间鉴定：2010年夏季，每个BC₂F₃在新疆种植2行，每行15-20株，两次重复。成熟后按行混收棉花后，每行取12克皮棉样品，重复2次，送河南棉花质量检测中心检测皮棉品质。以上所述的改良棉花马克隆值的BC₂F₃中选择纤维长度29.39-30.63 mm，纤维强度30.2-31.3cN/tex，马克隆值3.63-4.14，单铃重4.68-5.05 g，衣分36.9-38.2%的家系，即为育成品系“南农海导4号”。该品系马克隆值较新陆早41号显著降低，纤维长度、纤维强度和产量与轮回亲本新陆早41号相当。

注: CIR 来自 Nguyen 等（Nguyen T B , G iband M, Brottier P , Risterucci A M, Lacape J M. Wide coverage of the tetraploid cotton genome using newly developed microsatellite markers. Theor Appl Genet, 2004, 109: 167-175）公布的序列; NAU 编号的引物由本实验室从EST-SSR 序列中开发（Han Z G, Guo W Z, Song X L, et al. Genetic mapping of EST-derived microsatellites from the diploid Gossypium arboreum in allotetraploid cotton. Mol Gen Genomics, 2004, 272: 308―327; Han Z G, Wang C B, Song X L, et al. Characteristics, development and mapping of Gossypium hirsutum derived EST-SSRs in allotetraploid cotton. Theor Appl Genet, 2006, 112: 430―439；Wangzhen Guo, Caiping Cai, Changbiao Wang, et al. A preliminary analysis of genome structure and composition in Gossypium hirsutum. BMC Genomics, 2008, 9: 314-331. ）. 所有的引物信息可以从网站www.cottonmarkers.org上下载。

序列表

 

<110>  南京农业大学

<120>  一种利用海岛棉染色体片段导入系改良棉花马克隆值的分子育种方法

<130>  说明书

<140>  00

<141>  2011-04-11

<160>  12   

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  NAU5347正向引物序列

<222>  (1)..(19)

<400>  1

aaagaagttc cgttcaagg                                                    19

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  NAU5347反向引物序列

<222>  (1)..(20)

<400>  2

actgcatact gtttgctcca                                                   20

<210>  3

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  CIR062正向引物序列

<222>  (1)..(19)

<400>  3

tttagaggag aagtttagg                                                    19

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  CIR062反向引物序列

<222>  (1)..(20)

<400>  4

cagtctcttg tagtttcatt                                                   20

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  NAU6657正向引物序列

<222>  (1)..(20)

<400>  5

tgttagtgcg cttctgtgat                                                   20

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  NAU6657反向引物序列

<222>  (1)..(20)

<400>  6

cagagaagat ggcaatgtga                                                   20

<210>  7

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  NAU6207正向引物序列

<222>  (1)..(20)

<400>  7

agatattgtt ggggtcgaaa                                                   20

<210>  8

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  NAU6207反向引物序列

<222>  (1)..(20)

<400>  8

cagagaagat ggcaatgtga                                                   20

<210>  9

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  NAU861正向引物序列

<222>  (1)..(20)

<400>  9

ccaaaacttg tcccattagc                                                   20

<210>  10

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  NAU861反向引物序列

<222>  (1)..(19)

<400>  10

ttcatctgtt gccagatcc                                                    19

<210>  11

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  NAU3014正向引物序列

<222>  (1)..(20)

<400>  11

tcgatagcat ccaagaaaca                                                   20

<210>  12

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

<220>

<221>  NAU3014反向引物序列

<222>  (1)..(20)

<400>  12

aacttgcact ccccatacat                                                   20