提高案件微量检材脱落细胞DNA提取效率的方法及试剂

摘要

本发明涉及一种提高案件微量检材脱落细胞DNA提取效率的方法及试剂。案件检材量微、细胞角质化以及16个STR位点多重PCR复合扩增等问题，使得脱落细胞DNA提取一直是法医学中的难点。经研究发现蛋白酶消化、70-100度温浴、PEG-乙醇磁珠结合体系三点的组合能够高效提取微量DNA，获得长度合适DNA片段能够满足案件检测中16个STR位点复合扩增的需要，实现了案件检测成功率的提升。蛋白酶消化、温浴使得脱落细胞高效释放DNA，结构相对完整，在PEG-乙醇体系中易与磁珠结合。PEG-乙醇结合体系的使用不仅促进磁珠对DNA的高效吸附，而且保证了DNA结构相对完整，获得长度合适DNA片段能够满足案件检测中16个STR位点复合扩增的需要。

说明书

技术领域

本发明涉及案件微量检材脱落细胞DNA高效提取的方法及试剂，属于法医 物证DNA检测领域。

背景技术

自从PCR技术应用到生物物证的检验，尤其是应用STR基因座进行分析后， DNA提取便成为法医DNA多态性分析的关键环节，DNA样品质量的好坏将直接 关系到后续实验的成败。但在实际检案中，越来越多的案件由于案件本身性质、 作案过程及犯罪分子的反侦察意识增强等因素的作用，在一些现场勘查中，很 难发现血斑、精斑、毛发、烟头等常规生物检材，因此可能载有人体案件微量 检材的检材就成为案件侦破的重要物证。

人体案件微量检材量微，且多为角质化，细胞核多已退化，附着在与人体 接触的各种载体上。其载体具有如下特点：①微量表皮细胞等检材大面积分布 在载体表面且与载体、污物结合紧密，难以收集转移；②保存时间过长或不当， DNA易降解难以满足16个STR位点多重PCR复合扩增(一个管内16个模板 同时扩增)；③此类检材载体多经洗涤，含PCR抑制物。因此，案件微量检材 DNA的提取难度大，缺乏稳定的提取方法，容易导致检案失败。

目前，根据案件微量检材的量与其所在载体的差异，DNA提取的方法也不 同。衣帽、鞋、袜子等人体接触面较大、可能含有的案件微量检材较多的检材， 多通过案件微量检材吸收仪收集检材的案件微量检材后，用自动化工作站或 chelex-100法提取，可通过延长孵化时间、增加蛋白酶K的量、减少洗脱体积等 方法，以达到提高DNA模板浓度的目的。而当遇到各种工具的木质柄，如斧子 的木质柄、各类载体上的指纹，如杯盖上的指印等人体接触部位较少、载体对 案件微量检材吸附性较强的检材时，检验人员一般都是根据自己的提取经验采 取不同的提取的方法，但往往都是多种试剂盒的交叉使用和多种提取方法的混 合应用。如用Chelex-100和蛋白酶K孵育几个小时后经Microcon-100纯化柱纯 化浓缩DNA；或用其他试剂盒如QIAGEN M48磁珠试剂盒提取DNA模板，有 的还将有机法中氯仿纯化步骤运用其中。这些方法提取的DNA量少、纯度低、 长度不完整，不但要用价格昂贵的进口试剂，而且步骤繁琐、耗时较长、操作 复杂、个人经验影响较大，成功率比较低。

本发明人优化裂解、结合体系发明提高案件微量检材DNA提取效率的方法 及试剂，解决DNA提取过程中遇到的以上问题，并成功应用于实际检案。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，系统优化裂解、结合、清洗体系解决案件检 材中只含有微量DNA的提取难题，实现简便、快速，高效地提取微量DNA。

经过不同条件组合、系列对比试验及大量现场案件检材试验，我们发现： ①蛋白酶消化、70-100温浴、PEG-乙醇磁珠结合液三点的有机结合能够高效提 取微量DNA；②蛋白酶消化、温浴处理能够高效释放脱落细胞DNA，结构完 整，在PEG-乙醇体系中易与磁珠结合；③PEG-乙醇结合体系的使用不仅促进磁 珠对DNA的高效吸附，而且保证了DNA结构相对完整，获得长度合适DNA 片段能够满足案件检测中16个STR位点复合扩增的需要。试剂提取案件微量检 材DNA既能够减少成本，简便操作，无需多种试剂盒和多种方法的交叉使用， 而且灵敏度高，方法简单，减少了对技术人员经验的依赖，实现了案件检测成 功率的提升。

本发明提供了一种提取案件微量检材DNA的试剂，其组成为磁珠悬液；裂 解液，其组成为pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液；结合液I，其组成为20-50％w/v 的PEG，PEG的MW＝8000；结合液II，其组成为乙醇；清洗液，其组成为50-80％ v/v的乙醇溶液。

本发明所述的结合液II可用甲醇及丙醇、异丙醇中的一种替换乙醇。

本发明方法可以简便高效地从微量案件检材提取到DNA。

本发明所述的微量案件检材为案件现场遗留的含有微量案件微量检材的生 物检材。

本发明所述的转移好案件微量检材的载体为用生物细胞提取仪吸附案件现 场遗留的衣物、绳索、电线、木棍等所得到的滤膜。

本发明所述的转移好案件微量检材的载体为用案件微量检材粘取器、透明 胶带粘取现场遗留的衣物、绳索、电线、木棍、瓶口、各种把手或手柄、玻璃 或桌面等上的指纹等所得到的胶膜或透明胶带。

本发明所述的转移好案件微量检材的载体为滤纸、棉签、纱线等檫拭现场 遗留的衣物、绳索、电线、木棍、瓶口、各种把手或手柄、玻璃或桌面等上的 指纹等所得到的滤纸、棉签、纱线等。

用于本发明的裂解液、结合液I、结合液II、清洗液没有特别限制，可以为 本领域所采用的裂解液、结合液I、结合液II、清洗液。

本发明的主要优点在于：

1.本发明方法结合蛋白酶消化、70-100度温浴能够充分裂解案件微量检材脱落 细胞，释放的DNA结构相对完整，在PEG-乙醇体系中易与磁珠结合且；

2.试剂组成中PEG-乙醇结合液的存在不但能更好地去除蛋白质，而且磁珠在 吸附DNA时能够充分分散于结合液中，实现了磁珠对结合液中DNA的高 效吸附；

3.PEG-乙醇结合液的使用使提取到的DNA长度适合，能够满足案件检测中 16个STR位点复合扩增的需要，极大减少丢峰、扩增不平衡现象。

4.该提取方法减少了对操作者经验的依赖性，操作简便，稳定性好；

5.无需使用苯酚、氯仿等毒性大的有机溶剂，安全性好；

6.灵敏度高，提取快速，一般操作可在1～1.5个小时完成，且可用于自动化工 作站的DNA提取。

附图说明

图1案件现场遗留的皮带提取的微量DNA的复合STR扩增图谱。

图21μL经60倍稀释新鲜血液提取的DNA复合STR扩增图谱。

图31μL经60倍稀释新鲜血液，对照实验2提取DNA复合STR扩增图谱。

图41μL经60倍稀释新鲜血液，对照实验3提取DNA复合STR扩增图谱。

图51μL经60倍稀释新鲜血液，对照实验4提取DNA复合STR扩增图谱。

图61μL经60倍稀释新鲜血液，对照实验5提取DNA复合STR扩增图谱。

图71μL经60倍稀释新鲜血液，对照实验6提取DNA复合STR扩增图谱。

图81μL经60倍稀释新鲜血液，对照实验7提取DNA复合STR扩增图谱。

图91μL经60倍稀释新鲜血液，对照实验8提取DNA复合STR扩增图谱。

图10为案件现场遗留的拖鞋，用甲醇替换结合液II的复合STR扩增图谱。

图11为案件现场遗留的牙刷，用丙醇替换结合液II的复合STR扩增图谱。

图12为案件现场遗留的喝水用的瓷杯，用异丙醇替换结合液II的复合STR扩 增图谱。

具体实施方式

实施例一提取案件现场遗留的皮带扣上的微量DNA。

(一)试剂盒准备

制备利用磁珠提取案件微量检材DNA的试剂盒，其中包括：

1mL硅烷化磁珠溶液(0.1mg/μL)，武汉哇哇噻纳技术开发有限公司上市产品 或Qiagen公司购买；

100mL裂解液，其组分为pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液；

100mL结合液I，其组分体积比为20-50％的PEG(分子量8000)；

20mL结合液II，其组分为乙醇；

100mL清洗液，其组分为体积比为80％的乙醇溶液。

(二)利用试剂盒提取案件现场遗留的皮带扣脱落细胞DNA，提取步骤如下：

1)利用案件微量检材粘取器反复粘皮带扣多次，将胶膜放入1.5mL离心管；

2)加入6μL蛋白酶K(10mg/mL)、350μL裂解液，漩涡震荡2秒钟，放置孵育 器56度孵育40分钟；

3)将离心管自孵育器取下，漩涡震荡2秒钟，放置孵育器70-100度孵育8分钟 后，13000转离心3分钟，上清转移至另一1.5mL离心管；

4)加入400μL结合液I、80μL结合液II和20μL磁珠悬液，漩涡震荡2秒钟， 放置室温10分钟；

5)将离心管至于磁力架上2分钟，吸弃上清留磁珠，加入300μL清洗液，漩 涡震荡2秒钟，放置室温2分钟；

6)重复步骤4两次；

7)将离心管至于磁力架上2分钟，吸弃上清留磁珠，离心管打开并放置室温5 分钟；

8)加入30μL超纯水，漩涡震荡2秒钟，放置孵育器80度孵育10分钟，中间 混匀磁珠2次，将离心管置于磁力架，所得上清即为DNA溶液。

(三)PCR扩增及电泳

扩增试剂盒为ABI公司的sinofiler试剂盒

扩增程序如下：

电泳设备为ABI公司的3100型测序仪

上样体系：2μL扩增产物+20μL甲酰胺(已加Liz)

其他步骤：严格按照3100型测序仪说明书进行操作。

图1为提取该案件现场遗留皮带DNA的检测结果，16个STR位点完整， 峰高均在200以上，符合案件检测对16个STR位点分析的要求，进一步说明了 本试剂和本方法的在提取微量案件检测DNA时具有很大优势。

实施例二对照实验

以1μL经60倍生理盐水稀释的血液为模拟样本，取代实施例一脱落细 胞胶膜，扩增及电泳同实施例一，设计微量样本提取系列对照试验如下：

对照试验1提取步骤1)中胶膜被1μL模拟样本替换，其他步骤不变；

对照试验2步骤2)中未加蛋白酶，其他同对照试验1；

对照试验3步骤3)中孵育温度不足70度，其他同试验1；

对照试验4步骤4)中结合液体系中除去乙醇，其他同试验1；

对照试验5步骤4)中结合液体系中除去PEG，其他同试验1；

对照试验6经过步骤1)、2)、3)，上清用Qiagen M48磁珠试剂盒提取DNA；

对照试验7未经过步骤1)、2)、3)，用M48磁珠试剂提取DNA；

对照试验8经过步骤1)、2)、3，上清改用Microcon-100纯化柱纯化浓缩DNA。

经以上实验提取到的DNA溶液均用ABI公司的ID试剂盒以4μL模板+6 μLMix的体系进行多重PCR复合扩增，并以相同的体系和条件进行电泳检测， 所得结果如图2-图9所示。其中，图2为系列对照试验1的结果：16个STR位 点完整，峰高均在800以上，符合案件检测对16个STR位点分析的要求，说明 脱落细胞DNA经过蛋白酶消化、温浴处理后能够高效释放出来，在PEG-乙醇 结合体系中高效吸附在磁珠表面。图3为系列对照试验2的结果：CSF1PO位点 的峰已丢失，D12S391和D3S1350位点的峰有高有底，扩增不平衡现象明显， D7S820和D18S51位点多了一个峰，即有杂峰，这些都严重影响对检测结果的 分型，不符合案件检测对16个STR位点分析的要求，试验说明脱落细胞未经蛋 白酶消化，DNA释放不完全或断裂。图4为系列对照试验3的结果：小片段效 果较好如D8S1179和D19S433位点峰均出，大片度的峰太低，在50以下如 D7S820，并且有杂峰现象如D13S317位点，说明在PEG-乙醇体系中DNA结 合磁珠效率差，对照试验2和3说明蛋白酶消化、70-100度温浴细胞高效释放 DNA，DNA结构稳定，在PEG-乙醇体系中利于与磁珠结合。图5为系列对照 试验4的结果：16个位点均未出，图6为系列对照试验5的结果，只出了位点 D8S1179、D5S818、vWA和D8S1043，但峰在100以下，D8S1043有杂峰现象， 不符合案件检测对16个STR位点分析的要求，对照试验4和5说明结合液体系 中必须同时存在乙醇和PEG，保证DNA与磁珠结合效率高，DNA结构相对完 整，获得长度合适DNA片段能够满足案件检测中16个STR位点复合扩增的需 要。图7为系列对照试验6的结果，图8为系列对照试验7的结果，二者结果 相差不大，16个位点均未出，峰高在200以下，并且杂峰也比较多，影响结果 的判读，不符合案件检测对16个STR位点分析的要求，图9为系列对照试验8 的结果，同图6相似，只出了6个位点的峰，峰高比较低。丢峰表明要么DNA 结构已破坏要么DNA提取量低，不能获得足量、长度合适满足16个STR位点 扩增的DNA。试验7说明胍盐磁珠(M48试剂)结合体系可能破坏的DNA结 构或者结合效率低下。试验6、8说明样品经蛋白酶消化、70-100度温浴DNA 高效释放后，PEG-乙醇磁珠结合体系不仅高效吸附DNA而且保证了DNA结构 稳定，优于胍盐磁珠(M 48试剂)结合体系及胍盐纯化柱结合体系 (Microcon-100试剂)——这两种体系为微量检材DNA提取常用试剂。综上8 个系列对照试验的结果对比可知，用本发明的试剂和方法提取到的DNA溶液能 获得完整的STR分型，且STR峰高均在200以上，而当裂解条件和结合体系发 生变化时，均未获得完整的STR分型，已出的峰峰值基本在200以下。

实施例三结合液II的乙醇换成甲醇及丙醇、异丙醇

将实施例一中结合液II的乙醇分别换成甲醇及丙醇、异丙醇，用磁珠法分 别提取现场案件中的拖鞋、牙刷、喝水用的瓷杯上的DNA；

除提取步骤3中的80μL结合液II分别换成80μL甲醇及丙醇、异丙醇外， 其他操作同实施例一。

图10为案件现场遗留的拖鞋，用甲醇替换结合液II的复合STR扩增图谱； 图11为案件现场遗留的牙刷，用丙醇替换结合液II的复合STR扩增图谱；图 12为案件现场遗留的喝水用的瓷杯，用异丙醇替换结合液II的复合STR。由图 10、图11、图12可知结合液II的乙醇分别换成甲醇、丙醇及异丙醇后，经相同 方法提取案件现场生物检材的检测结果均为16个STR位点完整，峰高均在200 以上，符合案件检测对16个STR位点分析的要求，说明该提取方法及本试剂盒 中的结合II可用甲醇、丙醇及异丙醇替换。

参考文献：

1.辛军平等，医学难检样品的处理及检测方法研究，刑事技术，2001，6。

2.王琴等，DNA-STR分型检验人体案件微量检材2例，刑事技术，2004，5。

3.王琴等，人体案件微量检材的荧光标记STR分型，法律与医学杂志，2004， 11(1)。

4.张庆霞等，提取痕量检材DNA破获凶杀案1例，法医学杂志，2007，2，1 (23)。

5.王玉健等，衣帽上案件微量检材微量DNA检测方案初探，刑事技术，2007， 2。

6.张志超等，磁性二氧化硅微球的表面修饰及其在植物基因组核酸纯化中的应 用，分析化学研究报告，2007，1(35)。

7.丛宪玲等，采用二氧化硅微球法回收DNA的实验研究，中国免疫学杂志， 2005，5。