一种人类DNA STR检测用标准物质的制备方法

摘要

本发明公开了一种人类DNA STR检测用标准物质的制备方法，采用分子克隆技术制备人类DNA STR检测用标准物质。它的最大特点是将人工合成或PCR扩增获得的含有STR基因座的片段与质粒重组，将重组质粒转入细胞中，通过测序筛选出含有正确插入片段的克隆，并大量繁殖，提取重组质粒，通过酶切、纯化、混合制备出大量优质DNA STR检测用标准物质。本发明所述制备方法过程简单、成本低，本发明制备的DNA STR检测用标准物质具有良好的遗传稳定性，易于保存。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人类DNA STR检测用标准物质的制备方法，用于解决法医学、人类学、遗传学和疾病等领域的个体识别、亲子鉴定以及基因诊断方面的DNA检测的准确性和标准化问题。 

背景技术

标准物质是具有准确量值的测量标准，按照“国际通用计量学基本术语”和“国际标准化组织指南30”，标准物质(reference material，RM)有如下定义：具有一种或多种足够均匀和很好地确定了的特性值，用以校准测量装置，评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质。通过标准物质实现了量值的传递和溯源，使得测量的标准可溯源至国际基本单位。 

DNA标准物质(DNA standard reference materials，简称SRM)，是具有特性量值的DNA测量标准，能够保证DNA测量结果的有效性和可比性，保证测量结果可溯源至国际单位制或者其他国际一致认可的单位，确保实验室DNA检测结果的可比性及一致性。 

DNA检测属于生物技术的范畴，快速发展的生物技术对有效性检测提出了更高的要求，生物计量作为一门崭新的科学也得到了人们的关注。1999年10月，第21届国际计量大会决定把生物计量学提上日程。随后，物质的量咨询委员会(Consultative Committee for Quantity ofSubstance-Metrology，CCQM)成立了生物分析工作组(BioanalysisWorking Group，BAWG)，至2007年已召开了11次会议。该工作组的主要目的是建立生物技术可溯源测量系统，优先考虑的是核酸测量、蛋白质测量及其方法、分析过程的标准化，以及标准物质的研制，以 便巩同核酸和蛋白质测量的应用领域。 

DNA检测主要采用PCR方法检测，人类DNA检测用标准物质通常是具有特性量值的人类DNA基因组，以人类DNA检测用标准物质作为模板进行PCR，可以为DNA检测工作提供科学的溯源保证，以提高检测结果的科学性和可靠性，也可以对仪器进行检验及校准、评价和研究新的DNA检验方法、实验室认可、DNA分析的内部质量控制，还可以用于对DNA检验人员水平及能力的考核。 

在法医DNA检测领域，其检测技术迅速发展，检测过程的标准化及规范化显得尤其重要，这就需要标准物质对检测过程进行质量控制。1998年，美国联邦调查局(FBI)的DNA建议委员会标准9.5指出：“实验室每年或者实验条件变化时都应该使用美国国家标准技术研究所(NIST)提供的标准物质(SRM)对DNA检验步骤进行核查。”目前我围还没有适合法医DNA检测的标准物质。 

法医DNA检测经历了限制性片段长度多态性(RFLP)、短串联重复序列(STR)和单核苷酸多态性(SNP)。同样，法医DNA标准物质也随着检测技术的发展而不断推出新的标准物质。NIST作为美国的商业部门，负责开发国家及国际标准物质。在NIST提供的标准物质中，有多种标准物质用于法医DNA的分型检测——基于RFLP分型技术的SRM2390、基于STR分型技术的SRM2391b、用于线粒体DNA检测的SRM2392、用于Y染色体DNA分型的SRM2395和用于人类DNA定量的SRM2372。 

目前最常用于法医DNA检验的遗传标记为STR遗传标记，短串联重复序列(short tandem repeat，STR)是广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列。它由2-6个碱基作为核心序列，呈串联重复排列，其长度多态性主要由核心序列的数目变化和重复次数不同而产生。STR分布广、数目多，约占人类基因组的10％，一般认为，人类基因组平均每6-10kb就有1个STR基因座，不同STR基因座的组合产生了极为丰富的基因座图谱信息，为法医物证学中的个体识别和亲子鉴定提供了基础。法医DNA STR检测用标准物质用于 对DNA检测过程中的质量控制和质量保证，通过使用标准物质，使检测过程的标准化和规范化，建立标准化的DNA分析技术，确保法医DNA检测分析结果的准确性、公正性和可靠性，为DNA的检测结果提供了质量保障，DNA标准物质也有利于各国各实验室之间的数据的交流。 

美国国家标准技术研究所(NIST)1995年发布了STR检测用标准物质-SRM2391，SRM2391只含有4个STR基因座(TH01、F13A01、vWA和FES/FPS)的消息，这远远不能满足STR分型技术迅速发展对STR检测用标准物质的需求，SRM2391应包括所提供的所有的DNA样品的STR消息，至少应包括FBI的CODIS中13个核心基因座。1998年6月NIST对SRM2391重新进行了分析检测，检测了各组分的25个基因座分型信息，包括CODIS中13个核心基因座以及其他8个STR基因座(CSP1PO、D2S 1338、D3S 1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、F13A01、F13B、FES/FPS、FGA、LPL、Penta D、Penta E、TH01、TPOX和vWA)，以及HLA-DQAI、PolyMarker、D1S80和Amelogenin基因座。分析检测后，NIST发布了SRM2391的STR基因分型定值，新推出针对STR检测的DNA标准物质SRM2391a，其包括SRM2391的细胞组分和基因组DNA组分，而去除了扩增产物、D1S80等位基因分型混合物和分子量标志物，含有从9947A和9948细胞系所提取并定量为1ng/μL的基因组DNA。2003年1月NIST又推出针对STR检测的DNA标准物质SRM2391b来替代以前的SRM2391a，SRM2391b含有SRM2391a中的所有STR基因座，此外还增加了SE33基因座。 

在商业化的扩增试剂盒中提供的人类基因组9947A、9948、K562等标准物质作为PCR扩增的阳性对照，对DNA检测起到了内部质量控制的作用。但是，大多数DNA检测实验室使用的标准物质都是由美国国家标准技术研究所(NIST)提供的，其标准物质含有的DNA是从人类细胞提出而来，采用人类细胞制备DNA标准物质具有如下缺点： 

1、细胞的遗传不稳定。细胞培养传代到一定代数，染色体数目和结构会发生改变，出现亚二倍体、超二倍体或多倍体，DNA位点发生碱基缺失或插入突变。 

2、细胞保存量大。由于细胞遗传的不稳定性，需要细胞的培养传代过程中需保留足够的备份，导致细胞保存量大。 

3、细胞培养条件要求高。培养细胞时要控制好细胞生成的环境中各因素如温度、气相、pH值、渗透压等，此外，还需要与细胞直接接触者如培养瓶、底物、培养剂等或间接接触者如瓶盖瓶塞等无细胞毒性，如果具细胞毒性会导致细胞的死亡，同样避免细菌等微生物的污染、不同细胞类型的交叉污染及有害物质的污染。 

因此，本发明采用分子克隆技术制备了人类DNA STR检测用标准物质。 

发明内容

针对现在使用的DNA STR检测用标准参考物质制备过程存在的细胞遗传不稳定、培养条件要求高的问题，本发明的一个目的是提供一种易于保存、遗传性能稳定的DNA STR检测用标准物质的制备方法。 

本发明提供的制备人类DNA STR检测用标准物质的方法，包括以下步骤： 

步骤1、以人类基因组作为模板，人工合成或PCR扩增获得含有人类DNA短串联重复序列基因座的目的基因片段； 

步骤2、将步骤1的目的基因片段与质粒载体重组，重组质粒转入到细胞中，筛选出含有目的基因片段的阳性克隆并进行测序鉴定； 

步骤3、提取步骤2鉴定的阳性克隆中的重组质粒，将含有不同基因型的重组质粒等比例混合，配置成人类基因组的DNA STR检测用标准物质。 

作为优选，所述目的基因片段为5～200种，每种目的基因片段含有至少一个基因型。 

更优选，所述目的基因片段为10～50种，每种目的基因片段含有至少一个基因型。 

作为优选，步骤2所述细胞是大肠杆菌细胞，所述质粒载体为大肠杆菌相应的质粒。 

作为优选，步骤3所述重组质粒为线性质粒。 

作为优选，步骤1所述目的基因片段为分别含有STR基因座CSFlPO、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、FGA、Penta D、Penta E、Th01、Tpox、vWA和性别标记位点Amelogenin的片段。用SEQ ID No.1-SEQ ID No.42所示引物序列进行PCR扩增。 

本发明还提供所述的方法制备的人类DNA STR检测用标准物质。 

本发明的另一目的是提供包含上述描述的人类DNA STR标准物质的试剂盒。 

本发明人选择19个STR基因座(CSFlPO、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、FGA、Penta D、Penta E、Th01、Tpox、vWA)和性别标记位点Amelogenin制备STR检测用标准物质。对上述19个STR基因座和性别标记位点Amelogenin的检测可以基本满足法庭科学中对于个人识别和亲子鉴定中DNA检测的要求。 

本发明人从GenBank和相关文献查找到的上述19个STR基因座和性别标记位点Amelogenin全序列，以查找到的序列为模板通过Primer Premier软件设计几对引物，然后用Oligo软件筛选出一对引物扩增一个基因座。在设计STR检测用标准物质的引物时，必须要保证基因座中重复序列位于扩增片段的中间位置，且距离正向和反向引物均在400-600bp之间。由于性别标记位点Amelogenin中的X、Y两个位点同源性不是很高，因此需要针对X、Y两个位点各设计一对引物。设计的引物在5’端加入限制性酶切位点，有利于将PCR产物插入质粒pUC18中。设计的引物序列见表1。 

表1.设计的引物序列 

注：下划线为限制性酶切位点序列。 

利用上述引物进行聚合酶链式反应扩增获得目的基因，再根据设计的引物不同的酶切位点，将质粒pUC18和经纯化的PCR产物用相应的酶进行双酶切。用相同的酶双酶切后的pUC18及PCR产物用T4连接酶过夜连接，转入大肠杆菌JM109，挑取转化子用菌落PCR和提取质粒两种方法鉴定并进行测序。 

查找基因组K562、9947A和9948中本发明需要克隆的19个STR基因座和性别标记位点Amelogenin的基因型，通过分析测序结果，找到含有所有基因型的重组子测序结果。将含有这些重组子的菌液保 存。此外，挑去这些保存的菌液，过夜培养，提取重组质粒。通过分析各个重组子的序列，选择远离载体多克隆位点且在重组质粒中只有一个酶切位点(Sca I或Aat II)的限制性内切酶单酶切重组质粒，即含有基因座D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、FGA、Penta E、Th01、Tpox、vWA和性别标记位点Amelogenin的重组质粒用限制性内切酶Sca I酶切，含有基因座Penta D、D21S11、CSFlPO和D2S1338的重组质粒用限制性内切酶Aat II酶切，使重组质粒呈线状，酶切后纯化。 

重组质粒进行单酶切有利于别人用重组质粒为模板PCR时PCR产物的均匀性(即PCR产量相同)，如果不进行单酶切，质粒呈超螺旋、环状和线状三种形态，且这三种形态比例不能确定，在PCR过程中Taq酶不易与超螺旋、环状质粒结合，导致以三种形态质粒为模板PCR效率不一致，从而影响PCR产物的均匀性。单酶切质粒后，质粒均呈线状，PCR效率一致。 

将上述纯化好的用限制性酶单酶切的重组质粒，根据1ng/μL人类基因组K562、9947、9948中20个基因座包括的基因型及含有该基因型的摩尔量，将不同的含有基因型的质粒等比例混合，配置成3套法医DNA标准物质。 

本发明采用分子克隆技术制备人类DNA短串联重复序列检测用标准物质，它的最大特点是自行设计引物，将人工合成或PCR扩增获含有STR基因座的片段与质粒重组，将重组质粒转入大肠杆菌JM109中，通过测序筛选出含有正确插入片段的基因型，并保存菌液。可以通过细菌大量繁殖，提取重组质粒，通过单酶切、纯化、混合制备出大量优质STR分型标准物质。 

本发明制备的STR检测用标准物质与通过人类细胞培养制备STR检测用标准物质相比，主要优点如下： 

1)本发明利用分子克隆的方法，在细胞内制备人类STR分型标准物质，制备过程简单、成本低、对人员水平要求低； 

2)本发明所述制备方法获得的STR检测用标准物质与通过人类细胞培养制备STR检测用标准物质相比，具有良好的遗传稳定性； 

3)本发明所制备的菌液和STR检测用标准物质易于保存。 

附图说明

图1为本发明制备方法总体流程； 

图2为PCR扩增产物电泳图； 

M：DNA 100bp ladder；1：K562-D2S1338；2：9947A-D2S1338；3：9948-D2S1338； 

4：K562-D3S1358；5：9947A-D3S1358；6：9948-D3S1358； 

7：K562-D8S1179；8：9947A-D8S1179；9：9948-D8S1179；10： 

K562-D5S818；11：9947A-D5S818；12：9948-D5S818；13： 

K562-D21S11；14：9947A-D21S11；15：9948-D21S11；16： 

K562-D18S51；17：9947A-D18S51；18：9948-D18S51； 

19：K562-TPOX；20：9947A-TPOX 

图3为PCR扩增产物电泳图； 

M：DNA 100bp ladder；1：K562-D16S539；2：9947-D16S539； 

3：9948-D16S539； 

4：K562-THO1；5：9947-THO1；6：9948-THO1； 

图4为PCR扩增产物电泳图； 

M：DNA 100bp ladder；1：K562-Csf1Po；2：9947-Csf1Po； 

3：9948-Csf1Po；4：K562-vWA；5：9967-vWA；6：9948-vWA； 

7：K562-Amelogenin-Y；8：9947-Amelogenin-Y； 

9：9948-Amelogenin-Y；10：K562-D6S1043；11：9947-D6S1043； 

12：9948-D6S1043；13：K562-Amelogenin-X；14：9947A- 

Amelogenin-X；15：9948-Amelogenin-X 

图5为PCR扩增产物电泳图； 

M：DNA 100bp ladder；1：K562-D13S317；2：9947-D13S317； 

3：9948-D13S317； 

4：K562-Penta E 5：9947-Penta E；6：9948-Penta E；7：K562-Fga； 

8：9947-Fga； 

9：9948-Fga；10：9948-Tpox； 

图6为PCR扩增产物电泳图； 

M：DNA 100bp ladder；1：K562-D7S820；2：9947-D7S820； 

3：9948-D7S820； 

4：K562-D19S433；5：9947-D19S433；6：9948-D19S433； 

7：K562-D12S391；8：9947-D12S391；9：9948-D12S391 

图7为PCR扩增产物电泳图； 

M：DNA 100bp ladder；1：K562-vWA；2：9947-vWA；3：9948-vWA； 

4：K562-Penta D；5：9947-Penta D；6：9948-Penta D 

图8为质粒双酶切后电泳图； 

1：pUC18；2：pUC18(Pst I/EcoR I双酶切)；3：pUC18(Hind III/PstI双酶切)；4：pUC18(XbaI/EcoRI双酶切)；5：pUC18(XbaI/PstI双酶切)；6：pUC18(Pst1/BamHI双酶切)；7：pUC18(XbaI/HindIII双酶切)；8：pUC18(EcoR I/Hind III双酶切)；9：pUC18(XbaI/BamHI双酶切) 

图9为菌落PCR电泳图； 

1、10：分别为普通PCR产物9947-THO1、9947-D21S11；2-9、11-22：分别为菌落PCR产物9947-THO1-(1-4)、9948-THO1-(1-4)、 

K562-D21S11-(1-4)、9947-D21S11-(1-4)、9948-D21S11-(1-4)； 

图10为菌落PCR电泳图 

1、6、15：分别为普通PCR产物K562-D2S1338、K562-D3S1358、9947-D8S1179；2-5、7-14、16-23：为菌落PCR产物9948-D2S1338-(1-4)、K562-D3S1358-(1-4)、9947-D3S1358-(1-4)、K562-D8S1179-(1-4)、9948-D8S1179-(1-4) 

图11为质粒电泳图； 

1：PUC18(对照)；2-5：K562-D18S51-(1-4)；6-9： 

9947A-D18S51-(1-4)；10-13：9948-D18S51-(1-4)；14-17： 

K562-1043-(1-4)；18-21：9947A-1043-(1-4)；22-25：9948-1043-(1-4) 

图12质粒电泳图； 

1：PUC18(对照)；2-5：K562-D21S11-(1-4)；6-9： 

9947A-D21S11-(1-4)；10-13：9948-D21S11-(1-4)；14-17： 

K562-CSF1PO-(1-4)；18-21：9947A-CSF1PO-(1-4)；22-23： 

9948-CSF1PO-(1-4)； 

图13为重组质粒酶切电泳图； 

1：pUC18；2：重组质粒D3S1358；3-25：重组质粒用限制性内切酶ScaI酶切；3：Amelogenin-X；4：Amelogenin-Y；5-8：D3S1358(14R、15R、16R、17R)；9-11：D5S818(11R、12R、13R)；12-15：D6S1043(11R、12R、15R、18R)；16-18：D7S820(9R、10R、11R)；19-20：D8S1179(12R、13R)；21-25：Penta E(5R、11R、12R、13R、14R)； 

图14为重组质粒酶切电泳图； 

1：pUC18；2-5：重组质粒D12S391、D13S317、D16S539、D18S51； 

6-25：重组质粒用限制性内切酶ScaI酶切；6-9：D12S391(18R、20R、23R、24R)；10-11：D13S317(8R、11R)；12-13：D16S539(11R、12R)；14-17：D18S51(15R、16R、18R、19R)；18-20：Th01(6R、8R、9.3R)；21-22：Tpox(8R、9R)；23-25：vWA(16R、17R、18R)； 

图15为重组质粒酶切电泳图； 

1：重组质粒D19S433；2-9：重组质粒用限制性内切酶ScaI酶切； 

2-5：D19S433(18R、20R、23R、24R)；6-9：FGA(21R、23R、24R、26R)； 

图16为重组质粒酶切电泳图； 

1：重组质粒D2S1338；2-7：重组质粒用限制性内切酶Aat II酶切；2-4：D2S1338(17R、19R、23R)；6-9：D21S11(29R、30R、31R) 

图17为重组质粒酶切电泳图； 

1-2：重组质粒Penta D、CSFlPO；3-10：重组质粒用限制性内切 酶Aat II酶切；3-6：Penta D(8R、9R、12R、13R)；7-10：CSFlPO(9R、10R、11R、12R)。 

具体实施方式

本发明公开了一种人类DNA短串联重复序列检测用标准物质的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。 

本发明选取了19个STR基因座(CSFlPO、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、FGA、Penta D、Penta E、Th01、Tpox、vWA)和性别标记位点Amelogenin制备STR分型标准物质；以人类基因组K562、9947A和9948作为模板，人工合成或用聚合酶链式反应扩增获取本发明选取的含有19个STR基因座和性别标记位点Amelogenin的基因片段，将上述基因片段插入到质粒pUC18的多克隆位点，构建成重组质粒，重组质粒再转化至感受态细菌JM109中培养和繁殖，然后通过测序筛选出已含有插入片段正确的克隆及基因型，并保存菌液；挑去这些保存的菌液，过夜培养，提取重组质粒，将提取的重组质粒，选择远离载体多克隆位点且在重组质粒中只有一个酶切位点的限制性酶单酶切重组质粒，使重组质粒呈线状，含有基因座D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、FGA、Penta E、Th01、Tpox、vWA和性别标记位点Amelogenin的重组质粒用限制性酶Sca I酶切，含有基因座PentaD、D21S11、CSFlPO和D2S1338的重组质粒用限制性酶Aat II酶切，酶切后纯化。将上述纯化好的用限制性酶单酶切的重组质粒，根据1ng/μL人类基因组K562、9947、9948中20个基因座包括的基因型及含 有该基因型的摩尔量，将不同的含有基因型的质粒等比例混合，配置成3套法医DNA标准物质。 

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。 

实施例1：引物设计 

选择合适的STR基因座。根据目前我国主要使用ABI公司的AmpFISTRSinofiler^TM、Promega公司的PowerPlex16以及我国公安部物证鉴定中心研制的DNATyper15^TM商业化试剂盒中所用的STR基因座，本发明人特选择表1中的19个STR基因座(CSFlPO、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、FGA、Penta D、Penta E、Th01、Tpox、vWA)和性别标记位点Amelogenin制备STR检测用标准物质。 

设计上述19个STR基因座和性别标记位点Amelogenin的引物。从GenBank和相关文献查找到的上述19个STR基因座和性别标记位点Amelogenin全序列，以查找到的序列为模板通过Primer Premier软件设计几对引物，然后用Oligo软件筛选出一对引物扩增一个基因座。在设计STR分型标准物质的引物时，必须要保证基因座中重复序列位于扩增片段的中间位置，且距离正向和反向引物均在400-600bp之间。由于性别标记位点Amelogenin中的X、Y两个位点同源性不是很高，因此需要针对X、Y两个位点各设计一对引物。设计的引物在5’端加入限制性酶切位点，有利于将PCR产物插入质粒pUC18中。设计的引物序列见表1。 

表1.设计的引物序列 

注：下划线为限制性酶切位点序列 

实施例2： 

接着，分别以人类基因组K562、9947A和9948作为模板，扩增上述19个STR基因座和性别标记位点Amelogenin，PCR反应体系和条件如下见表3和表4： 

表3、PCR扩增采用50μL反应体系 

表4、PCR热循环参数 

扩增产物琼脂糖电泳结果见图2-7。 

实施例3： 

根据设计的引物不同的酶切位点，将质粒pUC18和经纯化的PCR产物用相应的酶进行双酶切，不同的PCR产物用的酶将表5。 

表5、PCR产物双酶切时所用的酶 

质粒pUC18经Pst I/EcoR I、Hind III/Pst I、Xba I/EcoR I、Xba I/PstI、Pst 1/BamH I、Xba I/Hind III、EcoR I/Hind III、Xba I/BamH I双酶切后，电泳结果见图8。 

用相同的酶双酶切后的pUC18及PCR产物用T4连接酶过夜连 接，转入大肠杆菌JM109，挑取转化子鉴定。首先，每个平板上挑取4个菌落用菌落PCR和提取质粒两种方法鉴定转化子，鉴定结果见图9-12。鉴定为重组子的菌液，保菌后送去测序，每种基因组的每个基因座送4个重组子测序。 

实施例4： 

查找基因组K562、9947A和9948中本发明需要克隆的19个STR基因座和性别标记位点Amelogenin的基因型，见表6。 

表6、克隆的19个STR基因座和性别标记位点Amelogenin 

在基因组K562、9947和9948中的基因型 

通过分析测序结果，找到了含有表6中所有基因型的重组子测序，将含有这些重组子的菌液保存。此外，挑去这些保存的菌液，过夜培养，提取重组质粒。通过分析各个重组子的序列，选择远离载体多克隆位点且在重组质粒中只有一个酶切位点(Sca I或Aat II)的限制性内切酶单酶切重组质粒，即含有基因座D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、FGA、Penta E、Th01、Tpox、vWA和性别标记位点Amelogenin的重组质粒用限制性内切酶Sca I酶切，含有基因座Penta D、D21S11、CSFlPO和D2S1338的重组质粒用限制性内切酶Aat II酶切，使重组质粒呈线状，酶切后纯化，重组质粒单酶切纯化后电泳结果见图13-17。 

质粒单酶切有利于别人用重组质粒为模板PCR时PCR产物的均匀性(即PCR产量相同)，如果不单酶切，质粒呈超螺旋、环状和线状三种形态，且这三种形态比例不能确定，在PCR过程中Taq不容易与超螺旋、环状质粒结合，导致以三种形态质粒为模板PCR效率不一致，从而影响PCR产物的均匀性。单酶切质粒后，质粒均呈线状，PCR效率一致。 

将上述纯化好的用限制性酶单酶切的重组质粒，根据1ng/μL人类基因组K562、9947、9948中20个基因座包括的基因型及含有该基因型的摩尔量，将不同的含有基因型的质粒等比例混合，配置成人类DNA短串联重复序列检测用标准物质即3套法医DNA标准物质K562、9947A、9948类似物。 

实施例5：本发明所述方法制备的3套法医DNA标准物质验证 

采用商业化试剂盒《 PCR AmplificationKit》检测本发明实施例1-4配置成3套法医DNA标准物质K562、9947A、9948类似物与人类基因组K562、9947A、9948的差异。 

具体的实验步骤：用商业化试剂盒(如ABI公司的AmpFISTRSinofilerTM)检测人类基因组9947A、9948、K562和它们类似物各基 因组的基因型。 

结果分析：人类基因组9947A与DNA标准物质9947A类似物检测结果中各基因座的基因型是否相同，如果相同，说明我们制备的DNA标准物质9947A类似物可以取代人类基因组9947A作为标准物质；如果不相同，则就不能取代人类基因组9947A作为标准物质。实验结果证明，人类基因组9947A与本发明DNA标准物质9947A类似物、人类基因组9948与本发明DNA标准物质9948类似物、人类基因组K562与本发明DNA标准物质K562类似物的检测的中各基因座的基因型相同，结果图略。可以用本发明制备的DNA标准物质9947A、9948、K562类似物分别取代人类基因组9947A、9948、K562作为标准物质。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。