水稻miR166在提高植物镉胁迫耐受性中的应用

摘要

本发明公开了一种水稻miR166在提高植物镉胁迫耐受性中的应用，所述水稻miR166的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过将水稻miR166转化到水稻愈伤组织，将获得的T2代种子播种在含镉培养液中，发现该miRNA可以提高对镉胁迫的耐受性，缓解镉对它的毒害。

说明书

技术领域

本发明涉及功能基因组学领域，尤其涉及一种水稻miR166在提高植 物对镉胁迫耐受性中的应用。

背景技术

随着工业污染的加剧以及含重金属肥料的大量使用，重金属已经成为 造成土壤污染的祸首之一。我国重金属引起的土壤污染形势已相当严峻。 2006年我国受镉、砷、铬、铅等重金属污染的耕地近3亿亩，约占耕地总 面积的1/5；我国每年因重金属污染粮食达1200万吨，造成直接经济损失 超过200亿元。其中，镉(Cadmium，Cd)作为污染最严重的重金属之一， 污染面积和程度呈上升趋势，不仅影响土壤生态结构和功能，而且能抑制 作物的生长发育，降低产量和品质，并通过食物链进入人体，引发各种疾 病，最终危害人体健康。水稻是世界上最重要的农作物，全球一半以上的 人口以稻米为主食，我国是世界上第一种稻大国，目前我国稻米中重金属 超标现象已引起了国家各部委的高度重视。因此，探明水稻对重金属的耐 受机理，提出避免水稻重金属伤害的有效措施和提高重金属抗性以及降低 稻米中重金属的累积，将对保障农产品安全、生态安全和人民健康，促进 农业生产的可持续发展意义重大。

植物在长期的进化过程中产生了对重金属的多种抗性。不同的植物种 类或同种植物不同的基因型对于重金属胁迫的抗性反应机制是不完全相 同的，也是十分复杂。近年来从生理生化与分子水平上开展了大量的基础 研究工作，研究表明有机酸、氨基酸、含氮化合物，植物螯合肽 (Phytochelatin，PC)和金属硫蛋白在植物对重金属的解毒作用中发挥了重 要作用。一些与植物重金属耐性相关的基因也得到了鉴定与功能的描述， 这些抗逆基因基本为直接参与代谢与生理变化的效应基因，它们通过控制 代谢小分子或蛋白的表达参与抗逆过程。目前一些研究功能基因组学的新 方法和实验技术体系如cDNA微阵列、基因芯片、基因表达系统分析(serial  analysis of gene expression，SAGE)、基因敲除(gene knockout)和RNAi 分析均能有效分析大量基因的表达和功能模式，并在重金属相关功能基因 资源发掘上取得了一定进展。植物参与环境胁迫响应还有另一类重要的功 能基因即调节基因，它们通过调控其下游许多逆境诱导基因的表达而间接 影响代谢与生理过程，但这一类重金属耐性的调节基因研究报道甚少，重 金属相关功能基因资源发掘尚待开展。

微RNA(microRNA，或miRNA)就是一类在转录后水平调控基因表达 的小分子RNA。miRNA广泛存在于植物基因组中的、长度约为22个核苷 酸的、内源非编码小分子RNA，它自从被发现以来就成为生命科学领域 的研究热点。miRNA作为新型的调控基因表达的小分子RNA，主要在转 录后水平上通过介导靶mRNA分子的切割或翻译抑制来调节植物基因的 表达，从而调控植物器官的形态建成、生长发育、激素分泌与信号转导以 及植物对外界环境胁迫因素的应答等过程。随着内源小RNA的发现及其 功能研究，利用小RNA技术改良植物对生物与非生物胁迫的耐性成为了 一个重要的技术手段。miRNA对重金属耐性的功能研究，并通过小RNA 的遗传操作改良禾本科作物的抗逆性，将为解决作物对重金属耐性问题提 供新思路，并具有重要的应用前景。目前，国内外还没有利用基因工程手 段将参与重金属应答的miRNA导入水稻、玉米、草莓、烟草等作物获得 重金属耐受作物株系，但通过小分子RNA的遗传操作改良作物的抗逆性 的前景很光明。

近年来的研究表明，miRNA在植物重金属胁迫响应过程中扮演着重 要角色。杨志敏等发现在甘蓝型油菜和蒺藜苜蓿中，部分miRNA的表达 可受重金属镉的诱导与调节(Xie，F.L.，Huang，S.Q.，Guo，K.，Xiang，A.L.， Zhu，Y.Y.，Nie，L.，Yang，Z.M.Computational identification of novel  microRNAs and targets in Brassica napus.FEBS Lett，2007，581：1464-1474； Zhao，S.Z.，Si，Q.H.，Zhi，M.Y.Bioinformatic identification and expression  analysis of new microRNAs from Medicago truncatula.Biochem.Biophys. Res.Commun，2008，374：538-542.)。他们还构建镉胁迫下水稻幼苗的 small RNA文库，克隆了19个新的miRNA，并发现其中多数miRNA在 镉胁迫下表达发生变化，如miR604在镉处理下表达下调，其靶基因脂转 移蛋白表达上升。而且脂转移蛋白参与植物多种抗逆性反应并介导植物激 素信号转导等过程(Huang，S.Q.，Peng，J.，Qiu，C.X.，Yang，Z.M.Heavy  metal-regulated new microRNAs from rice.J.Inorg.Biochem，2009，103： 282e287.)。朱健康等在2006年研究发现miR398在拟南芥抵抗强光、重 金属Cu、Fe等氧化胁迫中发挥作用：在氧化胁迫条件下，miR398的表达 量被诱导降低，miR398调控的Cu/Zn超氧化物歧化酶(CSDs)mRNA的 表达量升高，Cu/Zn超氧化物歧化酶可快速地将超氧化物转变成过氧化物 和分子氧，组成了抵抗高毒性超氧化物的第一道防线，导致拟南芥对重金 属胁迫的耐受性也大大增加(Sunkar，R.，Kapoor，A.，Zhu，J.K. Posttranscriptional induction of two Cu/Zn superoxide dismutase genes in  Arabidopsis is mediated by downregulation of miR398 and important for  oxidative stress tolerance.Plant Cell，2006，18：2051-2065.)。

miR166是一种广泛存在于单子叶植物和双子叶植物中的miRNA。在 植物众多miRNA中，研究表明miR166通过调节其靶基因：同源异型域 一亮氨酸拉链蛋白(homeodomain-leucine zipper protein，HD-Zip)，从而调 控拟南芥和水稻的叶、花、根的生长发育，并且在植物对逆境胁迫的响应 过程中发挥着重要作用。过量表达miR166会造成拟南芥植株生长受抑， 花器官簇生，顶端分生组织发育异常等表型。蒺藜苜蓿中过量表达miR166 会造成植株根瘤和侧根数目减少，维管系统发育异常。受干旱诱导表达的 miR166通过影响根的数量和维管组织，从而来调节植物的抗干旱能力。 在缺水胁迫下蒺藜苜蓿根中miR166表达上调，且野生型蒺藜苜蓿在缺水 胁迫下的表型与过表达miR166的转基因的植株表型相似。干旱胁迫下野 生二粒小麦和大麦根中的miR166均表达下调，可能存在其他的未鉴定的 靶基因。盐胁迫下玉米的miR166表达下调。水稻miR166还与冷胁迫和 赤霉素处理有关。以上研究结果表明，miR166不仅可以调节叶、花、根 的发育，并且在植物应答多种环境胁迫中发挥作用。

发明内容

本发明提供了一种水稻miR166在提高植物镉胁迫耐受性中的应用。

一种水稻miR166在提高植物镉胁迫耐受性中的应用，所述水稻 miR166的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述植物为水稻。

具体方法为：将包含所述水稻miR166的前体基因连接到载体上，通 过农杆菌介导转化到水稻愈伤组织，筛选培养，获得水稻转基因株系。

由于miR166本身序列很短，只有20几个bp，而前体序列相对较长， 连接到载体上，有利于转化实现，优选的，所述前体基因的碱基序列如 SEQ ID NO.2所示。

本发明通过将水稻miR166转化到水稻愈伤组织，将获得的T2代种 子播种在含镉培养液中，发现该miRNA可以提高植物对镉胁迫的耐受性， 缓解镉对它的毒害。

附图说明

图1为7天龄水稻幼苗60uM Cd胁迫6h根的miRNA芯片图谱，(Cy3 对照；Cy5处理样品)；

图2为7天龄水稻幼苗60uM Cd处理3，6，12，24h后，miR166m 及其靶基因HD-Zip的表达分析；

图3为miR166m过表达载体构建的过程凝胶图谱。a.miR166m前体 PCR扩增凝胶图谱；b.pMD19-T-miR166m质粒酶切鉴定图；c. p1301-miR166m重组质粒菌液PCR扩增凝胶图谱；d.p1301-miR166m重 组质粒酶切鉴定图；

图4为miR166m过表达水稻种子在60uM Cd处理下萌发7d后表型， (WT对照；35S：MIR166m转基因水稻)；

图5为生长五周的miR166m过表达水稻经200uM Cd处理14d的 表型，(WT对照；35S：MIR166m转基因水稻)。

具体实施方式

实施例1  基因的获得

以野生型水稻(中花11)七天苗龄幼苗为材料，取60uM CdCl₂处理 6h和对照组(未处理)的根0.1g，用液氮研磨并加入1ml Trizol(Invitrogen  生产)继续研磨至匀浆，转入1.5ml离心管中，12000×g离心10min，收 集上清至新离心管中。室温放置5min，加入0.2ml氯仿用力震荡15s， 使溶液充分混匀。室温放置5min，12000×g离心15min，收集上清。加 两倍上清体积的异丙醇，-20℃过夜沉淀。12000×g离心10min，去上清， 加1mL预冷的75％乙醇(DEPC-H₂O配制)洗沉淀。12000×g离心10min， 倒尽液体，室温干燥5min，沉淀重溶于50μL DEPC(焦碳酸二乙酯)水。 取2μg Total RNA进行电泳检测，并稀释样品测OD 260/280，OD 260/230 及浓度。利用2-5μg总RNA样品，通过YM-100(Millipore)微离心过滤 柱得到片段小于300nt的小RNA。Poly(A)聚合酶在分离到的小RNA 3′ 端加上poly(A)尾巴，再将一个寡聚核苷酸标记与这个poly(A)尾巴连接， (ligation)用于后续的荧光标记。用两个不同的标记物Cy3和Cy5来标 记处理组和对照组的两个RNA样品。

利用Version11.0microRNA数据库， (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)制作μParaflo^TM微流体芯片探 针。杂交反应通过利用μParaflo^TM微流体芯片，检测在60uM CdCl₂胁迫 下水稻根中miRNA的表达差异，如图1所示，结果发现miR166m在Cd 处理6h后表达量比对照(未处理)下降2倍以上。

根据Sanger microRNA数据库(miRBase)和TIGR数据库，发现 miR166m是水稻miR166家族成员之一，位于8号染色体，来源于基因间 区域。成熟序列如SEQ ID NO.1所示，前体序列如SEQ ID NO.2所示。

根据miRU靶基因预测软件发现，miR166m的靶基因是同源异型域一 亮氨酸拉链蛋白(homeodomain-leucine zipper protein，HD-Zip)。根据NCBI 和TIGR数据库查询，HD-Zip基因号为Os03g43930，mRNA长度为3081 bp，CSD为2589bp，基因编码产物大小166个氨基酸。

以野生型水稻(中花11)七天苗龄幼苗为材料，用60uM CdCl₂处理 0，3，6，12，24h，用Trizol法分别提取RNA，并用DNase I消化以去 除DNA污染。采用PrimeScriptTM RT reagent kit(Takara，Japan)合成 cDNA。miR166m利用具有茎环结构的RT引物进行反转录(RT引物序列： 5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATAC GACAGGGAA3-’)；HD-Zip利用oligo-d(T)进行反转录，采用SYBR  Premix Ex TaqTM(Takara，Japan)，在LightCycler480(Roche，Shanghai， China)荧光定量PCR仪上扩增miR166m和HD-Zip，PCR反应条件为95℃ 1min，变性95℃10s，退火58℃15s，延伸72℃15s，45个循环。 PCR引物如下：

miR166m-F，5’-GTCGGACCAGGCTTCA-3’

miR166m-R，5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′

HD-Zip-F，5’-ATGTCAAGAACCTCCCCAG-3’

HD-Zip-R，5’-CACACGCAAAAATCACTCA-3’

如图2所示，实时定量PCR实验结果验证了miR166m对HD-Zip的 负调控。

实施例2  基因克隆与转化

以野生型水稻中花11七天苗龄幼苗DNA为模板，利用PCR方法扩 增到miR166m前体基因的序列。具体操作如下：首先，提取野生型水稻 中花11七天龄幼苗DNA。取约0.2g水稻叶片用液氮研磨成粉末，转移 粉末到加有500μl提取液(100mM Tris-HCl，pH 8.0；20mM EDTA；500 mM NaCl)的离心管中，轻轻混匀。向管中加入100μl 10％SDS溶液，混 匀，65℃保温20min。然后加氯仿/异戊醇/乙醇(20∶1∶4)混合液600μl， 室温静止10min。4℃，12000rpm离心10min，转移上清至另一离心管中。 加入1ml预冷的无水乙醇充分混匀，-20℃沉淀DNA 20min。4℃，12000 rpm离心10min，弃上清，加70％乙醇500μl进行洗涤。4℃，12000rpm 离心10min，弃上清。轻微离心，用移液器将残留液体吸干。吹干DNA 沉淀后，溶于100μl含RNase酶(10μg/ml)TE中，37℃水浴30min， -20℃保存。根据已知的miR166m  前体序列 (http://www.mirbase.org/cgi-bin/get_seq.pl)，在database中查阅其所在基 因组位点的两端的序列，分别在前体发夹结构两端约50bp处设计引物， 所设引物如下：

miR166m-F，5’-CGGGGTACCCTTTCTCTGCTTTGGTGGTT-3’

miR166m-R，5′-AACTGCAGTTCCGATGGATTTCCTGGAC-3′

接着以DNA为摸板，利用所设引物扩增miR166m前体基因。PCR 反应体系为20μl，依次加入DNA模板1μl、10×PCR buffer 2μl、10mM dNTPs 2μl、10μM正向引物(miR166m-F)0.5μl、10μM反向引物 (miR166m-R)0.5μl、TaKaRa Taq(5U/μl)聚合酶0.2μl，最后加ddH₂O 补至20μl。PCR反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火58 ℃30s，延伸72℃30s，30个循环，最后延伸72℃10min，4℃保存。 PCR产物凝胶图谱如图3.a所示。

扩增后将miR166m前体基因DNA产物，利用天根生化科技(北京)有 限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，操作如下：将DNA条 带从琼脂糖凝胶中切下放入1.5ml的Eppendorf管中，称取重量。加入6 倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置30min。将溶胶液加入吸附柱CA2中， 室温放置2min，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。加入600μl 漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。12000rpm离心2 min，室温放置数分钟彻底晾干。将吸附柱CA2放到一个干净离心管中， 加入40μl洗脱缓冲液EB，12000rpm离心2min收集DNA溶液。

将回收的miR166m前体基因DNA与pMD19-T载体(TakaRa)进行 连接反应，连接体系10μl，分别加入0.5μl pMD19-T载体、4.5μl纯化的 miR166m前体的DNA、5μl Solution I。16℃下连接3h后将连接产物转化 到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。通过Amp筛选，挑取阳性克隆，经PCR 反应验证及测序鉴定正确后，选取正确的菌液提取质粒pMD19- miR166m。利用天根公司生产的普通质粒小提试剂盒提取质粒操作如下：

取3ml菌液加入离心管中，12000rpm离心1min，尽量吸出上清液。 向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl的溶液P1(含RNaseA)，彻底悬 浮细菌沉淀。加入250μl溶液P2，温和的上下翻转使菌体充分裂解。加 入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转充分混匀，12000rpm离心10min。 收集上清液，转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心60s，倒掉废液。加 入600μl已加入无水乙醇的漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉废液并 漂洗两次。将吸附柱CP3放入收集管，12000rpm离心2min，置于室温彻 底晾干。加入55μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心1min， 将质粒溶液收集到离心管中。

将提取的质粒pMD19-miR166m和DNA双元质粒载体pCAMBIA1301 同时都用TakaRa公司生产的KpnI和PstI进行双酶切。酶切体系50μl， 包括5μl 10×M buffer、30μl pMD19-miR166m质粒(或pCAMBIA1301 质粒)、1μl KpnI、1μl PstI和13μl ddH₂O，37℃水浴过夜。pMD19-miR166m 质粒酶切结果如图3.b所示。将DNA双元质粒载体pCAMBIA1301和克 隆质粒pMD19-miR166m酶切后，割胶回收DNA片段。接着用T4连接酶 连接，连接体系10μl，包括1μl pCAMBIA1301载体、7.5μl miR166m DNA、 1μl 10×T4连接酶buffer和0.5μl T4连接酶，16℃连接过夜。然后将连接 产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌液PCR，并提取质粒进 行酶切鉴定，结果如图3.c和图3.d所示。将正确的植物表达载体 p1301-miR166m导入农杆菌感受态细胞EHA105，操作如下：取200μl农 杆菌感受态细胞，加入1μgp1301-miR166m质粒，混匀，冰浴5min，液 氮中速冻5min，37℃水浴5min，然后加入1ml YM培养基28℃恢复培 养4h。10000g离心30s，弃上清，吸200μl菌液涂布于含有50mg/L卡 那霉素和40μg/l利福平的YM平板，28℃培养，约48h后长出农杆菌单 菌落。摇菌，提取农杆菌质粒DNA重新转入大肠杆菌DH5α中，再提取 质粒进行酶切鉴定。

经鉴定正确的阳性质粒p1301-miR166m，通过农杆菌介导法转化到水 稻愈伤。操作如下：首先活化农杆菌，在含50mg/L卡那霉素和40mg/L 利福平的YM培养基上划线，28℃暗培养。收集农杆菌菌体，将其悬浮 于含有200μM己酰丁香酮(As)的AAM液体悬浮培养基中。调整菌体 浓度至OD600为0.8～1.0，倒入含继代培养1周的水稻愈伤组织的无菌三 角瓶，侵染10min，并不时晃动。然后将愈伤组织置于无菌的滤纸上沥干 30min后，置于铺有一层无菌滤纸的固体共培养培养基上，25℃暗培养3 天。将共培养后的愈伤组织用无菌水清洗5-6次，再用含500mg/L头孢拉 定的无菌水清洗1～2遍，置于无菌滤纸上沥干1h。将晾干的愈伤转入含 500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28 ℃，暗培养14天。然后将长有抗性愈伤的初始愈伤转到新的含500mg/L 头孢拉定和50mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养， 直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含 有潮霉素的分化培养基上，于25℃，12h光照/12h黑暗条件下培养。待 再生小苗长成约1cm高时，将其移到生根培养基上壮苗，25℃，12h光 照/12h黑暗条件下培养。最后将转基因苗挑出，加入适量蒸馏水炼苗3 天至一周左右，洗去琼脂，培养箱水培1周，移栽到温室的土钵中生长。 挑选生长正常的植株，进行潮霉素PCR筛选和GUS染色，获得阳性T0 代植株，共16个株系。收获T1代种子繁种并鉴定至T2代，获得水稻转 基因株系。

实施例3  miRNA镉耐性功能鉴定

取T2代转基因株系种子和中花11野生型的种子，1％稀HNO₃破休 眠处理16h。倒去稀HNO₃，10％NaClO(有效氯约1～1.2％)消毒20min 后用蒸馏水冲洗。将种子浸泡在水中，37℃暗处催芽约两天，再在铺有湿 润滤纸的培养皿中培养一天至露白。挑选生长一致的露白的转基因株系和 野生型的种子，同时转移入0uM、60uM CdCl₂的琼脂培养基上，置于光 照培养箱中(白天/黑夜：26℃/22℃，13h/11h)。培养7天后，观察转基 因株系与野生型幼苗在镉胁迫下的表型。如图4所示，结果发现在60uM CdCl₂处理下，miR166m过表达的转基因幼苗相比野生型幼苗，根数目、 种子根长度和冠根长度都显著增加，说明miR166m超量表达可以缓解镉 对水稻的毒害。

取T2代转基因株系种子和中花11野生型的种子，1％稀HNO₃破休 眠处理16h。倒去稀HNO₃，10％NaClO(有效氯约1～1.2％)消毒20min 后用蒸馏水冲洗。将种子浸泡在水中，37℃暗处催芽约两天，再在铺有湿 润滤纸的培养皿中培养一天至露白。挑选生长一致的露白的转基因株系和 野生型的种子播于网格上，放入盛有水稻营养液(按国际水稻所标准营养 液配方进行配制)的桶中，置于水稻培养箱中(白天/黑夜：26℃/22℃， 13h/11h；Rh 80％)培养，营养液每5天换一次。将转基因株系和野生型 水稻在正常的营养液中培养五周后，挑选生长一致的水稻植株用200uM CdCl₂处理，观察转基因株系与野生型大苗在镉胁迫下的表型。如图5所 示，结果发现在200uM CdCl₂处理14d后，miR166m过表达的转基因幼 苗相比野生型幼苗，苗更加健壮，叶片仍保持绿色，说明miR166m超量 表达株系对镉毒害具有一定的耐受作用。