外源添加物促进微生物合成子囊霉素的方法及种子液和培养基的制备

摘要

本发明公开了外源添加物促进微生物合成子囊霉素的方法及培养基制备，属于子囊霉素的生物合成技术领域。其特征在于：它利用子囊霉素生物合成过程是各种前体组装的特性，在有氧发酵之初或有氧发酵过程中(菌体生长阶段)向培养基中添加0.5-3.0g/L的莽草酸、0.5-3.0g/L的异亮氨酸、1-5g/L的大豆油，增强菌体中子囊霉素合成前体物DHCHC、丙二酸单酰、甲基丙二酸单酰的积累，促进子囊霉素合成途径代谢，从而提高子囊霉素产量。本发明操作简单，不增加额外的设备和人工，仅通过较低的附加投入，成本低廉，本发明的发酵培养吸水链霉菌子囊亚种，子囊霉素的发酵单位比对照提高了55.9-114.7％。

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及外源添加物促进微生物合成子囊霉素的方法 及培养基制备。

背景技术

子囊霉素(ascomycin，FK-520)是由吸水链霉菌子囊亚种(Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus)发酵产生的一种由二十三元环组成的大环内酯类抗生素。其化学名为17α-乙 基-1β，14α-二羟基-12β[2-(4α-羟基-3β-甲氧基-1β-1-(E)-甲基乙烯基)]-23α，25β-二甲氧基 -13α，19，21α，27β-四甲基-11，28-二氧杂-4-氮杂三环[22，3，1，O]二十八碳-18-2，3，10，16-四酮，一 水合物。相对分子质量为822.5，分子式C₄₄H₆₉NO₁₂·H₂O。易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙 酯、乙醚、苯，可溶于叔丁基甲醚，微溶于水、环己烷、正己烷，不溶于庚烷。

子囊霉素是他克莫司(tacrolimus，FK-506)的乙基类似物。子囊霉素与他克莫司药理作用 相似，也具有免疫抑制作用，主要通过与巨内酯胺基团与细胞质中特定受体亲免素巨菲蛋白 -12(macrophilin-12)相结合，结合产生的亲免素复合体与细胞质内的钙调神经磷酸酶结合， 抑制钙调磷蛋白磷酸酶的活性，从而阻止了能激活T细胞质内核因子(NF-AT)组分的脱磷 酸作用，进而阻止T细胞合成相关炎性细胞因子的合成，且其它炎性细胞因子如IL-5、IL-10 和TFY-γ等的量也都相应下降。子囊霉素可用于治疗自身免疫性疾病、皮肤疾病及预防器官 移植排斥。此外，一系列研究表明子囊霉素还具有抗疟疾、神经保护与再生、抗痉挛等活性。

近年来国内外主要选用以吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)为代表的微生物来生 产子囊霉素。1962年，日本藤泽制药公司(Fujisawa)首次从日本三宫市土壤中分离的吸 水链霉菌Streptomyces hygroscopicus No.KK317的发酵液中提取得到子囊霉素。2007年， 印度学者Parveen等申请专利WO2007/029082报道了子囊霉素的单位达到350-400mg/L，但 国内对子囊霉素的研究还处于起步阶段，发酵效价一般在150-200mg/L，与国外发酵效价相 比，有较大的差距。

子囊霉素的生物合成途径已经基本明确，起始于聚酮合成酶催化的大环内酯前体的组装， 聚酮合酶由3个多肽组成，第1个(FkbB)选择莽草酸衍生物DHCHC作为起始单位，添 加4个延伸单元；第2个(FkbC)和第3个(FkbA)分别添加2个及4个延伸单元。每 个延伸单元分别与1个特定的连接单位(丙二酰辅酶A或甲基丙二酰辅酶A)结合进行特 定的β-酮步骤，再把合成链连接到下一个延伸单元上，可与PKS复合物结合的FkbP肽链 合成酶催化中间体与六氢吡啶羧酸的氮原子缩合。与PKS复合物释放后，前体的9位碳原 子依次被FkbD和Fkb0羟基化、氧化，可以产生β-羰基酰胺作用，同时31位碳上的羟基 被FkbM甲基化。子囊霉素的结构组分在微生物中的来源已基本阐述明确：内酯环由1个乙 基丙二酰、2个丙二酰、2个甲氧基丙二酰ACP和5个甲基丙二酰延伸单元组成，环外的环 己烷来自莽草酸，哌可酸来自赖氨酸，甲氧基来自甲硫氨酸。

目前对于子囊霉素的大部分研究工作集中在子囊霉素生物合成相关的酶及基因克隆、子 囊霉素衍生物的开发、抗菌活性及临床应用等方面，而在子囊霉素发酵、提取等生产工艺方 面的研究则明显不足，国内对子囊霉素的发酵研究还处于起步阶段。在发酵过程中前体的含 量与最终目标产物的合成量有直接关系，通过在发酵开始或中间添加外源物能够促使某些前 体物质的增加，最终使目标产物产量增加。如：穆云龙等(穆云龙，余旭亚，孟庆雄.莽草 酸对子囊霉素生物合成的影响，中国抗生素杂志，2008，6(23)：3-4.)研究了添加莽草酸前体 物质对子囊霉素生物合成的影响，结果表明发酵培养24h时添加0.15％的莽草酸，至96h发 酵结束发酵效价最高可达131.7mg/L，发酵效价提高了51％，然而与高外的发酵效价相比仍 有加大差距；SangJoon Mo等(Mo SJ，Ban YH，Park JW，Yoo YJ，Yoon YJ.Enhanced FK506 production in Streptomyce clavuligerus CKD 1119by engineering the supply of methylmalonyl-CoA precursor.J Ind Microbiol Biotechnol，2009，36：1473-1482.)人向R2YE培 养基中加入油酸甲酯10mM(4.37g/L)，他克莫司(FK-506)的发酵单位提高了近2.5倍。但 是，外源添加物大豆油和异亮氨以及与莽草酸的组合使用在子囊霉素发酵培养基优化方面， 还未见有相关文献和报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种外源添加物方法以提高子囊霉素的产量，重在寻找一种或几种 最优的外源添加物在最适的发酵时间添加最适的量以提高子囊霉素前体的量，从而显著提高 子囊霉素的产量。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明的外源添加物促进微生物合成子囊霉素的方法：在吸水链霉菌的发酵培养基中接 入体积比为10％的种子液，在26℃-30℃、通气量0.6-1.0v/v/m、转速300-500rpm、pH6.5-7.5 的摇床中培养发酵144-192h；其中：在进行发酵培养前向发酵培养基中加入外源添加物；或 者，在进行发酵合成子囊霉素的过程中，在菌体生长阶段添加外源添加物；外源添加物为莽 草酸、异亮氨酸或大豆油中的一种或几种。

本发明飞吸水链霉菌是在室温下取吸水链霉菌子囊亚种(ATCC14891)成熟斜面孢子用 无菌水制成孢子悬液；0.2mL孢子悬液接种到装有40mL种子培养基的250mL的摇瓶中，26 ℃-30℃、180-220rpm摇床中培养48h。

所述的方法，其中：在进行发酵培养前向发酵培养基中加入外源添加物时，莽草酸在发 酵培养基中的初始浓度为0.5-3.0g/L，异亮氨酸在发酵培养基中的初始浓度为0.5-3.0g/L，大 豆油在发酵培养基中的初始浓度为1-5g/L；在发酵过程中(菌体的生长阶段)加入外源添加 物时，莽草酸在发酵培养基中的初始浓度为0.5-3.0g/L，异亮氨酸在发酵培养基中的初始浓度 为0.5-3.0g/L，大豆油在发酵培养基中的初始浓度为1-5g/L。

所述的种子液培养基组成及含量为：淀粉8-12g/L、葡萄糖25-35g/L、蛋白胨5-7g/L、酵 母粉5-7g/L、碳酸钙1-3g/L，初始pH7.0；发酵培养基组成及含量为：淀粉15-25g/L、糊精 35-45g/L、麸质粉2-3g/L、蛋白胨4-6g/L、酵母粉8-12g/L、玉米浆4-6g/L、冷榨豆饼粉4-6g/L、 磷酸氢二钾0.5-1.5g/L、硫酸铵0.5-1.5g/L、硫酸镁0.5-1.5g/L、碳酸钙0.5-1.5g/L，初始pH7.0。

本发明的优点在于外源添加物增强菌体中子囊霉素前体物的积累，促进子囊霉素合成途 径代谢，使更多碳流流向目标产物，提高了子囊霉素的合成量。这种方法的益处在于提高底 物转化率，显著提高子囊霉素合成量。本发明操作简单，不增加额外的设备和人工，仅通过 较低的附加投入，提高了生物利用率，本发明的发酵培养吸水链霉菌子囊亚种，子囊霉素的 发酵单位比对照提高了55.9-114.7％。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明

实施例1、3、5为在发酵培养前添加外源添加物，实施例2、4、6、7为在发酵培养过程 中(菌体生长阶段)添加外源添加物。

实施例1

在室温下取吸水链霉菌子囊亚种(ATCC14891)成熟斜面孢子用无菌水制成孢子悬液； 0.2mL孢子悬液接种到装有40mL种子培养基(组成及含量为：淀粉10g/L、葡萄糖32g/L、 蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、碳酸钙1g/L，初始pH7.0)的250mL的摇瓶中，30℃、180rpm 摇床中培养48h；以10％的接种量，加到装有发酵培养基(组成及含量为：淀粉22g/L、糊精 40g/L、麸质粉3g/L、蛋白胨4g/L、酵母粉12g/L、玉米浆4g/L、冷榨豆饼粉4g/L、磷酸氢二 钾0.5g/L、硫酸铵1g/L、硫酸镁0.5g/L、碳酸钙0.5g/L，莽草酸0.5g/L，初始pH7.0)的自 动7.5LDE发酵罐中；发酵条件：30℃，通气量控制0.6v/v/m，转速500rpm，pH7.0的条件下， 发酵192h。通过HPLC检测发酵液中的子囊霉素浓度。子囊霉素发酵单位由原来的170mg/L 提高到了265mg/L，提高了55.9％。

实施例2

在室温下取吸水链霉菌子囊亚种(ATCC14891)成熟斜面孢子用无菌水制成孢子悬液； 0.2mL孢子悬液接种到装有40mL种子培养基(组成及含量为：淀粉8g/L、葡萄糖32g/L、蛋 白胨5g/L、酵母粉7g/L、碳酸钙2g/L，初始pH7.0)的250mL的摇瓶中，30℃、180rpm摇 床中培养48h；以10％的接种量，加到装有发酵培养基(组成及含量为：淀粉18g/L、糊精 42g/L、麸质粉2g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉10g/L、玉米浆5g/L、冷榨豆饼粉4g/L、磷酸氢二 钾1.5g/L、硫酸铵0.5g/L、硫酸镁0.8g/L、碳酸钙1.2g/L，初始pH7.0)的自动7.5LDE发酵 罐中。在发酵36h后添加0.5g/L的莽草酸。发酵条件：30℃，通气量控制0.6v/v/m，转速500rpm， pH7.0的条件下，发酵180h。通过HPLC检测发酵液中的子囊霉素浓度。子囊霉素发酵单位 由原来的170mg/L提高到了290mg/L，提高了70.6％。

实施例3

在室温下取吸水链霉菌子囊亚种(ATCC14891)成熟斜面孢子用无菌水制成孢子悬液； 0.2mL孢子悬液接种到装有40mL种子培养基(组成及含量为：淀粉9g/L、葡萄糖29g/L、蛋 白胨4.5g/L、酵母粉6.5g/L、碳酸钙1.5g/L，初始pH7.0)的250mL的摇瓶中，26℃、220rpm 摇床中培养48h；以10％的接种量，加到装有发酵培养基(组成及含量为：淀粉21g/L、糊精 41g/L、麸质粉2.2g/L、蛋白胨5.5g/L、酵母粉11g/L、玉米浆5.5g/L、冷榨豆饼粉5.5g/L、 磷酸氢二钾0.8g/L、硫酸铵0.8g/L、硫酸镁0.6g/L、碳酸钙0.7g/L，异亮氨酸2g/L，初始pH7.0) 的自动7.5LDE发酵罐中。发酵条件：26℃，通气量控制1.0v/v/m，转速500rpm，pH7.0的条 件下，发酵144h。通过HPLC检测发酵液中的子囊霉素浓度。子囊霉素发酵单位由原来的 170mg/L提高到了275mg/L，提高了61.8％。

实施例4

在室温下取吸水链霉菌子囊亚种(ATCC14891)成熟斜面孢子用无菌水制成孢子悬液； 0.2mL孢子悬液接种到装有40mL种子培养基(组成及含量为：淀粉15g/L、葡萄糖35g/L、 蛋白胨6g/L、酵母粉6g/L、碳酸钙3g/L，初始pH7.0)的250mL的摇瓶中，26℃、220rpm 摇床中培养48h；以10％的接种量，加到装有发酵培养基(组成及含量为：淀粉25g/L、糊精 32g/L、麸质粉2.2g/L、蛋白胨5.5g/L、酵母粉12g/L、玉米浆6g/L、冷榨豆饼粉5g/L、磷酸 氢二钾0.6g/L、硫酸铵0.7g/L、硫酸镁1g/L、碳酸钙1g/L，初始pH7.0)的自动7.5LDE发酵 罐中。在发酵24h后添加2g/L的异亮氨酸。发酵条件：26℃，通气量控制1.0v/v/m，转速500rpm， pH7.0的条件下，发酵156h。通过HPLC检测发酵液中的子囊霉素浓度。子囊霉素发酵单位 由原来的170mg/L提高到了305mg/L，提高了79.4％。

实施例5

在室温下取吸水链霉菌子囊亚种(ATCC14891)成熟斜面孢子用无菌水制成孢子悬液； 0.2mL孢子悬液接种到装有40mL种子培养基(组成及含量为：淀粉10g/L、葡萄糖25g/L、 蛋白胨6g/L、酵母粉6g/L、碳酸钙2g/L，初始pH7.0)的250mL的摇瓶中，28℃、200rpm 摇床中培养48h；以10％的接种量，加到装有发酵培养基(组成及含量为：淀粉15g/L、糊精 40g/L、麸质粉2.5g/L、蛋白胨4g/L、酵母粉8g/L、玉米浆4g/L、冷榨豆饼粉4g/L、磷酸氢 二钾1g/L、硫酸铵1g/L、硫酸镁1g/L、碳酸钙1g/L，大豆油6g/L，初始pH7.0)的自动7.5LDE 发酵罐中。发酵条件：30℃，通气量控制0.8v/v/m，转速400rpm，pH7.0的条件下，发酵168h。 通过HPLC检测发酵液中的子囊霉素浓度。子囊霉素发酵单位由原来的170mg/L提高到了 295mg/L，提高了73.5％。

实施例6

在室温下取吸水链霉菌子囊亚种(ATCC14891)成熟斜面孢子用无菌水制成孢子悬液； 0.2mL孢子悬液接种到装有40mL种子培养基(组成及含量为：淀粉10g/L、葡萄糖30g/L、 蛋白胨6g/L、酵母粉6g/L、碳酸钙2g/L，初始pH7.0)的250mL的摇瓶中，28℃、200rpm 摇床中培养48h；以10％的接种量，加到装有发酵培养基(组成及含量为：淀粉25g/L、糊精 45g/L、麸质粉2g/L、蛋白胨4g/L、酵母粉8g/L、玉米浆4g/L、冷榨豆饼粉4g/L、磷酸氢二 钾1g/L、硫酸铵1g/L、硫酸镁1g/L、碳酸钙1g/L，初始pH7.0)的自动7.5LDE发酵罐中。 在发酵24h后添加6g/L的大豆油。发酵条件：28℃，通气量控制0.9v/v/m，转速500rpm，pH6.5 的条件下，发酵168h。通过HPLC检测发酵液中的子囊霉素浓度。子囊霉素发酵单位由原来 的170mg/L提高到了345mg/L，提高了102.9％。

实施例7

在室温下取吸水链霉菌子囊亚种(ATCC14891)成熟斜面孢子用无菌水制成孢子悬液； 0.2mL孢子悬液接种到装有40mL种子培养基(组成及含量为：淀粉10g/L、葡萄糖30g/L、 蛋白胨6g/L、酵母粉6g/L、碳酸钙2g/L，初始pH7.0)的250mL的摇瓶中，28℃、200rpm 摇床中培养48h；以10％的接种量，加到装有发酵培养基(组成及含量为：淀粉20g/L、糊精 40g/L、麸质粉2.5g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉10g/L、玉米浆5g/L、冷榨豆饼粉5g/L、磷酸氢 二钾1g/L、硫酸铵1g/L、硫酸镁1g/L、碳酸钙1g/L，初始pH7.0)的自动7.5LDE发酵罐中。 在发酵24h后添加2g/L的异亮氨酸、6g/L的大豆油，36h后添加0.5g/L的莽草酸。发酵条 件：28℃，通气量控制0.8v/v/m，转速450rpm，pH7.0的条件下，发酵168h。通过HPLC检 测发酵液中的子囊霉素浓度。子囊霉素发酵单位由原来的170mg/L提高到了365mg/L，提高 了114.7％。

本发明并不局限于实例中所描述的技术，它的描述是说明性的，并非限制性的，发明的 权限由权利要求所限定，基于本技术领域人员依据本发明所能够变化、重组等方法得到的与 本发明相关的技术，都在本发明的保护范围内。