一种肝水解肽注射液药物组合物

摘要

本发明公开一种肝水解肽注射液药物组合物，由肝水解肽溶液、维生素C、门冬氨酸钾镁注射液、聚乙二醇200制成，克服了“肝水解肽注射液”的活力刺激指数较低，治疗效果有限的缺欠。本发明还提供了该药物的制备方法，工艺简单，适用于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种治疗肝炎、肝硬化疾病的药物组合物，进一步讲是提供了一种肝水解肽注射液药物组合物，属于生化药学技术领域。

背景技术

现有的“肝水解肽注射液”为我国处方类药物，肌肉注射，用于慢性肝炎、肝硬化等疾病的辅助治疗，是由健康牛、猪的肝脏经酶水解提取制得的含有多肽类、核酸类、氨基酸类物质的无菌水溶液。肝水解肽能促进蛋白质合成，减少蛋白质分解，促进正常肝细胞的增殖和再生，对四氯化碳诱导的肝细胞损伤有较好的保护作用，降低谷丙转氨酶，促进病变组织恢复；但该药物对于肝炎、肝硬化疾病的治疗效果还是非常有限，根据国家药品标准中促肝细胞生长素活性测定法(MTT法)测定，肝水解肽注射液具有体外促进人肝细胞生长的活力，但活力刺激指数为仅为2.9左右。

发明内容

本发明公开一种肝水解肽注射液药物组合物，克服了“肝水解肽注射液”的活力刺激指数较低，治疗效果有限的缺欠。本发明还提供了该药物的制备方法，工艺简单，适用于工业化生产。

本发明提供的肝水解肽注射液组合物，其特征在于是由以下原料制成的：

浓度为9.2~12.2mg/ml的肝水解肽溶液1000ml、维生素C 2~5g、门冬氨酸钾镁注射液20~30ml、聚乙二醇200  10~20g。

所述的门冬氨酸钾镁注射液为每1ml含L-门冬氨酸85mg：钾11.4mg：4.2mg。

本发明提供肝水解肽注射液组合物的制备方法，包括如下步骤：

1、肝水解肽溶液

牛或猪的肝脏，去除结缔组织后，按0.83~0.85：1的重量份数与注射用水混合后，用高速组织捣碎机匀浆，升温至 37~40℃，用HCL调PH值为2.0~2.5，按3g/升加入胃蛋白酶，水解10~15小时，水解液用NaOH调节PH值为6.2~6.4，加1g/升硅藻土，90℃，加热30分钟，小型板框压滤机压滤，用0.45μm微孔过滤膜过滤，8000分子量超滤膜超滤得肝水解肽溶液，测定多肽含量，加注射用水调整溶液多肽浓度为9.2~12.2mg/ml；

2、在步骤1制备的肝水解肽溶液1000ml，加入2~5g 的维生素C，加入20~30ml的门冬氨酸钾镁注射液，加入10~20g 的聚乙二醇200，分装后121℃高压灭菌20分 钟，经检验合格得肝水解肽注射液组合物成品药物制剂。

以下实验表明本发明药物体外促进人肝细胞生长活力大为提高：

实验方法：促肝细胞生长素溶液国家药品标准：促肝细胞生长素活性测定法(MTT法，标准编号：WS-10001-(HD-0860)-2002)。

试验样品

1.1供试品：

原配方：肝水解肽溶液，含多肽11 mg/ml。

维生素C:用RPMI-1640培养液制成的每1ml中含维生素C 50μg的溶液。

门冬氨酸钾镁：用RPMI-1640培养液制成的每1ml中含L-门冬氨酸25.5μg、钾3.42μg、镁1.26μg的溶液。

实施例1制剂；

实施例2制剂；

实施例3制剂；

实施例4制剂；

1.2 对照品：注射用促肝细胞生长素，规格为20mg

2. 材料

2.1仪器：CO₂培养箱、水平台式离心机、酶标仪、甩板机、细胞培养瓶、细胞培养板、一次性针头滤器。             

2.2试剂:

 氯化钠、氯化钾、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、RPMI-1640　MEDIUM、碳酸氢钠、盐酸、氢氧化钠、小牛血清、胰蛋白酶、EDTA二钠、MTT、二甲基亚砜、人肝细胞株。

方法

3.1试剂的配制：

3.1.1 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.3)  取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.15g及磷酸二氢钾0.2g，加超纯水1000ml溶解后，高压灭菌。

3.1.2 RPMI-1640培养液  取碳酸氢钠2.00g及RPMI-164010.0g加超纯水约800ml溶解后，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至6.9，加超纯水稀释至1000ml，过滤除菌。

3.1.3 10％小牛血清培养液  取上述RPMI-1640培养液900ml，加已灭活的新生小牛血清100ml。0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液取0.25g胰蛋白酶及0.02g乙二胺四醋酸二钠，加0.01mol/L磷酸盐缓冲液100ml溶解后，用5.6％碳酸氢钠调节pH值至7.2，过滤除菌，－20℃保存。

3.1.4 噻唑蓝(MTT)溶液  取MTT50mg，加0.01mol/L磷酸盐缓冲液10ml溶解后，过滤除菌(保存于冷处，使用不超过二周)

3.2 测定方法：

3.2.1 供试品溶液的制备  取供试品适量，用RPMI-1640培养液制成每1ml中含多肽100μg的溶液。

3.2.2 测定法：用10％小牛血清培养液培养SMMC-7721细胞至对数增长期，用0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液消化，加10％小牛血清培养液稀释至每1ml中含(2.5×10<4>)~(5×10<4>)个细胞，将上述细胞悬液在96孔细胞培养板上铺板，每孔100μl，其中留3孔加10％小牛血清培养液100μl作为空白对照，置37℃，5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养3~4小时使其贴壁。供试品组，每孔加供试品溶液100μl，每批供试品均做3孔，细胞对照组和空白对照组每孔分别加RPMI-1640培养液100μl，置37℃，5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养48小时，结束培养前4小时取出培养板，吸去培养液，每孔加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.3)洗一次，然后再在每孔中加入上述磷酸盐缓冲液(pH7.3)100μl和MTT溶液20μl，继续培养。培养结束后，吸出培养液，每孔加入100μl二甲基亚砜，摇匀，在酶标仪上以550nm的波长处分别测定其吸收度A值。

    供试品组3孔吸收度平均值(A<[T]>－空白对照组3孔吸收度平均值(A<[O]>)

刺激指数＝ ──────────────────────────────

                 对照组3孔吸收度平均值(A<[R]>－空白对照组3孔吸收度平均值(A<[O]>)

4. 试验结果：

肝水解肽注射液活力测定

 

结论：本发明组合配方药品体外促进人肝细胞生长活力大为提高。

在本发明中，维生素C作为抗氧剂阻止了肝水解肽中活性成份在成品高温灭菌中的破坏，维生素C本身亦具有促进肝细胞的修复与再生的作用；门冬氨酸钾镁是改善肝功能的药品，可加速肝细胞三羧酸循环；聚乙二醇具有良好的生物相容性和两亲性，聚乙二醇200可使肝水解肽原料提取过程中被破坏的带有活性的疏水性基团的多肽结构得以伸展，也可以阻止肝水解肽中活性成份在成品高温灭菌中的破坏，从而发挥促肝细胞生长的功能；抗氧剂维生素C和助溶剂聚乙二醇200也使成品的色泽更好、稳定性大大提高。试验结果表明本发明组合物体外促进人肝细胞生长的活力刺激指数远远大于肝水解肽和维生素C、门冬氨酸钾镁体外单独试验促进人肝细胞生长的活力刺激指数。

本发明的积极效果在于：将肝水解肽溶液与维生素C、门冬氨酸钾镁注射液及聚乙二醇200有机的结合配伍，发挥了它们的协同作用并远远大于它们每个药物的单独作用之和，药品在体外能促进人肝细胞生长，促进人肝细胞生长的活力刺激指数显著提高，根据国家药品标准中促肝细胞生长素活性测定法(MTT法)测定，本发明组合物活力刺激指数为5.2左右，远远大于单方“肝水解肽注射液”的活力刺激指数2.9，可以成为一种新的治疗肝炎、肝硬化疾病的药物组合物，具有明显疗效作用。

具体实施方式：

为了便于理解本发明，特例举以下4个实施例，其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

实施例1

1、肝水解肽溶液

牛的肝脏，去除结缔组织后，按0.85：1的重量份数与注射用水混合后，用高速组织捣碎机匀浆，升温至 37~40℃，用HCL调PH值为2.0~2.5，按3g/升加入胃蛋白酶，水解10小时，水解液用NaOH调节PH值为6.2~6.4，加1g/升硅藻土，90℃，加热30分钟，小型板框压滤机压滤，用0.45μm微孔过滤膜过滤，8000分子量超滤膜超滤得肝水解肽溶液，测定多肽含量，加注射用水调整溶液多肽浓度为9.2~12.2mg/ml。

2、前面得到的肝水解肽溶液1000ml，加入5g 的维生素C，加入30ml的门冬氨酸钾镁注射液，加入15g 的聚乙二醇200，分装后121℃高压灭菌30分钟，经检验合格得肝水解肽注射液组合物成品药物制剂。

实施例2

1、肝水解肽溶液

牛的肝脏，去除结缔组织后，按0.85：1的重量份数与注射用水混合后，用高速组织捣碎机匀浆，升温至 37~40℃，用HCL调PH值为2.0~2.5，按3g/升加入胃蛋白酶，水解10小时，水解液用NaOH调节PH值为6.2~6.4，加1g/升硅藻土，90℃，加热30分钟，小型板框压滤机压滤，用0.45μm微孔过滤膜过滤，8000分子量超滤膜超滤得肝水解肽溶液，测定多肽含量，加注射用水调整溶液多肽浓度为9.2~12.2mg/ml。

2、前面得到的肝水解肽溶液1000ml，加入2g 的维生素C，加入20ml的门冬氨酸钾镁注射液，加入10g 的聚乙二醇200，分装后121℃高压灭菌30分钟，经检验合格得肝水解肽注射液组合物成品药物制剂。

实施例3

1、肝水解肽溶液

牛的肝脏，去除结缔组织后，按0.85：1的重量份数与注射用水混合后，用高速组织捣碎机匀浆，升温至 37~40℃，用HCL调PH值为2.0~2.5，按3g/升加入胃蛋白酶，水解10小时，水解液用NaOH调节PH值为6.2~6.4，加1g/升硅藻土，90℃，加热30分钟，小型板框压滤机压滤，用0.45μm微孔过滤膜过滤，8000分子量超滤膜超滤得肝水解肽溶液，测定多肽含量，加注射用水调整溶液多肽浓度为9.2~12.2mg/ml。

2、前面得到的肝水解肽溶液1000ml，加入5g 的维生素C，加入25ml的门冬氨酸钾镁注射液，加入20g 的聚乙二醇200，分装后121℃高压灭菌30分钟，经检验合格得肝水解肽注射液组合物成品药物制剂。

实施例4

1、肝水解肽溶液

牛的肝脏，去除结缔组织后，按0.85：1的重量份数与注射用水混合后，用高速组织捣碎机匀浆，升温至 37~40℃，用HCL调PH值为2.0~2.5，按3g/升加入胃蛋白酶，水解10小时，水解液用NaOH调节PH值为6.2~6.4，加1g/升硅藻土，90℃，加热30分钟，小型板框压滤机压滤，用0.45μm微孔过滤膜过滤，8000分子量超滤膜超滤得肝水解肽溶液，测定多肽含量，加注射用水调整溶液多肽浓度为9.2~12.2mg/ml。

2、前面得到的肝水解肽溶液1000ml，加入3g 的维生素C，加入27ml的门冬氨酸钾镁注射液，加入13g 的聚乙二醇200，分装后121℃高压灭菌30分钟，经检验合格得肝水解肽注射液组合物成品药物制剂。