一种防治菌核病的生防菌盾壳霉Cm2004菌株及其制备方法和应用

摘要

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种防治菌核病的生防菌盾壳霉Cm2004菌株，所述的盾壳霉（Coniothyriumminitans）Cm2004菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.3852。本发明还公开了所述微生物菌剂的固体发酵培养方法及其在防治油菜菌核病中的应用。本发明的微生物菌剂对菌核病具有良好的生防效果。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物农药技术领域，具体涉及一种具有菌核病生防功能的盾壳霉菌株，本发明还涉及该菌株菌剂的制备方法和应用。

背景技术

菌核病菌是一种世界性的广谱寄生性病原真菌，采用化学措施不能达到根治该病的目的。为了减少农药残留、避免病菌抗药性增强，人们更多地把希望寄托于生防剂的开发与利用方面。在对菌核病菌起生物抑制作用的多种微生物菌群中，盾壳霉菌是目前防治菌核病最有发展潜力的微生物,它能够选择性地寄生菌核病菌形成的菌核，可以有效、专一地分解土壤中病原菌的越冬菌核并抑制其萌发，并能够在土壤中存活多年，该菌具有专一性强、作用时间长、对动、植物无致病性等特点，是防治菌核病最有发展潜力的理想生物防治剂。

固体发酵与许多微生物的自然生活方式非常相似，在生产过程中低的水分含量有利于产物的获得和干燥；其次，通过固体发酵产生的孢子具有更好的质量、较抗紫外线以及抗干燥，并且在制剂成品的储存中具有很好的活力。因此，盾壳霉固体发酵方法技术的研究是盾壳霉菌规模化生产和商业化应用必不可少的环节。现有的盾壳霉固体发酵水平只停留在实验室研究水平，只为工业化生产提供间接依据，研究结果难直接应用于工业化生产。

发明内容

本发明的目的是筛选一种对菌核病具有显著生物防治效果的盾壳霉菌株，同时，本发明还提供该菌株的固体发酵培养方法，该方法操作简单，适于工业化生产；此外，本发明还提供该菌制备的微生物制剂在防治油菜菌核病中的应用。

本发明提供一种防治菌核病的生防菌盾壳霉（Coniothyrium minitans）Cm2004菌株，于2003年从德国发生菌核病的油菜地土壤中分离筛选，并于2004年引进。该菌株已于2010年5月17日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为：CGMCC N0.3852。

本发明的盾壳菌Cm2004菌株具有以下生物学特性：

1、培养学特性：菌落在PDA平板上呈放射状生长，初期气生菌丝呈白色，随后菌落表面呈绒毛状，随后边缘向外延伸的同时，从菌落中心开始逐渐由白色变为黄褐色，最后呈黑褐色。生长后期形成大量褐色液滴状分生孢子器，分生孢子器在平板中心量多密集，直径大，向外辐射状逐渐减少变小；

2、形态学特性：显微镜下菌丝呈网状，有隔膜，在菌丝近末端处形成分生孢子器；分生孢子结构简单，为卵圆形或椭圆形，单孢，褐色，较短。

本发明还提供一种由保藏编号为CGMCC N0.3852的盾壳霉（Coniothyrium minitans）Cm2004菌株制备的、对菌核病具有生防功能的微生物菌剂。

相应地，本发明还提供该盾壳霉（Coniothyrium minitans）Cm2004菌剂的制备方法，包括以下步骤：

A、菌株活化

将盾壳霉Cm2004菌株接种于pH5.5～6.5的PDA培养基平板上，18℃～23℃培养14～17天，得盾壳霉Cm2004菌株的活化分生孢子；

B、孢子悬浮液制备

用无菌水冲洗Ａ步骤得到的分生孢子，制得孢子悬浮液；

C、固体发酵培养

将谷糠培养基放入固态发酵罐中，灭菌，将B步骤制备的孢子悬浮液接种于固态发酵罐内，于18℃～23℃、基质相对湿度90～95%、pH5.5～6.5条件下通气静置培养72小时后每隔48小时搅拌2～3分钟，在黑暗条件下培养20～25天，放于阴凉处风干培养料，即得所述的盾壳霉菌剂。

本发明的制备方法使用的设备简单，用固态发酵罐即可完成盾壳霉Cm2004菌剂的制备；操作简单，只需掌握无菌操作技术就能完成发酵；且成本低廉；适于盾壳霉Cm2004的工业化生产。 

优选地，B步骤中孢子悬浮液的浓度为1×10⁶～5×10⁶个孢子／ml。

优选地，C步骤中灭菌的方法是在121℃、0.15MPa下灭菌60分钟。

优选地，C步骤中接种时孢子悬浮液与谷糠培养基的体积质量比为1:8～1:10。

优选地，C步骤中谷糠培养基各组分及组分重量百分比如下：

玉米粉7～14%、稻草20～30%、谷糠5～7%、余量为发酵营养液； 

或，麸皮7～14%、稻草20～30%、谷糠5～7%、余量为发酵营养液； 

或，玉米粉7～14%、油菜杆20～30%、谷糠5～7%、余量为发酵营养液； 

或，玉米粉7～14%、玉米芯20～30%、谷糠5～7%、余量为发酵营养液；

或，玉米粉7～14%、小麦杆20～30%、谷糠5～7%、余量为发酵营养液。

C步骤中谷糠培养基各组分及组分最优选的重量百分比：玉米粉7%、稻草30%、谷糠5%、余量为营养液。

优选地，发酵营养液各组分及组分配比如下：CaCl₂ 0.03～0.05g，MgCl₂4.0～5.0g，尿素3.0～3.5g，微量元素液8～12ml，可溶性淀粉30.0～40.0g，KH₂PO₄0.8～1.2g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至5.5～6.5；其中微量元素液组成为：ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂ O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O。

本发明方法中发酵原料采用玉米粉、稻草、谷糠等农业常见材料或农业废弃物，来源十分广泛，价格低廉，发酵完成后产孢量达到5.58×10⁹个/g，且容易收集，发酵完成后搅拌清洗培养料即能分离分生孢子，适于工业化生产。

本发明还提供盾壳霉（Coniothyrium minitans）Cm2004菌株制备的微生物制剂在防治油菜菌核病中的应用。

试验证明该菌剂对核盘菌菌丝生长抑制率为55%，可抑制45%以上的菌核形成；室内菌核寄生致腐率达97%；田间菌核寄生致腐率达92%。

附图说明

图1为本发明提供的盾壳霉对核盘菌菌丝生长抑制和菌核形成的抑制效果图。

图2为本发明提供的盾壳霉室内条件下对菌核寄生致腐试验的子囊盘形成情况效果图，图片上排为清水对照，即未经盾壳霉菌处理的菌核子囊盘形成情况，图片下排为经盾壳霉处理的菌核子囊盘形成情况。

图3为菌核在田间寄生致腐试验的清水对照中形成子囊盘的效果图。 

图4为菌核在田间寄生致腐试验中经盾壳霉处理的菌核形成的子囊盘效果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例1

1.本发明的盾壳霉Cm2004菌株的分离筛选

采集德国油菜菌核病发生地5～10cm土层的土样，室内自然风干，碾碎；在PDA平板上接种核盘菌菌丝块，20℃培养3-4天，待菌丝长满平板后，沿平板外围撒风干碾碎的土样6-8小堆，平板内圈4-6小堆，每小堆2-3mg。室温下放置1-2月后，从受侵染腐烂的菌核里分离出盾壳霉Cm2004菌株。

2. 盾壳霉Cm2004菌株的纯化

取1ml孢子稀释液（10个孢子／ml）在PDA平板上，20℃下培养10天，挑取单菌落形成的菌丝块，转移到PDA平板培养15天，获得对核盘菌具有较好抑制效果的优良菌株Cm2004。

经与核盘菌对峙培养、产孢量测定等试验筛选出优良盾壳霉菌株Cm2004。

纯化的盾壳霉Cm2004菌株于2010年5月17日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为：CGMCC N0.3852。

实施例2

盾壳霉（Coniothyrium minitans）Cm2004菌剂的制备方法如下：

A、菌株活化

将盾壳霉Cm2004菌株的菌种接种于pH5.5的PDA平板上，20℃下培养15天，得盾壳霉菌株Cm2004的活化分生孢子；

B、孢子悬浮液制备

用无菌水冲洗Ａ步骤得到的分生孢子，用血球计数板计数，制得孢子浓度为1×10⁶个孢子／ml的孢子悬浮液；

C、固体发酵培养

配制谷糠培养基：玉米粉700g、稻草3000g、谷糠500g、发酵营养液5800g，其中每升发酵营养液由以下组分组成：CaCl₂ 0.03g，MgCl₂5.0g，尿素3.0g，微量元素液（含ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O） 8ml，可溶性淀粉30.0g，KH₂PO₄1.2g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至5.5。

将谷糠培养基放入固态发酵罐中，于121℃、0.15MPa下灭菌60分钟，将B步骤制备的孢子悬浮液接种于固态发酵罐内，接种时孢子悬浮液与谷糠培养基的体积质量比（mL/g）为1:8，接种后，于20℃、基质相对湿度90%，pH5.5、通气量20NL/min条件下培养， 静置培养72小时，之后每隔48小时搅拌2分钟，在黑暗条件下培养21天，完成盾壳霉菌剂制备的发酵过程；放罐于阴凉处风干培养料，获得菌剂。

实施例3

盾壳霉（Coniothyrium minitans）Cm2004菌剂的制备方法如下：

A、菌株活化

将盾壳霉Cm2004菌株的菌种接种于pH6.0的PDA平板上，18℃下培养17天，得盾壳霉菌株Cm2004的活化分生孢子；

B、孢子悬浮液制备

用无菌水冲洗Ａ步骤得到的分生孢子，用血球计数板计数，制得孢子浓度为2×10⁶个孢子／ml的孢子悬浮液；

C、固体发酵培养

配制谷糠培养基：玉米粉1000g、稻草2500g、谷糠700g、发酵营养液5800g，其中每升发酵营养液由以下组分组成：CaCl₂ 0.04g，MgCl₂4.0g，尿素3.5g，微量元素液（含ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O） 12ml，可溶性淀粉40.0g，KH₂PO₄1.2g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至6.0。

将谷糠培养基放入固态发酵罐中，于121℃、0.15MPa下灭菌60分钟，将B步骤制备的孢子悬浮液接种于固态发酵罐内，接种时孢子悬浮液与谷糠培养基的体积质量比（mL/g）为1:9，接种后，于18℃、基质相对湿度92%，pH6.5、通气量为20NL/min条件下培养，静置培养72小时后每隔48小时搅拌3分钟，在黑暗条件下培养23天，完成盾壳霉菌剂制备的发酵过程；放罐于阴凉处风干培养料，获得菌剂。

实施例4

盾壳霉（Coniothyrium minitans）Cm2004菌剂的制备方法如下：

A、菌株活化

将盾壳霉Cm2004菌株的菌种接种于pH6.5的PDA平板上，23℃下培养14天，得盾壳霉菌株Cm2004的活化分生孢子；

B、孢子悬浮液制备

用无菌水冲洗Ａ步骤得到的分生孢子，用血球计数板计数，制得孢子浓度为5×10⁶个孢子／ml的孢子悬浮液；

C、固体发酵培养

配制谷糠培养基：玉米粉1400g、稻草2000g、谷糠600g、发酵营养液7800g，其中每升发酵营养液由以下组分组成：CaCl₂ 0.05g，MgCl₂4.5g，尿素3.3g，微量元素液（含ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O） 10ml，可溶性淀粉35.0g，KH₂PO₄1.0g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至6.5。

将谷糠培养基放入固态发酵罐中，于121℃、0.15MPa下灭菌60分钟，将B步骤制备的孢子悬浮液接种于固态发酵罐内，接种时孢子悬浮液与谷糠培养基的体积质量比（mL/g）为1:10，接种后，于23℃、基质相对湿度95%，pH6.0、通气量为20NL/min条件下培养，静置培养72小时后每隔48小时搅拌3分钟，在黑暗条件下培养25天，完成盾壳霉菌剂制备的发酵过程；放罐于阴凉处风干培养料，获得菌剂。

实施例5

本实施例与实施例2的不同之处在于：配制谷糠培养基：麸皮700g、稻草3000g、谷糠500g、发酵营养液5800g，其中每升发酵营养液由以下组分组成：CaCl₂ 0.03g，MgCl₂5.0g，尿素3.0g，微量元素液（含ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O） 8ml，可溶性淀粉30.0g，KH₂PO₄1.2g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至5.5。

其余部分均与实施例2相同。

实施例6

本实施例与实施例3的不同之处在于：配制谷糠培养基：麸皮1000g、稻草2500g、谷糠700g、发酵营养液5800g，其中每升发酵营养液由以下组分组成：CaCl₂ 0.04g，MgCl₂4.0g，尿素3.5g，微量元素液（含ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O） 12ml，可溶性淀粉40.0g，KH₂PO₄1.2g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至6.0。

其余部分均与实施例3相同。

实施例7

本实施例与实施例4的不同之处在于：配制谷糠培养基：麸皮1400g、稻草2000g、谷糠600g、发酵营养液7800g，其中每升发酵营养液由以下组分组成：CaCl₂ 0.05g，MgCl₂4.5g，尿素3.3g，微量元素液（含ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O） 10ml，可溶性淀粉35.0g，KH₂PO₄1.0g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至6.5。

其余部分均与实施例4相同。

实施例8

本实施例与实施例2的不同之处在于：配制谷糠培养基：玉米粉700g、油菜杆3000g、谷糠500g、发酵营养液5800g，其中每升发酵营养液由以下组分组成：CaCl₂ 0.03g，MgCl₂5.0g，尿素3.0g，微量元素液（含ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O） 8ml，可溶性淀粉30.0g，KH₂PO₄1.2g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至5.5。

其余部分均与实施例2相同。

实施例9

本实施例与实施例3的不同之处在于：配制谷糠培养基：玉米粉1000g、油菜杆2500g、谷糠700g、发酵营养液5800g，其中每升发酵营养液由以下组分组成：CaCl₂ 0.04g，MgCl₂4.0g，尿素3.5g，微量元素液（含ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O） 12ml，可溶性淀粉40.0g，KH₂PO₄1.2g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至6.0。

其余部分均与实施例3相同。

实施例10

本实施例与实施例4的不同之处在于：配制谷糠培养基：玉米粉1400g、油菜杆2000g、谷糠600g、发酵营养液7800g，其中每升发酵营养液由以下组分组成：CaCl₂ 0.05g，MgCl₂4.5g，尿素3.3g，微量元素液（含ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O） 10ml，可溶性淀粉35.0g，KH₂PO₄1.0g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至6.5。

其余部分均与实施例4相同。

实施例11

本实施例与实施例2的不同之处在于：配制谷糠培养基：玉米粉700g、玉米芯3000g、谷糠500g、发酵营养液5800g，其中每升发酵营养液由以下组分组成：CaCl₂ 0.03g，MgCl₂5.0g，尿素3.0g，微量元素液（含ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O） 8ml，可溶性淀粉30.0g，KH₂PO₄1.2g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至5.5。

其余部分均与实施例2相同。

实施例12

本实施例与实施例3的不同之处在于：配制谷糠培养基：玉米粉1000g、玉米芯2500g、谷糠700g、发酵营养液5800g，其中每升发酵营养液由以下组分组成：CaCl₂ 0.04g，MgCl₂4.0g，尿素3.5g，微量元素液（含ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O） 12ml，可溶性淀粉40.0g，KH₂PO₄1.2g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至6.0。

其余部分均与实施例3相同。

实施例13

本实施例与实施例4的不同之处在于：配制谷糠培养基：玉米粉1400g、玉米芯2000g、谷糠600g、发酵营养液7800g，其中每升发酵营养液由以下组分组成：CaCl₂ 0.05g，MgCl₂4.5g，尿素3.3g，微量元素液（含ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O） 10ml，可溶性淀粉35.0g，KH₂PO₄1.0g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至6.5。

其余部分均与实施例4相同。

实施例14

本实施例与实施例2的不同之处在于：配制谷糠培养基：玉米粉700g、小麦杆3000g、谷糠500g、发酵营养液5800g，其中每升发酵营养液由以下组分组成：CaCl₂ 0.03g，MgCl₂5.0g，尿素3.0g，微量元素液（含ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O） 8ml，可溶性淀粉30.0g，KH₂PO₄1.2g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至5.5。

其余部分均与实施例2相同。

实施例15

本实施例与实施例3的不同之处在于：配制谷糠培养基：玉米粉1000g、小麦杆2500g、谷糠700g、发酵营养液5800g，其中每升发酵营养液由以下组分组成：CaCl₂ 0.04g，MgCl₂4.0g，尿素3.5g，微量元素液（含ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O） 12ml，可溶性淀粉40.0g，KH₂PO₄1.2g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至6.0。

其余部分均与实施例3相同。

实施例16

本实施例与实施例4的不同之处在于：配制谷糠培养基：玉米粉1400g、小麦杆2000g、谷糠600g、发酵营养液7800g，其中每升发酵营养液由以下组分组成：CaCl₂ 0.05g，MgCl₂4.5g，尿素3.3g，微量元素液（含ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·4H₂O、NaMo₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·6H₂O） 10ml，可溶性淀粉35.0g，KH₂PO₄1.0g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至6.5。

其余部分均与实施例4相同。

实施例17

盾壳霉对核盘菌菌丝生长抑制和菌核形成的抑制效果：

A、取PDA平板上培养3天，直径为6mm大小的核盘菌菌丝块放置在直径90mm的PDA平板上，在相距菌丝块30mm处取盾壳霉孢子悬浮液划线培养（对照用清水代替孢子悬浮液），分别培养3、6、9天后在体视显微镜下观察记录核盘菌菌丝生长、菌核形成数量和被寄生的情况，如图1所示。

盾壳霉对菌核寄生致腐效果：

A、在20℃室内，用直径15cm的盆钵盛500g无菌土，放入100粒菌核（a），分别采用土壤浇灌和喷雾法将10ml孢子悬浮液（10⁶个孢子/ml）施于土壤表面（对照用清水处理），并用100ml无菌水进行浇灌，30天后查看土壤中菌核腐烂情况，记录土壤中能找到的菌核数（b）；之后分出一半菌核分离培养，记录可萌发形成菌丝的菌核数（c）；一半留于土中，观察子囊盘形成情况，记录能够形成子囊盘的菌核数（d），按下面公式计算得到菌核腐烂率为97%。

菌核腐烂率=(a-b-c-d)/a×100%。

B、在油菜地，将100粒菌核（A）放入1平方米范围内，采用土壤喷雾法将100ml孢子悬浮液（10⁶个孢子/ml）施于土壤表面（对照用清水处理），50天后查看土壤中菌核腐烂情况，记录土壤中能找到的菌核数（B）；之后取出一半菌核分离培养，记录可萌发形成菌丝的菌核数（C），一半留于土中，观察子囊盘形成情况，记录形成子囊盘的菌核数（D），按下面公式计算得到菌核腐烂率为92%。

菌核腐烂率=(A-B-C-D)/A×100%。

按上述实验方法多次重复试验证明该菌对核盘菌菌丝生长抑制率为55.2%，菌核形成数量减少一半以上，室内菌核寄生致腐率达97%；田间菌核寄生致腐率达92%。每个菌核至少可萌发形成1-2个子囊盘，多则形成10个子囊盘，清水对照中的子囊盘数量为46.3个/平方米，田间经土壤喷雾法处理后的子囊盘为12.3个/平方米，子囊盘形成数量减少了73.4%。

   以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。