一种增强透皮给药组合物及其应用

摘要

本发明提供一种增强透皮给药组合物的应用以及一种增强药物透皮给药的方法，还提供了一种三磷酸腺苷的应用，另外还提供了一种含有透皮给药组合物的药物。本发明通过提高透皮增强肽介导的透皮药物输运过程中的ATP供应量，对透皮增强肽介导的透皮药物输运能力有显著的促进效果。

说明书

技术领域

本发明属于药物输运领域，具体地说，是关于一种增强透皮给药组合物及其应用。

背景技术

药物输运是临床治疗的技术基础，药物输运的效率将直接影响临床各类疾病治疗的效果。目前药物输运的常规途径主要包括以静脉注射给药和口服给药为代表的全身性给药方式以及以皮下、皮内以及肌肉注射等为代表的局部给药方式。但这些传统的给药方式会给患者带来注射性皮炎、胃肠道等系统性毒性、大剂量长期全身给药所致不良反应等诸多方面的不便。经皮给药的出现及时有效地为各类药物制剂提供了更为安全可靠的运输途径。经皮给药是药物一种通过皮肤吸收的给药方法，指药物应用于皮肤上后，穿过角质层，通过皮肤扩散，在局部或全身(由毛细血管吸收进入体循环达到有效血药浓度)起到治疗疾病的作用。与传统的口服或注射给药相比，经皮给药具有多重优点，如避免药物在胃肠道的降解及吸收问题、减少用药的个体差异、通过持续透皮作用维持恒定有效的药物作用浓度、避免峰谷现象、降低毒副反应等，同时经皮给药还具有通过减少给药次数使大多数病人易于接受，患者可以自主用药，也可以随时撤销用药；适合于有恶心、呕吐症状以及老人、小孩等类别病人；可以局部给药，特别适合于皮肤性疾病等诸多优点。

已尝试的克服皮肤屏障进而促进透皮给药效率的方法多种多样，但归纳起来主要有物理协助和化学渗透促进剂这两大类。

物理协助是其中一大类辅助药物透皮的手段，其常规技术主要包括离子电渗促透(中国专利公开号CN1171278)、超声波促透(中国专利公开号中国专利公开号CN101460214)、微针促透(中国专利公开号CN101862503A)、激光促透(中国专利公开号CN1119518)等，已证明对多种药物有效，且适用于蛋白质药物。但这些方法需要特别的仪器，成本高，剂型灵活性差，不同程度上有疼痛不适感，不适合家庭的普遍使用等。

目前国内外已报道的化学渗透促进剂是另一大类辅助药物透皮的手段，主要包括表面活性剂类(中国专利公开号CN1293033)、亚砜类(中国专利公开号CN101744851A、中国专利公开号CN101073579)、吡咯烷酮类(中国专利公开号CN1528462)、氮酮与其类似物(中国专利公开号CN101176790)、挥发油(中国专利公开号CN101224227)、氨基酸及其衍生物(中国专利公开号CN101041692、中国专利公开号CN1615775)、磷脂和油酸(中国专利公开号CN1600297)、醇醚类与多元醇类(中国专利公开号CN101940790A、中国专利公开号CN1161651)、萜类(中国专利公开号CN1615775)、胺类酰胺类(中国专利公开号CN1872341)等。大部分化学渗透促进剂可能通过改变皮肤角质层类脂排列，影响皮肤角质层水合作用，提高皮肤表面角蛋白中含氮物质与水的结合能力，溶解皮脂腺管内皮脂，以及膨胀和软化角质层使汗腺、毛囊开口变大等机理，帮助药物通过皮肤屏障而促进药物的吸收。

化学渗透促进剂对许多小分子药物显示有一定透皮增强效果，有些在临床上已得到使用。然而，它们有两大不足：易造成皮肤过敏以及不能有效促进大分子如蛋白质类药物透皮。由此可见，欲使蛋白质药物经皮给药成为可能，发展出能克服上述限制的新型透皮增强剂是关键。

相比于静脉注射给药与口服给药的高效率，透皮给药优点良多，但是效率较低始终是这项新型给药方式的瓶颈。

中国科学技术大学纳米生物学实验室利用分子生物学体内噬菌体展示技术成功获得了一个由11个氨基酸组成的能高效帮助蛋白质类药物透皮的短肽TD-1(Application No.60/740,613、Application No.60/717,497、中国专利公开号CN1879888)。该专利公开了TD-1能够帮助胰岛素(Insulin)透过大鼠腹部皮肤进入血液循环，可以使达到治疗水平的胰岛素透过糖尿病大鼠皮肤并产生良好的降糖效果，并能帮助人生长激素(human growthhormone)透皮。这些工作在2006年4月期的《自然---生物技术》杂志上发表，得到了国际同行的瞩目。能高效帮助蛋白质类药物透皮显然成为透皮“肽伴侣”TD-1的优势，如何能够提高TD-1携带蛋白质药物透皮效率也随之成为了一个重要且具有包括临床治疗价值在内的重要的研究课题。

ATP(adenosine-triphosphate)中文名称为腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷(腺苷三磷酸)，是生命活动能量的直接来源，简称为ATP，其结构简式是：A-P～P～P，其相邻的两个磷酸基之间的化学键非常活跃，水解时可释放约30.54kJ/mol的能量，因此称为高能磷酸键，用“～”表示。在细胞的生命活动中，ATP远离A的一个高能磷酸键容易断裂，释放出一个磷酸和能量后成为二磷酸腺苷(ADP)。将ATP催化水解为ADP和磷酸根离子，是一个释放能量的反应，催化这一过程的酶是一种无机磷酸酶，称为ATP酶。细胞膜上的ATP酶由钠离子和钾离子激活，大体分为3类：①线粒体内膜质子转移ATP酶，②钠，钾-ATP酶【(Na⁺，K⁺)-ATPase】，③肌浆网系Ca²⁺-ATP酶。钠，钾-ATP酶由α、β两亚基组成。α亚基为分子量约120KD的跨膜蛋白，具有Na、K结合位点；β亚基为小亚基，是分子量约50KD的糖蛋白，ATP酶特异性抑制剂为乌本苷。

ATP与TD-1介导的蛋白质药物透皮效率的关系未见报道，本发明第一次将ATP与TD-1介导的蛋白质药物透皮能力联系在一起，并通过指出ATPase及其β亚基(βsubunit)在ATP促进的TD-1介导的蛋白质药物透皮过程中的作用，进一步找到增进TD-1介导的蛋白质药物透皮效率的方法。

发明内容

本发明的目的在于，提供两种透皮给药组合物、两种透皮给药组合物的应用、一种增强药物透皮给药的方法，还提供了一种三磷酸腺苷(ATP)的应用，另外还提供了两种含有透皮给药组合物的药物，以克服现有技术缺点和不足。本发明提供的药物组合分为两大类，均涉及三磷酸腺苷(ATP)促进的、TD-1介导的药物蛋白透过皮肤屏障发挥药效。其中一类为TD-1与药物蛋白混合给药，即TD-1与药物蛋白以混合物形式发挥作用；另一类为TD-1与药物蛋白经过分子生物学方法实现融合表达，即TD-1与药物蛋白以融合蛋白的形式发挥药效。此二类药物组合形式显示了TD-1在促进药物蛋白穿透药物屏障发挥药效过程中的仅有的两种可能的组合方式，即混合给药方式和TD-1与效应蛋白组合为融合蛋白的给药方式。这些药物或效应蛋白不仅限于化学合成类多肽，也包括各种蛋白表达系统(原核、真核、哺乳动物、昆虫等表达系统)表达出的基因工程等技术指导下的重组蛋白，以及一些特殊来源的蛋白质类药物，即任何本领域的技术人员所熟知的这些多肽或蛋白质的生产技术，包括但不限于通过重组技术等标准的分子生物学技术来表达多肽和蛋白质、从自然原料中分离多肽或蛋白质、或者化学合成这些多肽和蛋白质等，都包括在本发明的保护范围之内。

本发明的第一个方面，一种增强透皮给药的组合物，其特征在于，包括至少一种透皮给药增强剂，以及三磷酸腺苷(ATP)。

其中，所述透皮给药增强剂为透皮增强肽。优选的，所述透皮增强肽为TD-1。本发明所指的透皮药物包括但不限于广义上的“药物”---用于化妆品及护肤品中的各种蛋白类生长因子等。优选的透皮给药药物为广义上的“药物”---即人表皮生长因子(EGF)和人α干扰素(IFN-α-2b)。

本发明的第二个方面，一种增强药物透皮给药的方法，其特征在于，在透皮增强肽介导的透皮药物输运过程中，将一种治疗某疾病的有效剂量的药物活性制剂或药物与透皮给药增强剂联合，外加三磷酸腺苷(ATP)。

本发明的第三个方面，一种三磷酸腺苷的应用，其特征在于，用于提高透皮增强肽介导的透皮给药运输途径的输运效率和水平。

其中，所述透皮增强肽为TD-1。

在透皮增强肽介导的透皮药物输运过程中，将一种治疗某疾病的有效剂量的药物活性制剂或药物与透皮给药增强剂联合，外加三磷酸腺苷(ATP)，此处的三磷酸腺苷(ATP)指的是提供能量的活性成分，包括但不限于常规来源得到的化学合成所得的三磷酸腺苷(ATP)以及各种水解后发挥生理效用的成分依然为三磷酸腺苷(ATP)的三磷酸腺苷(ATP)衍生物等。相比未添加外加三磷酸腺苷(ATP)的给药，所述药物活性制剂或药物通过动物或人的皮肤或者身体表面的给药得到增强或促进。

本发明的第四个方面，提供了一种三磷酸腺苷(ATP)的应用，用于提高透皮增强肽介导的透皮给药运输途径的输运效率和水平。

其中，所述透皮增强肽为TD-1。

本发明的第五个方面，一种含有透皮给药组合物的药物，包括至少一种治疗某疾病的有效剂量的药物活性制剂或药物，其特征在于，还包括至少一种透皮给药增强剂，以及三磷酸腺苷(ATP)。

该药物，包括至少两种治疗某疾病的有效剂量的药物活性制剂或药物，至少一种透皮给药增强剂，以及三磷酸腺苷(ATP)，并提供了治疗某疾病的有效剂量的药物活性制剂或药物、透皮给药增强剂，以及三磷酸腺苷(ATP)的优选给药比例。

优选的，所述透皮给药增强剂为透皮增强肽。所述透皮给药增强剂为TD-1。优选的透皮给药药物为广义上的“药物”---即人表皮生长因子(EGF)和人α干扰素(IFN-α-2b)。

本发明的第六个方面，提供了一种三磷酸腺苷(ATP)的应用所涉及的机理，即阐释了Na⁺，K⁺-ATPase的β亚基(βsubunit-ATP1B1)在三磷酸腺苷(ATP)促进透皮增强剂介导的蛋白质药物透皮过程中发挥的作用。

优选的，所述透皮给药增强剂为TD-1。优选的透皮给药药物为广义上的“药物”---即人表皮生长因子(EGF)和人α干扰素(IFN-α-2b)。

本发明的第七个方面，提供了一种三磷酸腺苷(ATP)作为生物体能量供应物的独特生物学作用，即提高透皮增强肽介导的透皮给药运输途径的输运效率和水平。此种作用并非其余能量形式(如ADP、AMP、ATP-γ-S、GTP、AMP-PNP等)所能发挥之作用。

优选的，所述透皮给药增强剂为TD-1。优选的透皮给药药物为广义上的“药物”---即人表皮生长因子(EGF)和人α干扰素(IFN-α-2b)。

本发明的有益效果：

相比于静脉注射给药与口服给药的高效率，透皮给药优点良多，但是效率较低始终是透皮给药方式的瓶颈。本发明利用ATP这一生物体直接能量供应物，可以安全而无毒副作用地提高蛋白质类药物的透皮运输效率，为诸多蛋白质药物的临床应用提供了良好的前景。

本发明通过提高透皮增强肽介导的透皮药物输运过程中的ATP供应量，对透皮增强肽介导的透皮药物输运能力有显著的促进效果。通过与本发明的透皮给药增强剂和三磷酸腺苷(ATP)的联合用药，一个很大范围内的药物透皮给药都可以得到增强和/或变得更便利。下面例举了一些实施例。本发明提供了属于能够通过透皮给药方式达到治疗作用的药物，它们能与本发明的物体直接能量供应物ATP及透皮给药增强剂联合给药。

附图说明

图1、透皮槽结构示意图。

图2、三磷酸腺苷(ATP)在不同时间点对TD-1-EGF融合蛋白在大鼠腹部皮肤组织中透皮效率的影响。

图3、三磷酸腺苷(ATP)对TD-1介导IFN-α-2b蛋白在大鼠腹部皮肤组织中透皮效率的影响。

图4、不同剂量的三磷酸腺苷(ATP)对TD-1-EGF融合蛋白在大鼠腹部皮肤组织中透皮效率的影响。

图5、不同剂量的三磷酸腺苷(ATP)对TD-1介导IFN-α-2b蛋白在大鼠腹部皮肤组织中透皮效率的影响。

图6、三磷酸腺苷(ATP)对TD-1-EGF融合蛋白在成人腋窝皮肤组织中透皮效率的影响。

图7、三磷酸腺苷(ATP)对TD-1介导IFN-α-2b蛋白在成人腋窝皮肤组织中透皮效率的影响。

图8、乌本苷(Ouabain)对TD-1-EGF融合蛋白在大鼠腹部皮肤组织中透皮效率的影响。

图9、乌本苷(Ouabain)对TD-1介导的IFN-α-2b蛋白在大鼠腹部皮肤组织中透皮效率的影响。

图10、原核表达Na⁺，K⁺ATPase βsubunit(ATP1B1)对TD-1-EGF融合蛋白以及TD-1介导的IFN-α-2b蛋白在大鼠腹部皮肤组织中透皮效率的影响。

图11、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)在不同时间点对TD-1-EGF融合蛋白在大鼠腹部皮肤组织中透皮效率的影响。

图12、三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸腺苷水解类似物(ATP-γ-S)、一磷酸腺苷-亚氨二磷酸盐(AMP-PNP)对TD-1介导的IFN-α-2b蛋白在大鼠腹部皮肤组织中透皮效率的影响。

附图标记：

上槽100、下槽200、皮肤组织300、收集液400。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。

实施例1 TD-1-EGF和TD-1-EGF+ATP透皮药物的比较

TD-1为ACSSSPSKHCG的短肽；EGF为表皮生长因子(本申请中ATP帮助TD-1介导融合透皮蛋白质药物透皮以人表皮生长因子TD-1-huEGF为例，后文中huEGF用EGF表示)。

TD-1-EGF来源于中国科学技术大学纳米生物学实验室自行构建重组质粒，并使用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化目的蛋白。简述如下：通过使用pFN18A halotag 7 Flexi vector(Promega公司)，构建重组质粒，再转化入KRX competent cells(Promega公司)，葡萄糖、鼠李糖(Promega公司)在25℃，220rpm诱导表达目的蛋白，20h后收集菌体，破碎后，使用Halo-Tag纯化系统(Promega公司)纯化出目的蛋白。之后Western-blotting检定TD1-EGF的表达、Western-blotting鉴定融合蛋白是否激活细胞ERK信号通路、MTT法检测TD1-EGF是否促进Balb/c-3T3细胞增殖以及TD1-EGF对Balb/c-3T3细胞迁移的影响验证原核表达出的目的蛋白是否具有生物学活性。再通过融合蛋白在大鼠体内(in vivo)、体外(in vitro)透皮实验、融合蛋白在实验小型猪(in vivo)体内透皮实验以及健康成人皮肤组织体外(in vitro)透皮实验等实验证实表达出的目的蛋白具有透皮功能。(注：TD-1-EGF的构建、表达、生物学活性以及透皮活性鉴定见申请人的另一项专利申请《一种促进蛋白质类药物表皮生长因子透皮给药的方法》，申请号：201110157776.0。)

三磷酸腺苷(ATP)购自加拿大Bio Basic Inc.公司(货号AB0020)。

TD-1-EGF为已被证明的可透皮的融合蛋白质类药物，本实施例在TD-1介导的透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF透皮给药过程中同时应用生物直接能量供应物质三磷酸腺苷(ATP)，以研究ATP对于透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF的透皮效率的影响。

取完整无破损SD大鼠(SPF级，购于安徽医科大学实验动物中心，后述实验用SD大鼠均为此来源)腹部皮肤组织，去毛后置于生理盐水(0.9％Nacl水溶液)中待用。

配制透皮药物：将纯度达到95％以上的融合蛋白TD-1-EGF(储液浓度1mg/mL)，用吉尔森移液枪(Gilson，France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg)，用生理盐水稀释到500μL，即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml，如图1所示，置于透皮槽上槽100作为TD-1-EGF组透皮药物。另将纯度达到95％以上的融合蛋白TD-1-EGF按100μg/ml的浓度，用生理盐水稀释到500μl，再向其中加入20mM的ATP，待ATP充分溶解后，置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1-EGF+ATP组透皮药物。

透皮给药：将透皮槽下槽200内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子，透皮上槽与下槽之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300，上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1-EGF与TD-1-EGF+ATP。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中，恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm，分别在启动透皮扩散仪的5min、4h和16h从透皮槽下槽200开口处取200μl收集液400，并在5min、4h取样后分别从透皮槽下槽开口处加入200μl生理盐水维持下槽中收集液总体积不变。

检测：将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品，使用人表皮细胞生长因子ELISA试剂盒(武汉博士德公司，商品编号：EK0325)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的huEGF含量，绘制EGF含量标准曲线，由试剂盒自身配备的EGF标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后，各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF的浓度，进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。

数据分析：student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。

结果显示，对比使用相同EGF量的融合蛋白TD-1-EGF和TD-1-EGF+ATP作为透皮药物的两组，发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中，TD-1-EGF+ATP透皮组明显具有更加良好的透皮效果，TD-1-EGF+ATP组透皮药物比TD-1-EGF组透皮药物的透皮量显著增加。透皮量由TD-1-EGF组中的170.3181±45.50218pg上升到TD-1-EGF+ATP组的479.38772±90.75827pg(4小时透皮取样时间点)；由398.62239±38.35124pg上升到1337.25643±241.43141pg(16小时透皮取样时间点)。在TD-1-EGF融合蛋白透皮过程中加入20mM ATP与TD-1-EGF融合蛋白透皮对照组比较具有显著性，如图2所示。

实施例2 TD-1+IFN-α-2b和TD-1+ATP+IFN-α-2b透皮药物的比较

TD-1为ACSSSPSKHCG的短肽；IFN-α-2b为人α干扰素-2b亚型(本申请中ATP帮助TD-1以混合给药方式帮助蛋白质药物透皮以人α干扰素-2b亚型为例，后文中hu-IFN-α-2b用IFN表示)。

TD-1来源于上海吉尔生化有限公司(GLS)，IFN来源于安徽省安科生物工程科技股份有限公司(Anke-Bio)，三磷酸腺苷(ATP)购自加拿大BioBasic Inc.公司(货号AB0020)。

IFN为已被证明的抗病毒、蛋白质类药物，本实施例在TD-1介导的透蛋白质药物IFN透皮给药过程中，同时应用生物直接能量供应物质三磷酸腺苷(ATP)，以研究ATP对于蛋白质药物IFN在TD-1介导下的透皮效率的影响。

取完整无破损SD大鼠(SPF级，购于安徽医科大学实验动物中心，后述实验用SD大鼠均为此来源)腹部皮肤组织，去毛后置于生理盐水(0.9％Nacl水溶液)中待用。

配制透皮药物：将纯度达到95％以上的IFN(储液浓度1mg/mL)，用吉尔森移液枪(Gilson，France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg)，用生理盐水稀释到500μL，再向其中加入TD-1多肽10μg，即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml，如图1所示，置于透皮槽上槽100作为TD-1+IFN组透皮药物。另将纯度达到95％以上的IFN按100μg/ml的浓度，用生理盐水稀释到500μl，再向其中加入TD-1多肽10μg和20mM的ATP，待ATP充分溶解后，置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1+IFN+ATP组透皮药物。

透皮给药：将透皮槽下槽200内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子，透皮上槽100与下槽200之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300，上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1+IFN与TD-1+IFN+ATP。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中，恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm，在启动透皮扩散仪的16h从透皮槽下槽200开口处取200μl收集液400。

检测：将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品，使用人-α干扰素含量ELISA检测试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的IFN含量，绘制IFN含量标准曲线，由试剂盒自身配备的IFN标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后，各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的IFN的浓度，进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。

数据分析：student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。

结果显示，对比使用相同IFN、TD-1量的TD-1+IFN和TD-1+IFN+ATP作为透皮药物的两组，发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中，TD-1+IFN+ATP透皮组明显具有更加良好的透皮效果，TD-1+IFN+ATP组透皮药物比TD-1+IFN组透皮药物的透皮量显著增加。透皮量由TD-1+IFN组中的857.893±198.78945pg上升到TD-1+IFN+ATP组的1987.983±221.43256pg(16小时透皮取样时间点)。在TD-1+IFN蛋白透皮过程中加入20mMATP与TD-1+IFN融合蛋白透皮对照组比较具有显著性，如图3所示。

实施例3  TD-1-EGF的透皮效率与ATP剂量的关系

在TD-1介导的透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF透皮给药过程中同时应用不同剂量(0mM-20mM)的生物直接能量供应物质三磷酸腺苷---ATP，以检测透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF的透皮效率与ATP剂量的关系。

取完整SD大鼠腹部皮肤组织，去毛后置于生理盐水(0.9％Nacl水溶液)中待用。

配制透皮药物，方法如下：将纯度达到95％以上的融合蛋白TD-1-EGF(储液浓度1mg/mL)，用吉尔森移液枪(Gilson，France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg)，用生理盐水稀释到500μL，即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml，置于透皮槽上槽作为TD-1-EGF组透皮药物。另将纯度达到95％以上的融合蛋白TD-1-EGF按上述同样的方法稀释到给药浓度为100μg/ml，再向其中分别加入5mM、10mM、20mM和30mM的ATP，待ATP充分溶解后，置于Franz透皮槽上槽作为TD-1-EGF+ATP组透皮药物。

透皮给药：将透皮槽下槽内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子，透皮上槽100与下槽200之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300，上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1-EGF与TD-1-EGF+ATP。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中，恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm，在启动透皮扩散仪的4h从透皮槽下槽开口处取200μl收集液400。

检测：将4h时从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品，使用人表皮细胞生长因子ELISA试剂盒(武汉博士德公司，商品编号：EK0325)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的huEGF含量，绘制EGF含量标准曲线，由试剂盒自身配备的EGF标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后，各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF的浓度，进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。

数据分析：student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。

结果显示，对比使用不同剂量的ATP与融合蛋白TD-1-EGF作为透皮药物的两组，发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中，TD-1-EGF的透皮量与ATP的量呈正相关，EGF透皮绝对量由0mM ATP时的93.07573±32.33889pg，上升到5mM ATP时的150.45118±81.30506pg，上升到10mM ATP时的306.69786±50.76858pg，20mM ATP时的450.77399±69.43009pg，30mMATP时的662.6217±72.94506pg。在TD-1-EGF融合蛋白透皮过程中加入不同剂量的ATP与TD-1-EGF融合蛋白透皮对照组(不加入ATP透皮组)比较具有不同置信区间的显著性，如图4所示。

实施例4  TD-1介导IFN的透皮效率与ATP剂量的关系

在TD-1介导的蛋白质药物IFN透皮给药过程中同时应用不同剂量(0mM-20mM)的生物直接能量供应物质三磷酸腺苷---ATP，以检测TD-1介导的蛋白质药物IFN的透皮效率与ATP剂量的关系。

取完整无破损SD大鼠(SPF级，购于安徽医科大学实验动物中心，后述实验用SD大鼠均为此来源)腹部皮肤组织，去毛后置于生理盐水(0.9％Nacl水溶液)中待用。

配制透皮药物：将纯度达到95％以上的IFN(储液浓度1mg/mL)，用吉尔森移液枪(Gilson，France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg)，用生理盐水稀释到500μL，再向其中加入TD-1多肽10μg，即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml，如图1所示，置于透皮槽上槽100作为TD-1+IFN组透皮药物。另将纯度达到95％以上的IFN按100μg/ml的浓度，用生理盐水稀释到500μl，再向其中加入TD-1多肽10μg和2mM、5mM、10mM和20mM的ATP，待ATP充分溶解后，置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1+IFN+ATP组透皮药物。

透皮给药：将透皮槽下槽200内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子，透皮上槽与下槽之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300，上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1+IFN与TD-1+IFN+ATP。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中，恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm，在启动透皮扩散仪的16h从透皮槽下槽200开口处取200μl收集液400。

检测：将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品，使用人-α干扰素含量ELISA检测试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的IFN含量，绘制IFN含量标准曲线，由试剂盒自身配备的IFN标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后，各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF的浓度，进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。

数据分析：student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。

结果显示，对比使用相同IFN、TD-1量的TD-1+IFN和TD-1+IFN+ATP作为透皮药物的两组，发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中，TD-1+IFN+ATP透皮组明显具有更加良好的透皮效果，透皮绝对量由2mMATP时的837.321±138.3355pg上升到5mMATP时的1287.983±201.2656pg，10mM ATP时的1887.983401.265pg上升到450.77399±69.43009pg，20mMATP时的2098.983±311.256pg。在TD-1介导的IFN透皮过程中加入不同剂量的ATP与TD-1单独介导IFN透皮对照组(不加入ATP透皮组)比较具有不同置信区间的显著性，如图5所示。

实施例5  融合蛋白透过人类皮肤组织过程中TD-1-EGF和TD-1-EGF+ATP的比较

在TD-1介导的透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF穿透人类皮肤组织给药过程中同时应用生物直接能量供应物质三磷酸腺苷(ATP)，以提高透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF的透皮效率。

健康的成年男性3人，取外科手术后腋窝皮肤组织置于生理盐水(0.9％Nacl水溶液)中待用。

配制透皮药物：将纯度达到95％以上的融合蛋白TD-1-EGF(储液浓度1mg/mL)，用吉尔森移液枪(Gilson，France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg)，用生理盐水稀释到500μL，即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml，置于透皮槽上槽作为TD-1-EGF组透皮药物。另将纯度达到95％以上的融合蛋白TD-1-EGF按上述同样方法稀释到给药浓度为100μg/ml，再向其中加入20mM的ATP，待ATP充分溶解后，置于Franz透皮槽上槽作为TD-1-EGF+ATP组透皮药物。

透皮给药：将透皮槽下槽内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子，透皮上槽100与下槽200之间蒙上之前准备好的完好无损的健康成年男性皮肤组织300，上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1-EGF与TD-1-EGF+ATP。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中，恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm，在启动透皮扩散仪的16h从透皮槽下槽开口处取200μl收集液400。

检测：将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品，使用人表皮细胞生长因子ELISA试剂盒(武汉博士德公司，商品编号：EK0325)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的huEGF含量，绘制EGF含量标准曲线，由试剂盒自身配备的EGF标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后，各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF的浓度，进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。

数据分析：student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。

结果显示，对比使用相同EGF量的融合蛋白TD-1-EGF和TD-1-EGF+ATP作为人类皮肤组织透皮药物的两组，发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中，TD-1-EGF+ATP透皮组明显具有更加良好的透皮效果，TD-1-EGF+ATP组透皮药物比TD-1-EGF组透皮药物的透皮量显著增加。透皮16小时后，透皮量由TD-1-EGF组中的30.88033±19.55883pg上升到TD-1-EGF+ATP组的101.59833±2.92836pg。在TD-1-EGF融合蛋白透皮过程中加入20mM ATP与TD-1-EGF融合蛋白透皮对照组比较具有显著性，如图6所示。

实施例6  TD-1介导IFN穿透人类皮肤组织过程中添加ATP与不添加ATP的透皮效果比较

在TD-1介导的蛋白质药物IFN透皮给药过程中同时应用不同剂量(0mM-20mM)的生物直接能量供应物质三磷酸腺苷---ATP，以检测TD-1介导的蛋白质药物IFN的透皮效率与ATP剂量的关系。

健康的成年男性3人，取外科手术后腋窝皮肤组织置于生理盐水(0.9％Nacl水溶液)中待用。

配制透皮药物：将纯度达到95％以上的IFN(储液浓度1mg/mL)，用吉尔森移液枪(Gilson，France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg)，用生理盐水稀释到500μL，再向其中加入TD-1多肽10μg，即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml，如图1所示，置于透皮槽上槽100作为TD-1+IFN组透皮药物。另将纯度达到95％以上的IFN按100μg/ml的浓度，用生理盐水稀释到500μl，再向其中加入TD-1多肽10μg和20mM的ATP，待ATP充分溶解后，置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1+IFN+ATP组透皮药物。

透皮给药：透皮给药：将透皮槽下槽200内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子，透皮上槽与下槽之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300，上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1+IFN与TD-1+IFN+ATP。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中，恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm，在启动透皮扩散仪的4h从透皮槽下槽200开口处取200μl收集液400。

检测：将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品，使用人-α干扰素含量ELISA检测试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的IFN含量，绘制IFN含量标准曲线，由试剂盒自身配备的IFN标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后，各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF的浓度，进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。

数据分析：student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。

结果显示，对比使用相同IFN、TD-1量的TD-1+IFN和TD-1+IFN+ATP作为透皮药物的两组，发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中，TD-1+IFN+ATP透皮组明显具有更加良好的透皮效果，透皮绝对量由不添加ATP时的138.893±56.78392pg上升到添加ATP时的388.356±122.6756pg。在TD-1介导的IFN透皮过程中加入ATP与TD-1单独介导IFN透皮对照组(不加入ATP透皮组)比较具有不同置信区间的显著性，如图7所示。

实施例7  乌本苷对透皮效率的影响

在TD-1介导的透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF以及IFN透皮给药过程中同时应用生物体水解ATP的ATP酶抑制剂---乌本苷(Ouabain)，以检测ATP水解受到抑制，即ATP实际可利用量较少后，透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF以及IFN的透皮效率是否受到影响。

取完整SD大鼠腹部皮肤组织，去毛后置于生理盐水(0.9％Nacl水溶液)中待用。

配制透皮药物：将纯度达到95％以上的融合蛋白TD-1-EGF(储液浓度1mg/mL)，用吉尔森移液枪(Gilson，France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg)，用生理盐水稀释到500μL，即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml，置于透皮槽上槽作为TD-1-EGF组透皮药物。另将纯度达到95％以上的融合蛋白TD-1-EGF按上述同样方法稀释到给药浓度为100μg/ml，再向其中加入50mM的乌本苷，待乌本苷充分溶解后，置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1-EGF+ouabain组透皮药物。

将纯度达到95％以上的IFN(储液浓度1mg/mL)，用吉尔森移液枪(Gilson，France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg)，用生理盐水稀释到500μL，再向其中加入TD-1多肽10μg，置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1+IFN组透皮药物。另将纯度达到95％以上的IFN、TD-1按上述同样方法稀释到给药浓度，再向其中加入50mM的乌本苷，待乌本苷充分溶解后，置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1+IFN+ouabain组透皮药物。

透皮给药：将透皮槽下槽内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子，透皮上槽100与下槽200之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300，上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1-EGF与TD-1-EGF+Ouabain、TD-1+IFN和TD-1+IFN+Ouabain。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中，恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm，在启动透皮扩散仪的4h从透皮槽下槽开口处取200μl收集液400。

检测：将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品，使用人表皮细胞生长因子ELISA试剂盒(武汉博士德公司，商品编号：EK0325)和人-α干扰素含量ELISA检测试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的huEGF、IFN含量，绘制EGF、IFN含量标准曲线，分别由试剂盒自身配备的EGF及IFN标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后，各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF和IFN的浓度，进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。

数据分析：student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。

结果显示，对比使用相同EGF量的融合蛋白TD-1-EGF和TD-1-EGF+Ouabain作为透皮药物的两组，发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中，TD-1-EGF+ouabain透皮组的透皮效果受到明显抑制，透皮量由TD-1-EGF组中的152.05±56.7109pg下降到TD-1-EGF+Ouabain组的28.06233±6.4581pg。在TD-1-EGF融合蛋白透皮过程中加入50mM Ouabain与TD-1-EGF融合蛋白透皮对照组比较具有显著性。对比使用相同IFN、TD-1量的TD-1+IFN和TD-1+IFN+Ouabain作为透皮药物的两组，发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中，TD-1+IFN透皮组明显具有更加良好的透皮效果，透皮绝对量由不添加Ouabain时的1987.983pg±568.38692pg下降到添加Ouabain时的588.356±282.6668pg。在TD-1介导、ATP增强的IFN透皮过程中加入Ouabain与TD-1介导、ATP增强的IFN透皮过程中不加入Ouabain比较具有不同置信区间的显著性，如图8、9所示。

实施例8原核表达Na⁺，K⁺ATPaseβsubunit(ATP1B1)对透皮效率的影响

在TD-1介导的透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF及TD-1介导的蛋白质药物IFN透皮给药过程中同时应用生物直接能量供应物质三磷酸腺苷(ATP)，并在透皮过程中添加原核表达的Na⁺，K⁺ATPaseβsubunit(ATP1B1)，以检测外源Na⁺，K⁺ATPaseβsubunit是否对ATP促透效率有影响，从而评估大鼠皮肤内源性Na⁺，K⁺ATPaseβsubunit在ATP增强、TD-1介导的蛋白质药物透皮给药是否具有重要的作用。

取完整SD大鼠腹部皮肤组织，去毛后置于生理盐水(0.9％Nacl水溶液)中待用。

配制透皮药物：将纯度达到95％以上的融合蛋白TD-1-EGF(储液浓度1mg/mL)，用吉尔森移液枪(Gilson，France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg)，用生理盐水稀释到500μL，即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml，再向其中加入原核表达产物GST蛋白20μg(表达载体为pGex-6P-1，Pharmacia，USA，Cat.No.27-4597-01，诱导剂为IPTG，BBI，Canada.Cat.No.IB0168，诱导过程如下：转化pGex-6p-1质粒于BL-21-DE3感受态细胞，Transgen，China，Cat.No.CB305，接种至LB培养基，待OD值达到0.6-0.8之间，加入1mM IPTG，25℃诱导5小时，高压破碎细菌后收集蛋白，使用BCA试剂盒Beyotime，China，Cat.No.P0010S定量蛋白浓度)，置于透皮槽上槽100作为TD-1-EGF+GST组透皮药物。另将纯度达到95％以上的融合蛋白TD-1-EGF按上述同样方法稀释到给药浓度为100μg/ml，再向其中加入原核表达产物GST-ATP1B1蛋白20μg(表达载体为pGex-6P-1，Pharmacia，USA，Cat.No.27-4597-01，诱导剂为IPTG，BBI，Canada.Cat.No.IB0168，诱导过程如下：转化pGex-6p-1-ATP1B1质粒于BL-21-DE3感受态细胞，Transgen，China，Cat.No.CB305，接种至LB培养基，待OD值达到0.6-0.8之间，加入1mM IPTG，25℃诱导5小时，高压破碎细菌后收集蛋白，使用BCA试剂盒Beyotime，China，Cat.No.P0010S定量蛋白浓度)，置于透皮槽上槽100作为TD-1-EGF+GST-ATP1B1组透皮药物。。

将纯度达到95％以上的蛋白IFN(储液浓度1mg/mL)，用吉尔森移液枪(Gilson，France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg)，用生理盐水稀释到500μL，即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml，向其中加入TD-1多肽10μg后再向其中加入原核表达产物GST蛋白20μg(表达载体为pGex-6P-1，Pharmacia，USA，Cat.No.27-4597-01，诱导剂为IPTG，BBI，Canada.Cat.No.IB0168，诱导过程如下：转化pGex-6p-1质粒于BL-21-DE3感受态细胞，Transgen，China，Cat.No.CB305，接种至LB培养基，待OD值达到0.6-0.8之间，加入1mM IPTG，25℃诱导5小时，高压破碎细菌后收集蛋白，使用BCA试剂盒Beyotime，China，Cat.No.P0010S定量蛋白浓度)，置于透皮槽上槽100作为TD-1+IFN+GST组透皮药物。另将纯度达到95％以上的蛋白IFN按上述同样方法稀释到给药浓度为100μg/ml，向其中加入TD-1多肽10μg后再向其中加入原核表达产物GST-ATP1B1蛋白20μg(表达载体为pGex-6P-1，Pharmacia，USA，Cat.No.27-4597-01，诱导剂为IPTG，BBI，Canada.Cat.No.IB0168)，诱导过程如下：转化pGex-6p-1-ATP1B1质粒于BL-21-DE3感受态细胞，Transgen，China，Cat.No.CB305，接种至LB培养基，待OD值达到0.6-0.8之间，加入1mM IPTG，25℃诱导5小时，高压破碎细菌后收集蛋白，使用BCA试剂盒Beyotime，China，Cat.No.P0010S定量蛋白浓度)，置于透皮槽上槽100作为TD-1+IFN+GST-ATP1B1组透皮药物。

透皮给药：将透皮槽下槽内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子，透皮上槽100与下槽200之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300，上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1-EGF+GST与TD-1-EGF+GST-ATP1B1、TD-1+IFN+GST和TD-1+IFN+GST-ATP1B1。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中，恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm，在启动透皮扩散仪的4h从透皮槽下槽开口处取200μl收集液400。

检测：将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品，使用人表皮细胞生长因子ELISA试剂盒(武汉博士德公司，商品编号：EK0325)和人-α干扰素含量ELISA检测试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的huEGF、IFN含量，绘制EGF、IFN含量标准曲线，分别由试剂盒自身配备的EGF及IFN标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后，各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF和IFN的浓度，进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。

数据分析：student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。

结果显示，对比使用相同EGF量的融合蛋白TD-1-EGF和TD-1-EGF+Ouabain作为透皮药物的两组，发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中，TD-1-EGF+GST-ATP1B1透皮组的透皮效果受到明显抑制，透皮量由TD-1-EGF+GST组中的225.45216±38.8978pg下降到TD-1-EGFTD-1-EGF+GST-ATP1B1组的71.81568±17.3321pg。在TD-1-EGF+GST融合蛋白透皮过程组与TD-1-EGF+GST-ATP1B1融合蛋白透皮对照组比较具有显著性。对比使用相同IFN、TD-1量的TD-1+IFN+GST和TD-1+IFN+GST-ATP1B1作为透皮药物的两组，发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中，TD-1+IFN+GST透皮组明显具有更加良好的透皮效果，透皮绝对量由267.987pg±89.89843pg下降到添加GST-ATP1B1时的78.8989±33.8987pg。在TD-1介导的IFN透皮过程中加入GST与TD-1介导的IFN透皮过程中加入GST-ATP1B1比较具有不同置信区间的显著性，如图10所示。

实施例9不同能量形式作为透皮药物的对比

在TD-1介导的透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF透皮给药过程中同时应用生物直接能量供应物质三磷酸腺苷(ATP)，以及各种ATP结构类似能量供应物，如ADP、AMP、ATP-γ-S、GTP、AMP-PNP等，以检测诸多ATP结构类似物型能量供应物对透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF、IFN的透皮效率是否有影响。

取完整SD大鼠腹部皮肤组织，去毛后置于生理盐水(0.9％Nacl水溶液)中待用。

配制透皮药物：将纯度达到95％以上的融合蛋白TD-1-EGF(储液浓度1mg/mL)，用吉尔森移液枪(Gilson，France)吸取60μL(对应融合蛋白质量为60μg)，用生理盐水稀释到500μL，即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为120μg/ml，置于透皮槽上槽100作为TD-1-EGF组透皮药物。另将纯度达到95％以上的融合蛋白TD-1-EGF按上述同样方法稀释到给药浓度为120μg/ml，再向其中加入10mM的ATP、ADP(BBI，AD0016D)以及AMP(BBI，AD0016M)。将纯度达到95％以上的蛋白IFN(储液浓度1mg/mL)，用吉尔森移液枪(Gilson，France)吸取50μL(对应蛋白质量为50μg)，加入TD-1多肽10μg，用生理盐水稀释到500μL，即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml，置于透皮槽上槽100作为TD-1+IFN组透皮药物。另将纯度达到95％以上的蛋白IFN和10μg TD-1按上述同样方法稀释到给药浓度为100μg/ml，再向其中加入10mM的ATP、GTP(BBI，GD0250T)、ATP-γ-S(Sigma-Aldrich，A1388)、AMP-PNP(Sigma-Aldrich，A2647)。待各个能量形式化合物充分溶解后，置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1-EGF+不同能量形式组(ATP、ADP、AMP)和TD-1+IFN+不同能量形式组(GTP、ATP-γ-S、AMP-PNP)透皮药物。

透皮给药：将透皮槽下槽内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子，透皮上槽100与下槽200之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300，上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1-EGF与TD-1-EGF+不同能量形式组(ATP、ADP、AMP)以及TD-1+IFN与TD-1+IFN+不同能量形式组(GTP、ATP-γ-S、AMP-PNP)。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中，恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm，分别在启动透皮扩散仪的4h和16h从透皮槽下槽开口处取200μl收集液400，并在4h取样后分别从透皮槽下槽开口处加入200μl生理盐水维持下槽中收集液总体积不变(IFN仅检测4小时时间点)。

检测：将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品，使用人表皮细胞生长因子ELISA试剂盒(武汉博士德公司，商品编号：EK0325)和人-α干扰素含量ELISA检测试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的huEGF、IFN含量，绘制EGF、IFN含量标准曲线，由试剂盒自身配备的EGF标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后，各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF、IFN的浓度，进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。

数据分析：student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。

结果显示，对比使用相同EGF量的融合蛋白TD-1-EGF和TD-1-EGF+不同能量形式(ATP、ADP、AMP等)作为透皮药物的两组，如图11所示，发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中，TD-1-EGF+ATP透皮组明显具有更加良好的透皮效果，透皮量由409.3749±96.35405pg上升到752.08325±31.77075pg，而TD-1-EGF+ADP组是376.5625±58.33335pg，TD-1-EGF+AMP组则是240.625±97.39585pg(4小时透皮取样时间点)；由TD-1-EGF组中的458.85425±104.16675pg上升到TD-1-EGF+ATP组的1294.7915±214.0625pg，而TD-1-EGF+ADP组是490.625±10.9375pg，TD-1-EGF+AMP组则是397.3958±113.5417pg(16小时透皮取样时间点)。在TD-1-EGF融合蛋白透皮过程中加入10mMATP与加入ADP、AMP以及TD-1-EGF融合蛋白透皮对照组比较具有显著性。

对比使用相同IFN量的融合蛋白TD-1+IFN和TD-1+IFN+不同能量形式(GTP、ATP-γ-S、AMP-PNP等)作为透皮药物的两组，如图12所示，发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中，TD-1+IFN+ATP透皮组明显具有更加良好的透皮效果，透皮量由256.3767±66.35405pg上升到732.05375±109.77565pg，而TD-1+IFN+ATP-γ-S组是387.2317±85.367pg，TD-1+IFN+ATP-γ-S组是356.5625±125.3565pg，TD-1+IFN+AMP-PNP组则是220.525±103.56pg(4小时透皮取样时间点)。在TD-1介导IFN蛋白透皮过程中加入10mM ATP与加入ATP-γ-S、AMP-PNP以及TD-1单独介导IFN蛋白透皮对照组比较具有显著性。

本发明的方法是通过在蛋白质药物经TD-1透皮输运的系统中，引入三磷酸腺苷(ATP)，以达到显著提高蛋白质药物在TD-1介导下经皮肤运输的能力，同时由于ATP是人体内各个器官的直接供能以及储能物质，生物安全性优于任何一种物理、化学促透装置或试剂，所以具有良好的增强透皮药物运输的临床应用前景。

根据本发明公开的上述实施例，本发明的至少两种透皮给药增强剂以及三磷酸腺苷(ATP)的组合可以与常规经皮方式给药的药物联合使用，以提高药物的透皮效果，这里的药物活性制剂可以是适合局部或透皮释放的一些能够导致理想的局部或系统的效果符合物和传统药物。一些物质包括许多复合物或者药物能够正常地通过包括皮肤在内的皮肤表面和其它膜系统。活性制剂包括更多的种类与可以仿效的得到的种类：老年痴呆药物；止痛制剂如镇静剂；麻醉剂；抗抗粉刺剂；抗忧虑药；抗风湿药；抗心律失常药；平喘药和其它呼吸系统药物；抗生素包括细菌制剂；抗癌制剂包括抗肿瘤药；抗糖尿病药(胰岛素等)；抗代谢异常药(生长激素等)；抗痛风药；解热止痛抗炎药；抗性功能障碍药；中草药；催产药；催产拮抗药；短、长效避孕药；节育药；麻醉药；全身骨骼肌松弛药；皮肤病治疗药；抗寄生虫药；抗病毒药；角质促成剂；抗青光眼药；散瞳用药；中枢神经兴奋、抑制药；抗癫痫药；抗震颤麻痹药；植物神经及神经肌内接药；心脑血管病治疗药；镇痛药；镇静催眠药；利尿药；助消化类药；止泻药等一切含有蛋白质类药物的有形成分的中药、西药物。这对于本领域的技术人员来说是显而易见的，因此同样属于本发明的范围。另外需要指出的是本发明的至少两种透皮给药增强剂以及三磷酸腺苷(ATP)的组合可以与常规经皮方式给药的药物联合使用，以提高药物的透皮效果，这里的药物活性制剂可以是适合局部或透皮释放的一些能够导致理想的局部或系统的效果符合物和传统药物，也可以是导致理想的局部或系统的效果符合物和新定义下的“药物”，如各种在化妆品和护肤品中应用广泛的具有一定生物学药理学“药用”功能的“药物”，包括但不限于实施例中优选的蛋白---人表皮生长因子(EGF)，EGF收缩毛孔、抗皱作用十分显著，原因是EGF能促进表皮细胞组织内多种细胞的生长分裂，使表皮细胞变得饱满、恢复年轻状态，它还可以促使胶原蛋白生长能力，修复老化断裂的胶原弹性纤维，所以被众多科学家誉为“美丽因子”，此外还可以作为药物帮助伤口的愈合和修复。此外，成纤维细胞生长因子(FGF)，包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)均属于本发明涵盖的“为透皮给药增强剂以及三磷酸腺苷(ATP)组合所增强的常规经皮方式给药的药物”，即不仅限于增强经皮给药药物的临床利用率，增强一些重要的蛋白质类生长因子的透皮吸收途径等也属于本发明的发明内容范围之内。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，如本发明包括但不限于实施例中优选的透皮增强剂(TD-1)、三磷酸腺苷(ATP)、经皮给药药物的药物比例，同样包括但不限于实施例中优选的透皮增强剂(TD-1)、三磷酸腺苷(ATP)、经皮给药药物的药物剂型，各种药物可以是液体形式、胶剂、膏剂、洗剂、贴剂等以及各种药物剂型的不同组合。即本发明的透皮释放成分含有可以令人接受材料和/或一个或多个佐剂组成的一个或多个药理学上令人接受的药物载体。上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。