一种产硫酸软骨素菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产硫酸软骨素

摘要

本发明阐述了一种产硫酸软骨素枯草芽孢杆菌的筛选方法和用该菌株发酵法生产硫酸软骨素，属于生物工程技术领域。本发明菌株是将豆豉经过沸水浴后稀释涂布，染色镜检得到的有芽孢菌株，然后对筛选出的菌株采用一级发酵逐一摇瓶培养，发酵液中加入鲨鱼硫酸软骨素标准品作为内标，采用高效液相色谱法进行定性分析筛选，并对筛选菌株进行形态学、生理生化及分子生物学鉴定。得到一株产硫酸软骨素的枯草芽孢杆菌。本发明同时公开一种采用该菌株生产硫酸软骨素的方法，采用本方法发酵24h硫酸软骨素产量为177mg/L。

说明书

技术领域

一种产硫酸软骨素的枯草芽孢杆菌的筛选方法及应用该菌株生产硫酸软骨素，属于生物工程领域，特别是一株产硫酸软骨素的枯草芽孢杆菌。

背景技术

硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)又名康得灵，是一种糖胺聚糖类多糖，其二糖单体由葡糖醛酸(D-GlcUA)与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β-1，3键相连，糖链生成后由磺基转移酶在GalNAc的碳4位或碳6位进行硫酸化，如图1。根据其化学组成和结构差异可分为A、B、C、D、E、F、H等多种，通常从哺乳动物组织中提取得到的硫酸软骨素以CS-A、CS-C为主。

CS是从动物软骨中提取的天然酸性粘多糖类药物，主要用于神经性头痛、关节痛、神经痛等。多年来，硫酸软骨素一直是医药类的小品种，产销量小。但近年来，硫酸软骨素作为一种新型药用活性成分，在医药制剂、医学材料、日化产品、化妆品、生发剂、保健品等领域应用广泛，越来越受到人们的重视，市场需求趋旺。我国生产和出口量逐年大幅增长，现已成为生化药物的第三大出口品种，发展前景看好。

目前，国内多使用传统工艺从动物软骨中提取生产硫酸软骨素，未见有采用微生物发酵法生产硫酸软骨素的报道。国外早在1988年Rodriguez et al.就发现病原菌E.coli O5:K4:H4能合成一种荚膜多糖，其重复单体为由GlcA、GalNAc和果糖的一个β连接末端的五环糖残基构成的二糖。除了果糖残基，其与未硫酸化的软骨素骨架非常相似。2002年DeAngelis et al.通过结构分析证明F型P.multocida产生未硫酸化的软骨素。2010年Jolly对大量微生物进行发酵分析，发现许多种类的微生物都能生产硫酸软骨素或其类似物。

对采用微生物发酵法生产软骨素的研究处于初步阶段，仍没用一种可以利用微生物发酵直接生产硫酸软骨素的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种硫酸软骨素生产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产硫酸软骨素。

本发明的技术方案：

1、一种产硫酸软骨素枯草芽孢杆菌的筛选方法：

1)枯草芽孢杆菌的初步分离纯化

称取约0.2g豆豉于20ml 0.85％无菌生理盐水中，将菌悬液在沸水中振荡加热10min后，迅速冷却至室温。此菌悬液作为母液梯度稀释至10^-8，取10^-6-10^-8稀释菌液涂布于LB平板上，37℃倒置培养24h，挑取不同菌落形态的单菌落进行结晶紫染色，显微镜下观察芽孢，将有芽孢菌株作为进一步筛选的枯草芽孢杆菌疑似菌株，编号保存；

2)产硫酸软骨素枯草芽孢杆菌的筛选

将上述分离纯化得到的菌种接种于营养肉汤培养基中，培养24h后离心收集发酵液，发酵液经高效液相方法中的内标法进行分析，使得硫酸软骨素标准品峰高增高的菌株即为产硫酸软骨素的枯草芽孢杆菌。

2、根据权利要求1所述一种产硫酸软骨素枯草芽孢杆菌的筛选方法，其筛选得到产硫酸软骨素的枯草芽孢杆菌的鉴定方法如下：

1)形态学鉴定

菌落形态、细胞形态、革兰氏染色、芽孢染色；

2)生理生化鉴定

接触酶试验，V.P.及M.R.试验，明胶液化及淀粉水解，耐盐耐酸试验，硝酸盐还原试验；

3)16S rDNA分子生物学鉴定

用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组DNA，采用枯草芽孢杆菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物用胶回收试剂盒回收纯化，并连接至克隆载体pMD 18 T Vector，转化到大肠杆菌JM109中，利用克隆载体的青霉素抗性筛选到阳性转化子，并用通用引物对转化子进行质粒PCR鉴定。

阳性克隆测序所得16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行同源性分析，得到与之亲缘关系最近的菌种Bacillus.subtilis，同源性达99％。

通过形态学、生理生化及16S rDNA分子生物学鉴定确定该菌株为枯草芽孢杆菌，并命名为Bacillus.subtilis BN。

3、本发明公开的一种硫酸软骨素的生产方法，其特征是采用Bacillus.subtilis BN为出发菌株，以种子培养和液体发酵生产硫酸软骨素；

1)种子培养：

种子培养基以g/L计：牛肉膏3，蛋白胨5，初始PH 7.2-7.4；

培养条件：温度37℃、摇床转速200rpm条件下，培养12-14h；

2)液体发酵培养：

发酵培养基以g/L计：牛肉膏3，蛋白胨5，初始PH 7.2-7.4；

发酵条件：接种量10％，温度37℃、摇床转速200条件下，发酵20-24h。

4、硫酸软骨素产量的测定

取发酵液3000rpm离心30min，收集上清液，并以鲨鱼硫酸软骨素作为标准品，配制100、200、300、400、500mg/L的标准溶液。将上清液与标准溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定硫酸软骨素的含量。

色谱条件：

色谱柱：150mm ZORBAX SB-AQ；

流动相：乙腈-2.28mmol/L四甲基氯化铵水溶液(体积比为10∶90)，用0.45μm滤膜过滤；

柱温：25℃；

检测波长：195nm；

进样量：10μl

流速：0.5ml/min。

标准曲线在100-500mg/L之间呈现良好的线性关系(图2)，回归方程：y＝0.1469x-1.5009，R²＝0.9990。据此得到24h硫酸软骨素的产量为177mg/L，如图3。

附图说明

图1硫酸软骨素的结构式，R和R₁相同或不同，代表H或SO₃Na，但不能同时为H，n＝5-50

图2鲨鱼硫酸软骨素标准曲线

图3色谱检测结果，A 500mg/L鲨鱼硫酸软骨素，B 24h发酵液

具体实施方式

以下是枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis BN)筛选、鉴定及发酵生产硫酸软骨素的实施例。

实施例1

称取约0.2g豆豉于20ml 0.85％无菌生理盐水中，将菌悬液在沸水中振荡加热10min后，迅速冷却至室温。此菌悬液作为母液梯度稀释至10^-8，取10^-6-10^-8稀释菌液涂布于LB平板上，37℃倒置培养24h，挑取不同菌落形态的单菌落进行结晶紫染色，显微镜下观察芽孢，挑选芽孢杆菌进一步发酵复筛。营养肉汤培养基37℃培养24h后离心收集发酵液，发酵液经高效液相方法中的内标法进行分析，用鲨鱼硫酸软骨素作内标，使硫酸软骨素标准品峰高增高的菌株即为产硫酸软骨素菌株。

实施例2

对筛选的BN菌株按《微生物分类学》进行生理生化特性鉴定(见表1、2)，并按细菌基因组提取试剂盒提取方法提取基因组DNA，以P1和P2为正向和反向引物：

P1：5’-CAGATGGGAGCTTGCTCCCTG-3’，

P2：5’-CGACTTCACCCCAATCATCTG-3’。

用PCR扩增16S rDNA基因，委托华大基因研究中心进行16S rDNA测序，得到本菌株部分16S rDNA序列(GenBank登录号：JF922967)后，在NCBI网站上用BLAST检索工具进行同源性比对分析。基于16S rDNA序列分析和生理生化特性鉴定，结合对该菌的生长和发酵特性研究，认为是枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus.subtilis BN。

表1菌株(BN)与枯草芽孢杆菌菌落形态特征对比

表2菌株(BN)生理生化鉴定结果

实施例3

菌株保藏于终浓度为15％的甘油管中，取100μl保藏菌液接入30ml营养肉汤培养基中进行种子培养，37℃，200rpm培养14h后，以10％的接种量接入50ml营养肉汤培养基进行发酵培养。营养肉汤组成为牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，培养基初始pH 7.2-7.4。在37℃，200rpm条件下发酵24h，用HPLC测定发酵液中的硫酸软骨素的含量。产量为177mg/L。