一种从紫花苜蓿干草中制备纯多糖的方法

摘要

本发明涉及一种从紫花苜蓿干草中制备纯化多糖的方法，提供一种能规模化生产，工艺简单，成本低，效率高的制备苜蓿纯多糖的方法。将风干或烘干的苜蓿草粉碎，加入一定量的水浸泡，料水比为1：20-1:45，在240-400W功率40-60kHz的超声波作用下以55-85℃加热10-35min，过滤收集滤液。将得到的滤液浓缩至1/3体积，用按体积比1：4混合的正丁醇-三氯甲烷溶液除去蛋白，再加入2-4.5倍于原液的乙醇醇析，静置后于3000-5000rpm下离心10-20min，取下层沉淀，于-70~-50℃下冷冻干燥得粗多糖。再使用2种纤维素柱层析法分离纯化多糖，即得高纯度多糖组分。本方法与传统方法相比，降低了成本，而且大幅提高了产出效率，所得多糖产品，纯度可达96%以上。

说明书

技术领域

本发明属于一种植物活性成分的提取方法，具体地涉及一种从紫花苜蓿干草中制备纯多糖的方法。

背景技术

苜蓿多糖(Alfalfa Polysaccharides，AP)是从紫花苜蓿中提取的植物多糖，包括APⅠ、APⅡ、AP Ⅲ、APⅣ 4个组分，是具有特殊生物活性的多糖。目前已证明苜蓿多糖在一定剂量范围内对畜禽有明显的促生长作用，具有增强免疫功能和抗感染作用，还有治疗高胆固醇的作用，且可强化血管和防止动脉硬化、血栓症、降血糖、抗辐射和心肌梗等。苜蓿多糖是无毒性的，而且有着很显著的保健效果，近年来它作为一种新型的保健食品和饲料添加剂而逐渐受到人们的重视。

紫花苜蓿作为一种多年生优质豆科牧草，在世界各国广泛栽培，资源丰富，为苜蓿多糖的生产提供了充足且廉价的原料。而苜蓿多糖的提取方法尚不完善，纯化技术也未经探讨，传统的提取方法通常要将草粉在沸水中连续煮2h左右，耗费能源与时间，生产效率低，且纯度没有保障。为了使其能更适应工业化生产 ，提取工艺则有待于改善。

发明内容

本发明的目的是提供一种从紫花苜蓿中提取和纯化分离苜蓿多糖的方法，利用超声波的辅助作用，大幅减少苜蓿多糖的浸提时间，提高提取效率。降低提取时所用温度，节约能源的投入。采用成本低廉的水作为溶剂，所用提取剂无毒无污染，可回收。提高多糖得率，操作简便易行，适合于大规模生产。

本发明提供的技术方案，其特征在于包括以下工艺步骤：

1、将风干或烘干的苜蓿草粉碎，过60目筛，加入20-35倍于草粉重量20-40℃的温水浸泡30min；

2、置于超声波提取器中，将温度升高到70-80℃，以后保持恒温，开启超声波，于400W功率下，以60kHz超声波作用20-30min，在此期间边加热边搅拌。作用后以真空泵抽滤，收集滤液，得多糖提取液；

3、将提取液用旋转蒸发器在70-90℃下浓缩至原体积的1/3，然后与等体积的正丁醇-三氯甲烷溶液混合，于分液漏斗中剧烈震荡后静置30min，弃去下层液体，依据本步骤反复操作3次得纯化的多糖溶液；

4、于上述所得多糖溶液中加入3-4倍体积乙醇，待充分产生沉淀后，3000-4000rpm下离心10-15min，收集下层沉淀；将沉淀物以-70~-60℃于冻干机中冷冻干燥，即得多糖结晶，装入密封容器中保存备用；

5、使用玻璃层析柱湿法装填Sephadex A-25纤维素凝胶，装填高度35-45cm，将整个系统用蒸馏水平衡24h，之后加入前述步骤制得的粗多糖，以蠕动恒流泵过柱，上样量：50-150mg；洗脱速度：8-12ml/h；依次用0.05-0.15mol/L、0.2-0.4 mol/L、0.45-0.55 mol/L和0.6-0.8 mol/L的NaCl溶液洗脱；四个浓度梯度依次收集50ml，75ml，75ml，50ml洗脱液；

6、进一步纯化使用4组玻璃层析柱湿法装填Sephadex G-200纤维素凝胶，装填高度35-45cm，在加入样品前，将整个系统用蒸馏水平衡24h；4组玻璃层析柱中分别通入上述4组洗脱液，以蠕动恒流泵过柱，洗脱速度：4-8ml/h；用0.1-0.3mol/L的NaCl溶液洗脱；

7、收集各Sephadex G-200柱滤液于旋转蒸发器在70-90℃下浓缩至原体积的1/3，分别加入3-4倍体积乙醇，待充分产生沉淀后，3000-4000rpm下离心10-15min，收集下层沉淀；将沉淀物以-70~-60℃于冻干机中冷冻干燥，即得各组分纯多糖结晶。

上述方案中所用乙醇浓度为95-100%。为了尽可能充分地收集到多糖产品，在超声波作用后和抽滤时需用水将所用过的容器洗涤2-3次，在醇析之后需用乙醇将所用容器洗涤2-3次。以上步骤中所用乙醇均可蒸馏回收留作下次使用。

本发明是在多次分析和试验的基础上，以苜蓿多糖得率为指标，对提取过程中的提取温度，浸提时间，料液比，萃取次数，醇析用乙醇量，以及各种柱层析条件等因素分别进行分析考察，确定了苜蓿多糖的最佳提取和纯化条件，为苜蓿多糖的开发和生产提供依据。

本发明的积极效果：利用超声波的辅助作用，大幅减少了苜蓿多糖的浸提时间，提高了提取效率。降低了提取时所用温度，节约了能源的投入。同时引入了用纤维素柱层析法纯化苜蓿多糖的技术，填补了其纯品难以制备的空白。本发明采用成本低廉的水作为溶剂，所用提取剂无毒无污染，可回收。提高多糖得率，多糖产品纯度可达96%以上。操作简便易行，适合于大规模生产。有利于苜蓿多糖作为人类保健品和畜禽饲料添加剂应用。

具体实施方式

实施例1

（1）    将风干或烘干含水率15%以下的苜蓿草粉碎，过60目筛，加入30倍于草粉重量30℃的温水浸泡30min。

（2）    置于超声波提取器中，将温度升高到70℃，以后保持恒温，开启超声波，于400W功率下，以60kHz超声波作用20min，在此期间边加热边搅拌。作用后以真空泵抽滤，收集滤液，得多糖提取液。

（3）    将提取液用旋转蒸发器在80℃条件下浓缩至原体积的1/3，然后与等体积的正丁醇-三氯甲烷溶液（正丁醇与三氯甲烷以1：4体积比混合）混合，于分液漏斗中剧烈震荡后静置30min，弃去下层液体，依据本步骤反复操作3次得纯化的多糖溶液。

（4）    于上述所得溶液中加入3倍体积乙醇，乙醇浓度为95-100%，待充分产生沉淀后，3000rpm下离心10min，收集下层沉淀。将沉淀物以-70~-60℃于冻干机中冷冻干燥，即得多糖结晶。

（5）    使用玻璃层析柱（50*1.6cm）湿法装填Sephadex A-25纤维素凝胶，装填高度35 cm，将整个系统用蒸馏水平衡24h，之后加入前述步骤制得的粗多糖，以蠕动恒流泵过柱，上样量：60mg,洗脱速度：8ml/h。依次用0.1mol/L、0.3 mol/L、0.5 mol/L和0.7 mol/L的NaCl溶液洗脱。四个浓度梯度依次收集50ml，75ml，75ml，50ml洗脱液。

（6）    进一步纯化使用4组玻璃层析柱（50*1.6cm）湿法装填Sephadex G-200纤维素凝胶，装填高度35cm，在加入样品前，将整个系统用蒸馏水平衡24h。4组玻璃层析柱中分别通入上述4组洗脱液，以蠕动恒流泵过柱，洗脱速度：4ml/h。用0.1mol/L的NaCl溶液洗脱。

（7）    收集各Sephadex G-200柱滤液于旋转蒸发器在70-90℃下浓缩至原体积的1/3，分别加入3倍体积乙醇，乙醇浓度为95-100%，待充分产生沉淀后，3000rpm下离心10min，收集下层沉淀。将沉淀物以-70~-60℃于冻干机中冷冻干燥，即得APⅠ、APⅡ、AP Ⅲ、APⅣ 4个组分纯多糖结晶。将所得各组分用紫外分光光度计于200-400nm波长范围内扫描，在260nm、280nm处均无特定吸收峰，表明其中不含蛋白、多肽及核酸类物质。经硫酸-咔唑反应，斐林试剂反应，碘-碘酸钾反应，双缩脲反应，三氯化铁反应鉴定均呈阴性，表明多糖中不含糖醛酸、还原糖、淀粉、蛋白质和酚类化合物。苯酚-浓硫酸法于490nm波长下鉴定多糖含量均大于96%。

实施例2

（1）    将风干或烘干含水率15%以下的苜蓿草粉碎，过60目筛，加入35倍于草粉重量35℃的温水浸泡30min。

（2）    置于超声波提取器中，将温度升高到75℃，以后保持恒温开启超声波，于400W功率下，以60kHz超声波作用25min，在此期间边加热边搅拌。作用后以真空泵抽滤，收集滤液，得多糖提取液。

（3）    将提取液用旋转蒸发器在85℃条件下浓缩至原体积的1/3，然后与等体积的正丁醇-三氯甲烷溶液（正丁醇与三氯甲烷以1：4体积比混合）混合，于分液漏斗中剧烈震荡后静置30min，弃去下层液体，依据本步骤反复操作3次得纯化的多糖溶液。

（4）    于上述所得溶液中加入3.5倍体积乙醇，乙醇浓度为95-100%，待充分产生沉淀后，4000rpm下离心10min，收集下层沉淀。将沉淀物以-70~-60℃于冻干机中冷冻干燥，即得多糖结晶，装入密封容器中保存备用。

（5）    分离纯化使用玻璃层析柱（50*1.6cm）湿法装填Sephadex A-25纤维素凝胶，装填高度40cm，在加入样品前，将整个系统用蒸馏水平衡24h。以蠕动恒流泵过柱，上样量：100mg,洗脱速度：10ml/h。依次用0.15mol/L、0.35 mol/L、0.55 mol/L和0.75mol/L、的NaCl溶液洗脱。四个浓度梯度依次收集50ml，75ml，75ml，50ml洗脱液。

（6）    进一步纯化使用4组玻璃层析柱（50*1.6cm）湿法装填Sephadex G-200纤维素凝胶，装填高度40cm，在加入样品前，将整个系统用蒸馏水平衡24h。4组玻璃层析柱中分别通入上述4组洗脱液，以蠕动恒流泵过柱，洗脱速度：6ml/h。用0.1mol/L的NaCl溶液洗脱。

（7）    收集各Sephadex G-200柱滤液于旋转蒸发器在70-90℃下浓缩至原体积的1/3，分别加入3.5倍体积乙醇，乙醇浓度为95-100%，待充分产生沉淀后，4000rpm下离心10min，收集下层沉淀。将沉淀物以-70~-60℃于冻干机中冷冻干燥，即得APⅠ、APⅡ、AP Ⅲ、APⅣ 4个组分纯多糖结晶。将所得各组分用紫外分光光度计于200-400nm波长范围内扫描，在260nm、280nm处均无特定吸收峰，表明其中不含蛋白、多肽及核酸类物质。经硫酸-咔唑反应，斐林试剂反应，碘-碘酸钾反应，双缩脲反应，三氯化铁反应鉴定均呈阴性，表明多糖中不含糖醛酸、还原糖、淀粉、蛋白质和酚类化合物。苯酚-浓硫酸法于490nm波长下鉴定多糖含量均大于96%。

实施例3

（1）    将风干或烘干含水率15%以下的苜蓿草粉碎，过60目筛，加入40倍于草粉重量40℃的温水浸泡30min。

（2）    置于超声波提取器中，将温度升高到80℃，以后保持恒温开启超声波，于400W功率下，以60kHz超声波作用30min，在此期间边加热边搅拌。作用后以真空泵抽滤，收集滤液，得多糖提取液。

（3）    将提取液用旋转蒸发器在90℃下浓缩至原体积的1/3，然后与等体积的正丁醇-三氯甲烷溶液（正丁醇与三氯甲烷以1：4体积比混合）混合，于分液漏斗中剧烈震荡后静置30min，弃去下层液体，依据以上步骤反复操作3次得纯化的多糖溶液。

（4）    于上述所得溶液中加入4倍体积乙醇，乙醇浓度为95-100%，待充分产生沉淀后，于4000rpm下离心10min，收集下层沉淀。将沉淀物以-70~-60℃于冻干机中冷冻干燥，即得多糖结晶。

（5）    分离纯化使用玻璃层析柱（50*1.6cm）湿法装填Sephadex A-25纤维素凝胶，装填高度45cm，在加入样品前，将整个系统用蒸馏水平衡24h。以蠕动恒流泵过柱，上样量：150mg,洗脱速度：12ml/h。依次用0.05mol/L、0.25 mol/L、0.45 mol/L和0.65 mol/L的NaCl溶液洗脱。四个浓度梯度依次收集50ml，75ml，75ml，50ml洗脱液。

（6）    进一步纯化使用4组玻璃层析柱（50*1.6cm）湿法装填Sephadex G-200纤维素凝胶，装填高度45cm，在加入样品前，将整个系统用蒸馏水平衡24h。4组玻璃层析柱中分别通入上述4组洗脱液，以蠕动恒流泵过柱，洗脱速度：8ml/h。用0.2mol/L的NaCl溶液洗脱。

（7）    收集各Sephadex G-200柱滤液于旋转蒸发器在70-90℃下浓缩至原体积的1/3，分别加入4倍体积乙醇，乙醇浓度为95-100%，待充分产生沉淀后，4000rpm下离心10min，收集下层沉淀。将沉淀物以-70~-60℃于冻干机中冷冻干燥，即得APⅠ、APⅡ、AP Ⅲ、APⅣ 4个组分纯多糖结晶。将所得各组分用紫外分光光度计于200-400nm波长范围内扫描，在260nm、280nm处均无特定吸收峰，表明其中不含蛋白、多肽及核酸类物质。经硫酸-咔唑反应，斐林试剂反应，碘-碘酸钾反应，双缩脲反应，三氯化铁反应鉴定均呈阴性，表明多糖中不含糖醛酸、还原糖、淀粉、蛋白质和酚类化合物。苯酚-浓硫酸法于490nm波长下鉴定多糖含量均大于96%。