人儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)测定

摘要

本文公开了定量样品中儿茶酚胺-O-甲基转移酶(COMT)蛋白的量的测定(测定法)，所述样品为例如来自细胞培养物、体液、组织的提取物以及环境样品。其在竞争性ELISA系统中将新型试剂(抗-NE、COMT-NE或COMT-表位-NE)与先前所述的两种试剂(抗-COMT和COMT)联合使用以实现此目的。

说明书

发明背景

COMT为存在于人体许多组织中的酶。其主要功能为使起激素和神经递质作用的肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺(儿茶酚胺)失活，从而促进从身体移除这些物质。本发明人以前已表明该酶的细胞水平由雌激素——雌二醇调节。许多化学物质(人造的和天然存在的)都可模拟或抑制雌二醇的作用。如果进入人体，这样的化学物质可导致对雌二醇正常作用的干扰，并在人生命的各个阶段都引起健康问题。这些化学物质以及影响其它激素作用和新陈代谢的其它化学物质统称为内分泌干扰物。影响雌二醇作用的化学物质很可能是内分泌干扰物中最重要的一类。它们与西方男性的精子数下降以及常见癌症例如乳腺癌和卵巢癌的成因有关。

本发明人已表明，多氯联苯(PCB；公认对人类健康和较大范围的环境具有极其严重的威胁)和各种增塑剂及相关化学物质能够调节COMT蛋白表达水平。这些化学物质都不与雌二醇密切相关，但它们都通过与雌二醇相同的机理调节COMT水平(Ho等，2008a，b)。因而，测定暴露于这样的化学物质的细胞中的COMT蛋白是对该化学物质雌激素活性的一种衡量。从未对存在于或者可能被引入环境中的大量化学物质评估过它们干扰内分泌的雌激素潜能。这是因为作为公认的内分泌干扰试验的二代大鼠试验很耗时间且非常昂贵。欧盟颁布的法规指出存在大约30,000种必须检验的化学物质。如上所述，COMT蛋白测定可能提供干扰雌激素内分泌潜能的衡量。测定COMT蛋白的现有方法慢、工作量大，且受限于样品处理能力。例如，目前人COMT蛋白浓度的测定通过使用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)/蛋白质印迹测定法实现。SDS-PAGE涉及使用包含丙烯酰胺和双丙烯酰胺(它们为神经毒的)以及十二烷基硫酸钠(它为肺刺激物和致敏物)的缓冲液和凝胶。尽管许多实验室使用商用预制凝胶和制备好的缓冲液，以使工作人员暴露于这些化学物质的程度最小，但是它们存在于实验室环境内，并且需要执行合适的安全规程以确保安全操作和处理。SDS-PAGE/蛋白质印迹法耗时、繁琐、难以准确定量、相对受限于其处理样品的能力，因而也是高成本的。

评估COMT浓度的备选方法为测定COMT活性并推断结果。这涉及利用所述酶的放射性底物，以及伴随它们的附带危险和处理污染物的难题。因此，需要一种简单、廉价并可处理很多样品的COMT测定法。下文所述测定法克服了这些难题，因为其易于使用、廉价并具有高样品处理能力。因此，其特别适合作为潜在雌激素内分泌干扰物的初始筛选系统。

发明简述

本发明提供用于测定生物培养物、生物组织、生物液体和环境样品中COMT蛋白水平的简单、准确、廉价且快速的方法。

本发明的其它方面为新型抗体、多肽和多核苷酸。在另外的方面，本发明提供包含可用于测定的材料的试剂盒。

附图简述

图1描述新型表位(NE)构建体的线性结构。

图2阐述COMT测定的实施方案可如何进行。

图3显示COMT测定的实施方案如何运作。该测定中的颜色强度与标准样品和未知浓度样品中的COMT浓度成反比。

图4提供新型表位(NE)的预测二级结构。

图5显示通过抗-NE抗体和抗-COMT抗体检测HEK293细胞中的重组MB-COMT-NE蛋白。

图6显示通过抗-NE抗体和抗-COMT抗体免疫沉淀(IP)和检测HEK293细胞中重组MB-COMT-NE蛋白的结果。

图7显示大肠杆菌中的重组MB-COMT-NE蛋白的考马斯蓝蛋白染色。

图8显示通过抗-NE抗体、抗-COMT抗体和抗-GST抗体检测重组GST-MB-COMT-NE蛋白。

图9显示测定抗-NE抗体亲和结合至修饰NE表位的斑点印迹测定结果。还显示了保守(类别内)氨基酸取代的实例的表格，可进行所述取代以产生潜在具有基本相同抗原特性(例如结合抗-NE-表位)的其它NE-表位变体。

图10显示在MCF-7细胞裂解物中的COMT竞争性ELISA测定的实例。

图11显示COMT EIA试剂盒的标准曲线的实例。

序列简述

SEQ ID NO：1为18个氨基酸的新型表位(NE)。

SEQ ID NO：2为用于含BamHI限制位点的人S-COMT cDNA的正向引物。

SEQ ID NO：3为用于含BamHI限制位点的人MB-COMT cDNA的正向引物。

SEQ ID NO：4为用于编码NE序列和EcoRI限制位点的S-COMT和MB-COMT的反向引物。

SEQ ID NO：5为用于含BamHI限制位点的COMT-表位的正向引物。

SEQ ID NO：6为用于COMT-表位并编码NE序列和EcoRI限制位点的反向引物。

SEQ ID NO：7为人COMT的残基80-98，其为MB-同工型和S-同工型所共有。

SEQ ID NO：8为18个氨基酸的新型表位(NE)的变体#1。

SEQ ID NO：9为18个氨基酸的新型表位(NE)的变体#2。

SEQ ID NO：10为18个氨基酸的新型表位(NE)的变体#3。

发明详述

COMT为在镁(Mg)存在下催化甲基从辅酶S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)转移至儿茶酚的一个羟基上的遍在酶。其正常生理作用是儿茶酚胺(例如内分泌剂、神经递质剂和升压剂)、多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素的甲基化，而甲基化是这些化合物分解代谢的一部分。以前，本发明人确认了人COMT基因的转录由雌二醇以涉及雌二醇α-受体的非经典方式强而有效地调节(Xie等，1999；Jiang等，2003)。COMT可能在包括雌激素诱导的癌症、帕金森病、抑郁症、精神分裂症和高血压(Bonifácio等，2007；Tom等，1998；Lewandowski，2007；Houston，2007)在内的不同人类病症的病理生理学中起重要。这是因为COMT甲基化其它底物，例如儿茶酚雌激素(例如致癌的4-羟基雌二醇)、黑色素新陈代谢中的吲哚中间体、生物异源儿茶酚(例如致癌的类黄酮)以及药物(例如左旋多巴)。

另外，COMT的表达不仅受雌二醇的影响，还受化学结构差异很大但具有模拟或拮抗雌二醇作用的能力的化合物的影响。在该类别中的化合物为例如多氯联苯(PCB)和增塑剂例如邻苯二甲酸二异己基酯以及相关化合物例如辛基苯酚(Ho等，2008a，b)。此外，应注意到的是，人基因的转录调节通常是复杂的，且其它非雌激素物质也可能够通过其它直接和间接途径来充分调节COMT基因的转录。在动物和人的不同生理状态下都发现COMT活性的改变。COMT在肿瘤形成中可能起病因作用(Ho等，2008a，b；Thompson等，2000)。

该测定可用于测量来自各种组织和细胞的提取物以及体液中的人COMT蛋白浓度。因为各种COMT诱导物和抑制剂(例如异源雌激素(xenoestrogen)和现有药物(例如用于治疗帕金森病的恩他卡朋(Entacapone)和托卡朋(Tolcapone)))以及作为不良事件影响COMT表达的药物可影响COMT表达，所以该测定可用于评估这样的化合物的作用。如上所述，作为环境污染物存在的多种化合物例如PCB、增塑剂和异源雌激素影响COMT表达(Ho等，2008a，b)。因而该测定还可用于评估这样的化合物的作用。此外，环保主义者对工业污染物影响日益增加的担忧已促使欧盟通过立法(生效于2008年(REACH法规))要求制造商评估其工艺中所用化学物质干扰内分泌的作用。目前，名单达到约30,000种化学物质。COMT测定连同表达COMT和雌二醇受体的人细胞系(例如MCF-7细胞)将提供廉价的雌激素活性初筛。

本发明人的研究使COMT测定以及对人COMT基因调节的详细研究(Xie等，1999；Jiang等，2003)与阐明涉及自发性帕金森病病因的因素相关联，以试图解释与女性相比该疾病发病率稍微偏向男性的原因。这已引起对使用COMT测定以评估内分泌干扰物潜能的可能性的认识(Ho等，2008a，b)。

本发明的ELISA易于使用。其具有高度的特异性和灵敏度，测定内和测定间变异系数小，并且利用对人类健康风险低且容易处理的化学物质。因此，其成本效益比低。其在样品处理方面灵活，并且可用于处理少量或大量的样品。

这实现首次获得以低成本且简单而准确地在大量样品中测量人COMT蛋白表达的能力。

本发明中，设计了与任何人类蛋白均不具有同源性(＜30％)的新型18个氨基酸的肽序列(新型表位，NE)(图1)，并将其作为蛋白检测的标记克隆至天然COMT中。关于测定如何运作的实例示于图2和图3中。已制备了两种抗体(抗-COMT和抗-NE)(其中一种为独特的(抗-NE))和两种蛋白(COMT和COMT-NE)(其中一种为独特的(COMT-NE))。使用COMT-NE的备选方式是使用COMT-表位-NE。用于洗涤和显色的各种化学物质以及带有缀合至抗体的酶的第三抗体(例如HRP缀合的抗-IgG)可购自许多供应商。它们为通常可获得的。测定的优选实施方案可使用塑料96孔板，其中用预定固定量的抗-COMT包被孔，所述抗-COMT结合至各个孔的底部。在8个孔中加入预定固定量的COMT和固定量的COMT-NE，使得可从这些孔得到的结果制定标准曲线。在剩余的孔中加入固定量的COMT-NE和未知COMT浓度的样品。标准COMT孔显现的颜色使剩余孔中COMT的未知浓度得以被测定。进行测定的步骤示于图2。显示的颜色强度与样品中的COMT蛋白浓度成反比(图3)。

在某些实施方案中，用于定性或定量检测样品中的儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)的方法包括：

a)提供带有预定量的抗-COMT抗体的包被表面；

b)使样品与包被表面接触，以使样品中可能存在的COMT结合至包被表面；

c)使预定量的可检测标记的标准重组COMT-NE缀合物(S-COMT-NE)与包被表面接触，以结合至包被表面；

d)使抗-NE抗体接触包被表面，其中当S-COMT-NE已预先结合至包被表面的抗-COMT抗体时，抗-NE抗体结合至S-COMT-NE上的NE表位；

e)使包被表面与酶标记抗体接触，其中当抗-NE抗体已预先结合至与抗-COMT抗体结合的S-COMT-NE时，酶标记抗体结合至抗-NE抗体；

f)使包被表面与指示结合至包被表面的酶标记抗体的存在情况的化学酶标记指示剂接触；以及

g)基于结合至包被表面的酶标记抗体的存在情况或量，确定样品中COMT的存在情况或样品中存在的COMT的量。

由于COMT蛋白水平可被COMT诱导物和抑制剂以及其它化合物例如异源雌激素、PCB和增塑剂改变(Ho等，2008a，b)，因此本发明可用于以快速且简单的方式测定这样的化合物的作用。

本发明的方法可使用用于定性或定量检测样品中COMT的诊断试剂盒进行。作为实例，试剂盒可包含COMT特异性结合剂(例如抗体)。试剂盒还可包含一种或多种其它组分，例如固相支持体(例如微量滴定多孔板)、标准品、测定稀释液、洗涤缓冲液、粘合盖板和/或使用试剂盒实施本发明方法的说明书(例如印刷资料或压印的)。在某些实施方案中，试剂盒包含抗-NE和/或COMT-NE以及抗-NE和/或COMT-NE的使用说明书。

本发明的试剂盒还可在一个或多个容器中包含用于本文所述方法的试剂。试剂盒可单独或组合地包含特定的内部对照和/或探针(probe)、缓冲液和/或赋形剂。每种试剂以适于存量储存的固体形式或液体缓冲液提供。试剂盒还可包含用于从例如宿主生物体或环境样品获得样品的工具。

本发明提供用于测定目标样品例如生物培养物、组织提取物、生物液体和环境样品中的COMT蛋白水平的简单、准确、廉价且快速的方法。目前测定人COMT浓度的方法包括繁琐的聚丙烯酰胺电泳/蛋白质印迹测定法和放射性酶学测定法。本新型ELISA测定法将代替这些复杂且耗时的现有方法。

实施例1：免疫肽(新型表位，NE)的设计和制备

1.产生随机的18-氨基酸肽序列，其在氨基末端以“酪氨酸(Tyr)”开始，并由以下所列10种亲水氨基酸组成：苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)、脯氨酸(Pro)。

2.使用可获得自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi？taxid＝9606的公众可用的程序(BLAST)进行基于计算机的搜索，以确保所产生的肽序列与任何人蛋白均不具有同源性(至少＜30％)。

3.使用可获得自http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_nn.html(Institut de Biologie et Chimie des Protéines，France)的计算机程序“HNN Secondary Structure Prediction Method(HNN二级结构预测法)”对肽可能的二级结构进行预测，以寻找具有最无序二级结构的肽(图4)。选择具有以下序列的18-聚体：″TKENPRSNQEESYDDNES″(SEQ ID NO：1)。

4.通过“Alta Bioscience，United Kingdom”合成并纯化具有设计序列的肽用于免疫以产生和纯化特异性抗体，并将该肽命名为NE(新型表位)。

5.将对应于NE的cDNA序列遗传地缀合至真核系统或细菌系统的蛋白表达载体中的目标人COMT基因中。

实施例2：COMT和NE抗体生产

i.免疫接种动物产生NE抗体

在动物(例如新西兰兔)中针对全长新型合成表位(NE)产生NE抗体。如(Kyte和Doolittle，1982)所述，利用蛋白的亲水性分析选择这些表位。使用多位点注射方案用该抗原多赖氨酸肽和弗氏佐剂注射动物。在初次免疫6周后从动物中取全血样品，并检验NE抗体的存在情况。以每月一次的间隔重复注射，直至产生假定的抗体。

ii.人COMT抗体的免疫接种和亲和纯化

如我们先前的出版物(Jiang等，2003)中所述，在动物(例如绵羊)中针对人COMT肽的线性表位产生COMT抗体。利用蛋白的亲水性图(Kyte和Doolittle，1982)选择对应于残基80-98(DTYCEQKEWAMNVGDKKGK)(SEQ ID NO：7)的寡肽，该寡肽为COMT的MB-同工型和S-同工型所共有。

1.使用多位点注射方案用在赖氨酸网(lysine web)上的该抗原肽和弗氏佐剂注射绵羊。

2.在初次免疫2个月后从绵羊中取全血样品，并在单向放射免疫-扩散测定中使用该线性抗原肽作为参比抗原检验COMT抗体的存在情况。以每月一次的间隔重复注射，直至产生抗体。

3.自动物中收集抗血清后，将其用pH 8.0、含25mM NaCl和0.02％NaN₃的20mM Tris-HCl透析过夜。于室温恒定搅拌下，将所产生的抗血清与抗原肽一起在受控孔玻璃珠(1ml)上保温1小时。

4.将珠粒与抗血清注入小色谱柱(5ml)中。在从珠粒中排出液体后，将柱用pH 5.3的磷酸缓冲盐溶液(100ml)洗脱，直至洗脱液中检测不到蛋白。

5.最后，将柱用10×1ml等分的0.1M pH 2.3的甘氨酸缓冲液洗脱。立即调节每毫升的洗脱液至pH 7，然后将具有最高蛋白浓度的流分合并。

iii.NE抗体的提取和纯化

1.在从动物中收集抗血清后，将其用pH 8.0、含25mM NaCl和0.02％NaN₃的20mM Tris-HCl透析过夜。将透析后的抗血清上样到DEAE柱中，每个柱的大小为血清体积的5倍。将DEAE柱用3倍床体积的20mM Tris-HCl，pH 8.0，25mM NaCl和0.02％NaN3洗涤。收集IgG峰(在280nm吸光度下从柱中出现的首个峰)。

2.于室温恒定搅拌下，将等分的兔IgG(10ml)与合成的抗原肽一起在受控孔玻璃珠(1ml)上保温1小时(hr)。

3.将珠粒和兔IgG 注入小柱(5ml)中。在从珠粒中排出所有液体后，将珠粒用pH 7.0的PBS(100ml)洗涤，直至洗脱液的UV吸光度(280nm)类似于PBS的。

4.最后，将柱用10×1ml等分的pH 2.5的0.1M甘氨酸洗脱。立即用1M Tris调节每个洗脱流分至pH 7.0。将含最高蛋白浓度的流分合并。

iv.NE抗体的表征

以两种方式实现抗体的表征。首先，在兔中产生抗体，因此该抗体最初与该动物在其寿命期间所产生的所有其它抗体一起存在于血清中。如上节所述，通过其与附着于控制孔玻璃珠的NE抗原结合的能力，将该抗体从该高度复杂的抗体混合物中纯化出来。这种至抗原的结合与彻底洗脱同时发生，彻底洗脱除去包括其它非NE抗体的其它血清蛋白。

其次，通过SDS-PAGE/蛋白质印迹法检验纯化的抗体。将纯化的抗-NE用作第一检测抗体，对来自两种类型的HEK293细胞的提取物进行SDS-PAGE/蛋白质印迹。第一种类型的HEK293细胞为普遍可获得的野生型。这些细胞容易表达COMT蛋白，其易被在SDS-PAGE/蛋白质印迹中用作第一抗体的抗-COMT抗体检测到(Jiang等，2003)。第二种类型的HEK293细胞已被遗传改造为表达COMT-NE蛋白。当将纯化的抗-NE用作第一检测抗体时，在蛋白质印迹上仅检测到COMT-NE蛋白，而检测不到存在于正常HEK293提取物中的COMT或任何其它蛋白(图5)。

NE抗体的特异性通过免疫吸附后对COMT和NE表位的交叉检测来评估。由连接至琼脂糖蛋白G的抗-COMT抗体结合的蛋白与抗-NE发生交叉反应，反之亦然。将来自过表达COMT-NE的HEK293细胞的总细胞裂解物与COMT抗体在4℃下保温过夜以形成免疫复合体，从而捕获内源性COMT和COMT-NE蛋白两者。来自无COMT-NE表达的野生型HEK293细胞的裂解物作为阴性对照平行进行。当该COMT-NE蛋白从琼脂糖蛋白G-抗-COMT解吸附后，在利用SDS-PAGE/蛋白质印迹对其进行分析时，该COMT-NE蛋白与抗-NE交叉反应(图6)。

最后，当将来自未用NE抗原免疫接种的兔的兔抗体用作SDS-PAGE/蛋白质印迹中的第一检测抗体时，使用正常HEK293提取物或遗传改造的HEK293提取物检测不到条带。

因此，当暴露于HEK293细胞提取物中存在的所有蛋白时，纯化的兔抗体仅检测COMT-NE，并且如上所述，只有来自用NE抗原免疫的兔的抗体才能检测改造为具有NE的COMT蛋白。

实施例3：人COMT-NE重组蛋白的制备

1 COMT是指全长的S-COMT和MB-COMT两者；

2 COMT-表位是指抗-COMT抗体所识别的19-氨基酸片段(SEQ ID NO：7)。

i.全长人COMT-NE的分子克隆

按照制造商的方案，使用专门为在人COMT的3’-端插入NE cDNA片段设计的引物对，通过一步RT-PCR(Titan One Tube RT-PCR Kit，Roche)由分离自人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞系(CRL-2266；美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)))的总RNA产生全长人COMT cDNA。

为产生用于定向克隆到表达质粒(pcDNA3.1(+)；Invitrogen或pGEX-6p1；GE Healthcare)中的BamHI-COMT-NE-EcoRI cDNA片段，通过二次PCR插入限制酶切位点(BamHI和EcoRI)，所述二次PCR使用用于含BamHI限制位点的人S-COMT的正向引物(5’-CGCGGATCCGCCACCATGGGTGACACCAAGGAGCAGCGC-3’)(SEQ ID  NO：2)或用于人MB-COMT的正向引物(5’-CGCGGATCCGCCACCATGCCGGAGGCCCCGCCTCTGC-3’)(SEQ ID NO：3)以及含NE序列和EcoRI限制位点的反向引物(5’-CTGGAATTCTCAGCTTTCGTTATCATCATAGCTTTCTTCCTGGTTGCTACGCGGGTTTTCTTTGGTGGGCCCTGCTTCGCTGCCTGGGC-3’)(SEQ ID NO：4)。

将COMT DNA插入物(BamHI-COMT-NE-EcoRI)和空载体(pcDNA3.1(+)或pGEX-6p1)分别通过过量限制酶(BamHI和EcoRI)于37℃下消化1hr。在这之后，将消化的混合物通过1.3％琼脂糖凝胶电泳在100V下持续1hr进行分析。将对应于COMT-NE的所得片段切下并纯化(Gel Extraction Kit，Viogene)，然后使用T4DNA连接酶连接至pcDNA3.1(+)或pGEX-6p1载体。在4℃下保温过夜进行连接反应。

ii.COMT-表位-NE的分子克隆

通过PCR从人COMT cDNA产生用于定向克隆到表达质粒(pGEX-6p1；GE Healthcare)中的COMT-表位-NE插入物(BamHI-COMT-表位-NE-EcoRI)，所述人COMT cDNA来自从人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞系分离的总RNA。通过二次PCR插入限制酶切位点(BamHI和EcoRI)，所述二次PCR使用用于含BamHI限制位点的COMT-表位的正向引物(5’-CGCGGATCCAGCGTGCTGGAGGCCATTGAC-3’)(SEQ ID NO：5)和含NE序列和EcoRI限制位点的反向引物(5’-CTGGAATTCTCAGCTTTCGTTATCATCATAGCTTTCTTCCTGGTTGCTACGCGGGTTTTCTTTGGTAATCACGGCGTCCACGATCTTGCC-3’)(SEQ ID NO：6)。COMT-表位对应于人COMT残基80-98(DTYCEQKEWAMNVGDKKGK)(SEQ ID NO：7)，其为MB-同工型和S-同工型所共有。理想的是，使用NE-表位-“TKENPRSNQEESYDDNES”(SEQ ID NO：1)，但任选的是，可使用变体，只要抗-NE-表位仍结合变体即可。这样的变体可通过本领域熟知的方法产生，并且特征在于具有保守氨基酸取代，其不会特异地改变18-聚体的抗原特性。例如，在蛋白和肽中不常见或从未出现的氨基酸以及合成氨基酸可取代NE-表位的氨基酸，只要具有取代氨基酸的NE-表位基本上仍保留与氨基酸未被取代的NE-表位相同的抗原特性即可。在蛋白和肽中不常见或从未出现的氨基酸以及合成氨基酸的实例通常包括但不限于鸟氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸、高丝氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘化酪氨酸、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、正亮氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、τ-丁基甘氨酸、τ-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计氨基酸(designer amino acid)(例如β-甲基氨基酸、C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸)以及氨基酸类似物。在蛋白和肽中不常见或从未出现的氨基酸以及合成氨基酸还包括具有衍生侧基的氨基酸。此外，蛋白中的任何氨基酸可为D(右旋)型或L(左旋)型。本发明NE-表位的蛋白序列的等位变体也包括在本发明范围之内。

氨基酸通常可分成以下类别：非极性、不带电荷的极性、碱性和酸性。其中本发明NE-表位的某一类别的氨基酸被相同类别的另一种氨基酸置换的保守取代落入本发明的范围内，只要具有取代的NE-表位基本上仍保留与不具有取代的NE-表位相同的抗原特性(例如结合至抗-NE-表位)即可。在本发明范围之内考虑编码在序列中具有一个或多个氨基酸取代的NE-表位的分离多核苷酸。在一个实施方案中，编码NE-表位变体的分离的多核苷酸包括以下核酸序列：其能在严格条件下与编码NE-表位的核酸序列杂交，并且编码与针对NE-表位的抗体结合的NE-表位变体。

下表1提供属于各个类别的氨基酸实例的列表。

与多肽“NE-表位”或编码NE-表位的多核苷酸具有基本同一性或同源性的变体可用于本发明的实施。这样的序列可称为变体或修饰序列。换言之，多核苷酸序列可经修饰但仍保留编码表现出所需抗原特性(例如与抗NE抗体结合的能力)的多肽的能力。因此，这样的变体为功能等价体。一般而言，变体包含与天然序列至少约60％-80％、优选约80％-90％、更优选约90％-95％的序列同一性。任选的是，变体可通过在氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的取代、缺失或插入衍生自NE-表位。设计了具有含以下序列的修饰NE序列的三种新型肽变体：“TKENPRTNQEESYDDNES”(SEQ ID NO：8)、“TKENPRSNQDESYDDNES”(SEQ ID NO：9)和“TKENPRSNQPPSYDDNES”(SEQ ID NO：10)。作为实例检测了这三种修饰NE序列(SEQ ID NO：8-10)针对NE-抗体的免疫反应性。

两种或更多种核酸或多核苷酸之间的序列关系通常定义为序列同一性、序列同一性百分比和基本同一性。在测定序列同一性中，“参比序列”用作序列比较的基础。参比可为特定序列的亚类或全部。换言之，参比序列可为全长基因序列或基因序列片段。

用于比较的序列比对方法为本领域所熟知。参见例如Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482；Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444；PC/Gene Program中的CLUSTAL，Intelligenetics，Mountain View，California；威斯康辛遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA。优选的计算机比对方法还包括BLASTP、BLASTN和BLASTX算法。参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。

关于核酸或多肽序列的“序列同一性”或“同一性”是指当在特定比较窗(comparison window)内比对最大一致性时两条序列中相同的核酸碱基或残基。“序列同一性百分比”是指通过在比较窗内比较两条最佳比对的序列所确定的值，其中当与参比窗(reference window)比较时，多核苷酸序列在比较窗内的部分可包含用于两条序列的最佳比对的插入或缺失。百分比通过如下方法计算：确定在两条序列中都存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗内位置总数，然后将结果乘以100得到序列同一性百分比。

具有“基本同一性”的多核苷酸序列为使用上述比对程序之一与参比序列进行比较，具有至少约50％-60％的序列同一性、通常至少70％的序列同一性、优选至少80％、更优选至少90％以及最优选95％的序列。优选的是，使用程序确定的默认参数测定序列同一性。氨基酸序列的基本同一性通常意指至少60％、更优选至少70％、至少80％、至少90％以及最优选至少95％的序列同一性。

如果两个分子在严格条件下相互杂交，则核苷酸序列通常具有基本同一性。一般而言，严格条件选为在限定离子强度和pH下比特定序列的热熔点低约5℃。如果它们编码的多肽具有基本同一性，则在严格条件下不相互杂交的核酸分子仍可能具有基本同一性。这可在例如利用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时出现。

如所述，序列的杂交可在严格条件下进行。“严格条件”意指以下条件，在该条件下，与杂交至其它序列相比，探针以更高的可检测程度杂交至其靶序列。严格条件为序列依赖性的，并且在不同情形下不同。通常，严格条件为以下条件：其中盐浓度在pH 7.0-8.3条件下低于约1.5M Na离子，通常约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(例如10-50个核苷酸)为至少约30℃，而对于长探针(例如大于50个核苷酸)为至少约60℃。还可加入去稳定剂例如甲酰胺达到严格条件。例示性的严格条件包括在37℃下的30-35％甲酰胺，1.0M NaCl，1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液中杂交，并在50-55℃下于1X-2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。公认的是，可改变温度、盐和洗涤条件以提高或降低严格条件。对于杂交后洗涤，重要的因素包括最终洗液的离子强度和温度。参见Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284。

实施例4：重组质粒的转化

将来自连接反应的重组产物转化进化学感受态大肠杆菌细胞(BL21)中。详细步骤如下：

1.将储藏在-70℃冰箱中的感受态细胞(100μl)置于冰上5分钟。

2.将等分的连接溶液(2-5μl)加至感受态细胞(100μl)，并将全部混合物轻轻地涡旋数次，然后储存在冰上30分钟。然后将管转移至放置在预热至42℃的循环水浴中的支架上，并静置45秒。注意不要晃动管。

3.将管迅速转移至冰浴并冷却2分钟。将SOC培养基(500μl)加入每只管。将管转移至振荡培养箱(225rpm/min)，并在37℃下温育1hr，以使细菌恢复并表达由质粒编码的抗生素抗性标记。

4.将适当体积(每个90-mm平板最多250μl)的转化感受态细胞转移到含氨苄西林(50μg/ml)的LB琼脂上，通过无菌弯玻璃棒涂布在琼脂平板的表面上。

5.倒置平板并在37℃下温育。菌落出现于12-18hr内。

实施例5：含重组质粒的细菌菌落的鉴定

挑出至少10个单独菌落，然后用Mini-prep纯化试剂盒(Qiagen^TM)提取质粒DNA。用BamHI和EcoRI消化质粒，并在1.3％琼脂糖凝胶中于100V下45分钟使之显现。通过测序验证含正确COMT-NE或COMT-表位-NE插入物的所得质粒DNA。

实施例6：重组人COMT-NE的细菌表达

为了在大肠杆菌(BL21)中表达重组人COMT-NE蛋白，将阳性克隆培养于补加氨苄西林(50μg/ml)的LB肉汤中，并于37℃剧烈振荡条件下培养，直至细菌培养物的光密度读数达约0.6(在λ＝600nm下)。将培养物用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(终浓度为0.1-1mM)诱导，并再培养4hr。通过离心收集细胞，然后在补加5mM 1，4-二硫苏糖醇(DTT)和1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的冰冷裂解缓冲液(50mM Tris-Cl，pH7.5，200mM NaCl)中超声处理。使来自细菌裂解物的表达COMT-NE或COMT-表位-NE重组蛋白流过市售谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-纯化柱(GSTrap^TM FF，GE Healthcare)来纯化。在考马斯蓝染色后，靶蛋白带在SDS-PAGE中显现，然后通过蛋白质印迹表征(图7和8)。

实施例7：抗-NE抗体对修饰NE-表位的非特异性结合亲和力的测定

与多肽“NE-表位”或编码NE-表位的多核苷酸具有基本同源性的变体可用于本发明的实施中。也就是说，多核苷酸序列可经修饰但仍保留编码表现出结合至NE-抗体的所需抗原特性的多肽的能力。作为实例通过斑点印迹法检验了三种修饰NE序列(SEQ ID NO：8-10)针对NE-抗体的免疫反应性。

进行斑点印迹试验的步骤如下所述，结果示于图9。

1.由商业公司(Alta Bioscience，Birmingham UK)合成和纯化包含修饰NE序列的肽。

2.将10ng每种肽溶解于PBS中，然后使用尖嘴移液管尖端点到硝酸纤维素膜上。将膜风干。

3.将膜用含5％BSA的TBS-T封闭1hr，然后与在BSA/TBS-T中稀释的抗-NE抗体一起在室温下保温2hr。

4.在保温之后，将膜用TBS-T洗涤三次，然后与缀合了HRP的第二抗体(抗-兔；DAKO)一起在室温下保温1hr。

5.将膜用TBS-T洗涤三次，然后与ECL试剂一起保温1分钟。

6.在暗室内将膜暴露于X射线胶片，并比较来自不同样品的信号。信号的强度与各种肽针对抗-NE抗体的结合亲和力水平成比例。

根据图9所示结果，NE肽显示出针对抗-NE抗体的强结合亲和力。三种修饰NE肽之一(SEQ ID NO.8)显示出与NE抗体的结合(但具有比NE低的亲和力)，但另外两种肽(SEQ ID NO.9、10)并不保留针对NE抗体的显著免疫反应性(图9)。

实施例8：COMT酶免疫测定(EIA)系统的构建

制备了两种独特抗体(抗-COMT和抗-NE)、两种蛋白(COMT和COMT-NE)和人工构建的肽“COMT-表位-NE”。新合成的表位(NE)由具有以下序列的18个氨基酸组成：“TKENPRSNQEESYDDNES”(SEQ ID NO：1)，并用作检测靶蛋白的标记。

如上文实施例2所述，产生并亲和纯化COMT抗体。

用于洗涤和显色的各种化学药品以及在抗体上缀合有酶的第三抗体(抗-抗-NE或抗兔IgG抗体)购自许多供应商。它们为通常可得到的。

测定要求用预定固定量的抗-COMT包被含96孔的塑料板中的孔，所述抗-COMT结合至各个孔的底部。

在8个孔中加入预定固定量的COMT和固定量的COMT-NE，以便可从这些孔的所得结果产生标准曲线。在剩余孔中加入固定量的COMT-NE和未知COMT浓度的样品。标准COMT孔所显现的颜色使剩余孔中COMT的未知浓度得以被测定。

进行COMT ELISA测定实施方案的步骤如下所述，并示于图2中。

1.在4℃下，将透明的96-孔塑料板用0.1μg COMT抗体包被过夜。

2.在室温下，将板用1％BSA预封闭1hr。

3.将不同浓度的重组COMT-NE标准品与固定量的裂解物样品混合，然后加至各个孔中，并在室温下保温2hr。

4.在用含0.1％Tween-20的PBS洗涤之后，将板与抗-NE在室温下保温2hr。

5.将板再次洗涤，然后与第二抗体(抗-兔；DAKO)在室温下保温1hr。

6.用H₂O₂以1∶1比例制备TMB底物(TMB底物；Pierce，#34021)用于比色形成，并在黑暗中于室温下保温15分钟。

7.通过加入少量2M H₂SO₄至各个孔中停止显色反应。

8.用分光光度计在450nm测量吸光度。显现的颜色强度与COMT浓度成反比。(图3)

实施例9：COMT酶免疫测定(EIA)试剂盒的应用

试验原理

COMT EIA Kit(COMT酶免疫测定试剂盒)为基于竞争性结合原理的固相酶联免疫吸附测定(ELISA)。将微量滴定孔用针对COMT分子上的抗原位点的多克隆抗体包被。样品中的内源COMT蛋白与标准重组COMT-NE缀合物竞争结合至包被抗体。在保温后，将未结合的COMT-NE蛋白洗掉。将抗-NE连接至结合的标准重组COMT-NE，并将过量的抗-NE洗掉，然后将与产色酶(在这种情况下为辣根过氧化物酶)缀合的抗-兔IgG连接至结合的抗-NE，并将过量的洗掉，然后通过加入产色酶的合适底物显色。结合的产色(colorogenic)缀合物(在该情况下为与辣根过氧化物酶缀合的驴抗-兔IgG)的量与样品中COMT的浓度成反比。在加入底物溶液后，显色强度与样品中COMT的浓度成反比。

然而，应理解的是，上文描述仅为阐述性的，并且可对试剂作出各种修改或改变而不会改变测定的基本原理。本文所提供的ELISA法，每一种包括多个步骤，而上文是对进行那些步骤所用普通方法的描述。然而，该描述不应理解为限制本发明，因为可对本发明方法作出微小调整和/或改变而不会背离本文公开的本发明范围。尤其应该注意的是，本发明应理解为包括以下情形：本领域的技术人员可使用与本文公开的不同但等效的底物类型、动物抗体类型、酶标记、酶标记指示剂、包被溶液、封闭液和洗液。例如，应注意的是，产生本文所用三种抗体的物种并不是关键的。测定的原理依赖于三种抗体不会交叉反应的事实。这最容易通过使用三种不同的物种实现(本情形中为绵羊、兔和驴)。同样可使用在其它物种中产生的针对三种抗原(COMT、NE和抗NE免疫球蛋白)的抗体。还应注意的是，产色酶和底物可由其它这样的酶和底物代替。此外，应注意的是，用于检测结合至捕获COMT-NE的抗-NE的量的其它系统可代替本文所述的显色系统(例如使用荧光或冷光)。还应注意的是，产色酶或用于检测结合至捕获COMT-NE的抗-NE的量的其它检测系统可直接缀合至抗-NE。

材料：

1.样品蛋白(MCF-7细胞)

2.竞争品(S-COMT-NE，1mg/ml)

3.标准品(S-COMT-FLAG，1mg/ml)

4.检测抗体(兔抗-NE抗体)

5.绵羊抗-兔IgG-HRP

6.TMB底物和终止液

7.样品稀释液

8.洗液

9.96-孔板

样品提取步骤：

MCF-7(HTB-22)细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，该细胞几乎只表达S-COMT。在含10％热灭活的胎牛血清、抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)和1μg/ml胰岛素的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中于潮湿的5％CO₂ 37℃下，使细胞生长。通过暴露于胰蛋白酶使细胞(0.5ml；含约1×10⁶个细胞)脱离培养皿、板或孔的表面，接着加入新鲜培养基(0.8ml)。然后将细胞悬液转移至1.5ml离心管中。将管以1,300r.p.m.的速度离心5分钟，然后弃掉上清液。重悬细胞沉淀物并用0.5ml PBS洗涤，然后以1,300r.p.m.的速度再次离心5分钟。弃掉上清液，然后加入冰冷的双蒸水(0.2ml)以重悬细胞沉淀物。将细胞悬液在冰上超声处理10秒。将裂解物于4℃以14,000r.p.m.的速度离心15分钟。将上清液转移至新的1.5ml离心管中以测定总蛋白浓度，然后储存于-70℃备用。

试验步骤：

优选每一轮包括标准曲线。确定架上抗体包被的微量滴定孔的所需数量。通过将200μl含1％BSA的PBS加至各个孔中来封闭板，然后在室温下保温1hr。用样品稀释液稀释竞争品(S-COMT-NE)以得到10μg/ml浓度。如表2所概括，制备标准反应混合物(竞争品+标准品)的系列稀释液(用新的一次性尖端将每种100μl加入合适的孔中)。

将样品稀释液中的蛋白样品(例如MCF-7总裂解物)稀释，然后以50-200μg总蛋白/孔(100μl)的浓度加至各个合适的孔中。在将标准品和样品(每种100μl)上样至合适的孔中后，将板在室温下保温2hr。在保温后，将孔中的内含物轻快地抖掉，然后将孔用稀释的洗液(每孔200μl)漂洗5次。将孔剧烈地敲在吸水纸上以除去残余小液滴。加入100μl/孔的检测抗体(兔抗-NE)，并在室温保温1hr。将孔中的内含物抖掉并彻底洗涤5次。然后，将100μl/孔的抗-兔IgG-HRP加至各个孔中，并在室温下保温1hr。再次将孔中的内含物抖掉并彻底洗涤5次。为了显色，通过混合等体积的TMB底物将100μl的底物溶液加至各个孔中，并在室温下保温15至30分钟或直至预期颜色显现。通过加入100μl的终止液至各个孔中终止酶促反应。在加入终止液后的10分钟内，用微量滴定板读数器记录在450±10nm的光密度(OD)。

绘制校正曲线：

通过将对数标度上的标准品(S-COMT-FLAG)浓度相对每个校准品线性标度上的OD₄₅₀作图而得到校正曲线。可使用有效的统计学软件制作最佳拟合数据的标准曲线。(图11)

样品分析：

用实验样品代替COMT标准品，但确保总样品体积与用于产生标准曲线的相等。根据标准曲线计算实验样品中COMT的量。下表3列出根据COMT EIA试剂盒4个蛋白样品每个的计算COMT浓度，以微克(μg)COMT/毫克(mg)总细胞蛋白为单位。

结论：

每孔50-200μg之间的蛋白样品(MCF-7细胞裂解物)产生的OD读数在标准曲线的动态范围之内。蛋白样品中的COMT浓度可根据按照标准曲线所产生的公式得到。COMT水平表示为微克(μg)COMT/毫克(mg)总细胞蛋白。

因此，使用人细胞培养系统和本文所述的COMT测定法可形成用于雌激素模拟物的有效筛选系统，雌激素模拟物具有广泛的人类健康危害和环境危害。COMT竞争性ELISA测定法的实例示于图10中。简而言之，将人MCF-7细胞用17β-雌二醇处理48hr。收集总细胞裂解物，然后通过COMT竞争性ELISA测定法测定COMT蛋白表达水平。结果显示，在暴露于17β-雌二醇后，MCF-7细胞中的COMT蛋白水平与未处理的对照相比降低了。在该测定中，将来自过表达COMT-NE的HEK293细胞的裂解物用作阳性对照，其与对照相比，显示出COMT蛋白水平增加。

本文所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物都通过引用而以它们的整体(包括所有图和表格)结合到本文中，其程度直到它们与本说明书的明确描述不一致。

应理解的是，本文所述实施例和实施方案仅为阐述性目的，根据其作出的各种修改或改变将提示本领域技术人员，且都包含在本申请的精神和范围之内。

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