利用组织封固剂转移石蜡切片、冰冻切片的方法

摘要

一种利用组织封固剂转移石蜡切片、冰冻切片的方法，包括：①将石蜡、冰冻切片在二甲苯中浸泡去除盖玻片；②滴加封固剂覆盖切片上需要转移的组织，55～60℃加热12～24小时使其硬化，然后将切片浸入55℃中温水中30分钟，使封固剂软化；③将封固片从载玻片上分离，将需转移的组织片剪下并移至新的载玻片上；④将新的切片放入55℃温箱中加温，使组织片牢牢贴附于新的载玻片上。采用本发明的方法，可以成功地转移保存期最长至5年的石蜡切片和1年的冰冻切片，转移后的切片既可用于做蛋白质水平的工作又可以做mRNA分子水平的工作。与现有技术相比，样品的保存期限延长了很多。并且该方法简便易行，对仪器设备要求不高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种石蜡或冰冻切片的转移方法，尤其是利用组织固封剂转移石蜡切片或冰冻切片中封存的病理组织的方法。

背景技术

近年来细胞、分子生物学技术飞速发展，为了使分子生物学的技术应用于回顾性诊断治疗、分子marker的预测以及指导今后的基因治疗、个体治疗。同时由于临床病理和科研中标本存在如下可能情况导致组织标本短缺，比如临床穿刺活检的组织体积小，石蜡和冰冻组织块切几次组织就所剩无几；临床诊断有误或多年后疾病进展再次入院，需做进一步的病理诊断、后续治疗时，石蜡包埋组织块和冰冻组织块已不存在或丢失；另外科研检验中经过大量筛选建立的稳定模型使用完毕，再建模型已不可能时，所以鉴于以上因素，临床和科研中迫切需要一种方法，将仅存1、2张H&E染色后的石蜡切片转移到新的载玻片上，以进行进一步的免疫组化(蛋白检测)和原位杂交(mRNA检测)等病理诊断和检验研究。

发明内容

本申请的发明人在研究中发现：组织封固剂(Mount-Quick mountingmedium)具有转移石蜡切片、冰冻切片至新载玻片上的功效，本发明的目的之一即在于提供一种利用组织封固剂转移石蜡切片、冰冻切片的方法。所述方法包括如下步骤：

①将待处理的石蜡、冰冻切片在二甲苯中浸泡15～30分钟，去除盖玻片；

②滴加封固剂覆盖切片上需要转移的组织，55～60℃加热12～24小时使其硬化，然后将切片浸入55℃中温水中30分钟，使封固剂软化；

③将封固片从载玻片上分离，将需转移的组织片剪下并移至新的载玻片上；

④将新的切片放入55℃温箱中加温，使组织片牢牢贴附于新的载玻片上。

上述本发明的方法中，所述步骤②使用的固封剂是mount medium(日本)。

采用本发明所述的上述方法，可以成功地转移保存期最长至5年的石蜡切片和1年的冰冻切片，转移后的切片既可用于做蛋白质水平的工作又可以做mRNA分子水平的工作。与参考文献中相关技术相比，样品的保存期限延长了很多(Omar Hameed等，Am J Clin Pathol 2005；124：708-715)。并且该方法简便易行，对仪器设备要求不高，在普通条件的实验室中操作即可完成。

附图说明

本发明附图7幅，其中：

图1是存储1年的小鼠肾脏石蜡切片转移前后照片；

图2是存储1年的小鼠肾脏石蜡转移切片的免疫组化检验结果图，其中，图2(A)：×100，图2(B)：×400，图中棕色为肾小管上皮stmn1的表达，蓝色为负染的细胞核；

图3是存储1年的小鼠肾脏冰冻转移切片的免疫组化检验结果图，其中，图3(A)：×200，图3(B)：×400，图中棕色为肾小管上皮stmn1的表达，蓝色为负染的细胞核；

图4是存储1年的小鼠肾脏石蜡转移切片的原位杂交检验结果图，其中，图4(A)：×400，图4(B)：×1000，图中箭头所指示蓝紫色为nephrin的mRNA探针与肾小球足细胞中核酸的原位杂交，红色为核固红负染的细胞核；

图5是存储1年的小鼠肾脏冰冻转移切片的原位杂交检验结果图，其中，图5(A)：×200，图5(B)：×4000，图中箭头所指示蓝紫色为nephrin的mRNA探针与肾小球足细胞中核酸的原位杂交，红色为核固红负染的细胞核；

图6是存储3年的人卵巢癌石蜡转移切片的原位杂交和免疫组化结果图，其中：

图6(A)：×400，图中箭头所指示的蓝紫色显示人卵巢癌上皮中ERCC2核酸与mRNA探针的杂交；

图6(B)：×200，图中箭头所指示的棕色显示人卵巢癌上皮ERCC2的蛋白表达

图7是存储5年的小鼠胚胎肾石蜡转移切片的原位杂交和免疫组化结果图，其中：

图7(A)：×1000，图中箭头所指示的蓝紫色显示胚胎小鼠肾小球足细胞中的nephrin核酸与mRNA探针的杂交；

图7(B)：×400，图中箭头所指示的棕色显示胚胎小鼠肾小管上皮stmn1的蛋白表达。

具体实施方式

下面的实施例对本发明的内容作进一步说明，但不以任何形式限制本发明。如无特殊说明，实施例中所采用的仪器及试剂包括：

电热恒温箱(DHP-9052，上海一恒科技)；

微波炉(格兰仕、WD750CTL23-6)；

ECLIPSE 80i显微镜(日本，Nikon)

封固剂(Multi Mount 480)(日本松浪硝子株式会社，Lot No：9N17)

nephrin探针(Exiqon公司合成)；ERCC2探针(Exiqon公司合成)

stmn1抗体(Bioworld，Cat No：BS3615)；ERCC2抗体(ProteinTech，CatNo：10818-1-AP)

SP-9001试剂盒(中杉金桥)；anti-DIG-Fab-AP(Roche，Cat No：11376621)

DAB(中杉金桥，ZLI-9032)，BCIP(Ameresco，Cat No：0885)NBT(Ameresco，Cat No：0329)

实施例1

利用本发明所述的方法分别转移石蜡/冰冻切片：

样品1：存储1年的小鼠肾脏石蜡切片；

样品2：存储1年的小鼠肾脏冰冻切片；

样品3：存储3年的人卵巢癌石蜡切片；

样品4：存储5年的小鼠胚胎肾石蜡切片。

具体按照如下步骤操作：

①去除盖玻片：石蜡、冰冻切片在二甲苯中浸泡15～30分钟，以去除盖玻片；

②使用mounting medium封固组织切片：滴加封固剂覆盖切片上需要转移的组织，封固剂能够盖住组织即可，然后将切片于55～60℃温箱中加热过夜，使其硬化，第二天切片再垂直浸入55℃温水中30分钟，使封固剂软化；

③分离切片上的组织：用手术刀片揭起软化后封固剂一角，在温水中慢慢从载玻片上分离组织，剪刀剪开需转移的组织片，再分别移至新的载玻片上；

④转移后组织贴附：再将新的切片放入55℃温箱中加温使组织片牢牢贴附于新的载玻片上。

附图1是存储1年的小鼠肾脏石蜡切片转移前后照片。

实施例2

存储期1年的小鼠肾脏石蜡/冰冻切片的转移切片的免疫组化检验

将实施例1中转移后的样品1、样品2的转移切片之一用于免疫组化检验，

①脱封固剂、水化经二甲苯浸泡脱去组织内外的封固剂，再使用下行梯度酒精水化组织；

②抗原修复：使用0.01M枸橼酸钠于微波炉的中高档加热修复；

③消除内源性过氧化物酶，3％过氧化氢30分钟；

④I抗(Stmn1)4℃孵育过夜；

⑤使用SP-9001试剂盒中II抗及辣根酶标记链霉卵白素工作液室温各孵育1小时；

⑥DAB显色，苏木精负染细胞核，上行梯度酒精脱水，透明封片，摄片观察。

其结果如图所示，图2是存储1年的小鼠肾脏石蜡转移切片(样品1)的免疫组化结果图，图3是存储1年的小鼠肾脏冰冻转移切片(样品2)的免疫组化结果图。由图示结果可见，免疫组化检验结果为阳性，证明该转移后的切片可用于蛋白质水平的研究。

实施例3

存储期1年的小鼠肾脏石蜡/冰冻切片的转移切片的原位杂交检验

将实施例1中转移后的样品1、样品2的另一转移切片用于原位杂交检验，

①转移后的切片脱封固剂、下行梯度酒精水化；

②30ug/ml protein K增加细胞膜通透性；

③4％多聚甲醛固定7分；

④预杂交55℃温箱中孵育1小时；

⑤含500ng/ml nephrin探针的杂交液于55℃温箱中杂交过夜；

⑥2×SSC等漂洗液彻底漂洗；

⑦anti-DIG-Fab-AP 1∶2000稀释后，室温孵育2小时；

⑧BCIP(3.51μl/ml)/NBT(4.5μl/ml)染色，室温过夜；

⑨核固红负染细胞核，上行梯度酒精脱水，透明封片，摄片观察。

其结果如图所示，图4是存储1年的小鼠肾脏石蜡转移切片(样品1)的原位杂交结果图，图5是存储1年的小鼠肾脏冰冻转移切片(样品2)的原位杂交结果图。结果显示原位杂交检验结果为阳性，证明该转移后的切片可用于mRNA分子水平的研究。

实施例4

存储期3年的人卵巢癌石蜡转移切片的原位杂交检验和免疫组化检验

将实施例1中转移后的样品3的转移切片分别用于原位杂交检验和免疫组化检验，检验方法参照实施例2和实施例3的方法操作，实验结果如图6所示。结果显示原位杂交检验及免疫组化检验结果均为为阳性，转移后的切片可用于mRNA分子水平和蛋白质水平的研究。从而说明本发明的方法适用于存储期3年的病理样本的处理。

实施例5

存储期5年的小鼠胚胎肾石蜡转移切片的原位杂交检验和免疫组化检验

将实施例1中转移后的样品4的转移切片分别用于原位杂交检验和免疫组化检验，检验方法参照实施例2和实施例3的方法操作，实验结果如图7所示。结果显示原位杂交检验及免疫组化检验结果均为为阳性，转移后的切片可用于mRNA分子水平和蛋白质水平的研究。从而说明本发明的方法适用于存储期达5年的病理样本的处理。