用人工转录因子诱导产生多能干细胞

摘要

本发明涉及人工因子及其在将体细胞重编程为诱导多能干细胞和其他细胞谱系中的用途。具体而言，本申请涉及含有细胞全能性相关的基因编码的蛋白和转录调控结构域的融合蛋白、其编码序列、表达载体及其组合物。本申请还涉及将体细胞重编程为诱导多能干细胞和其他细胞谱系的方法，及含有所述融合蛋白、编码序列的细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及多能干细胞领域。具体而言，本发明涉及使用人工因子将体细胞重编程为多能干细胞或其他类型的细胞。

背景技术

胚胎干细胞来源于囊胚期胚胎的内细胞团，能够进行自我更新并保持全能性(Evans and Kaufman，1981；Martin，1981)。1998年Thomson成功建立和培养了多能性人胚胎干细胞系(Thomson et al.，1998)，随后大量研究证明了用Thomson的方法建立的人胚胎干细胞在体外可无限自我更新，同时又可分化成人体几乎所有组织类型的细胞。可在体外培养干细胞，并将它们定向诱导分化为所需的各种组织细胞，随后通过各种手段将这些分化细胞导入疾病模型动物体内，结果发现它们可以在很大程度上改善动物的病状，因此干细胞移植治疗应运而生。

胚胎干细胞不但可以为细胞移植治疗提供几乎是无限的细胞来源，同时也为提供几乎所有器官所需的细胞类型提供了可能性，这为组织工程和再生医学描绘了一个美好的前景(Daley and Scadden，2008)。但是人类胚胎干细胞尤其是病人特异的干细胞的来源成为了困扰科学界的一个难题，很多研究者把关注的目光放在了来源丰富的体细胞上，希望能够使已经分化的体细胞通过重编程(reprogramming)重新获得类似于胚胎干细胞的多能性(pluripotency)(Jaenisch and Young，2008；Yamanaka，2007)。

2006年前已经有三种方法能够使体细胞发生重编程：通过核移植的重编程、与ES细胞融合后的重编程和长期培养中自发的重编程。

从1952年首例核移植的成功(Briggs and King，1952)到1997年克隆羊Dolly的诞生(Wilmut et al.，1997)，体细胞克隆技术已经逐渐成熟，随后体细胞克隆在不同的物种和体细胞类型中都取得了成功(Gurdon and Byrne，2003)。通过核移植而产生的干细胞能够很好的解决细胞移植治疗后的免疫排斥这一问题，但是核移植极低的效率、体细胞克隆动物的发育异常以及运用到人类疾病治疗所涉及到的人类卵子来源和人类胚胎使用的伦理争议等一系列问题都成为了治疗性体细胞克隆发展的瓶颈问题(Jaenisch and Young，2008；Yamanaka，2007)。

研究发现当淋巴细胞与干细胞进行融合后具有了多能性(Miller and Ruddle，1976；Tada et al.，2001)，将这些细胞注射到裸鼠中能够产生三个胚层的细胞。最近的研究发现与人类ES细胞融合也能够发生重编程(Cowan et al.，2005；Yuet al.，2006)。但是将ES细胞来源的染色体从重编程的细胞中移除是一项技术上的挑战(Jaenisch and Young，2008；Yamanaka，2007)。其他研究组也在进行利用ES细胞的提取物来使体细胞发生重编程的一些探索(Taranger et al.，2005)。

内细胞团细胞在体外培养后产生了胚胎干细胞(ES cells)，原始生殖细胞在体外培养的条件下能够产生具有多能性的胚胎生殖细胞(EC cells)(Matsui et al.，1992)。研究者认为其他类型的细胞在体外长期培养的条件下也有可能产生具有多能性的细胞。目前已经通过体外的长期培养从骨髓中产生了多能成体祖细胞(MAPCs)(Jiang et al.，2002)。从成年小鼠的育精囊中产生了多能成体生殖干细胞(maGS)(Guan et al.，2006)，这两种细胞通过囊胚注射都能够产生嵌合体小鼠，但这种方法是否适用于其他细胞类型还是未知。

以上的三种重编程方法都在某些方面存在着缺陷，因此各国的科学家都在积极地探索其他的重编程策略。2006年日本京都大学的Yamanaka研究组通过巧妙的实验策略，发现只要通过病毒感染的方式将4个转录因子Oct4、Sox2、Klf4和C-Myc转入小鼠的成纤维细胞后就可以使成纤维细胞具有类似于ES细胞的多能性，并将这种细胞称为“诱导多能干细胞”(induced pluripotent stem cells，iPS)(Takahashi and Yamanaka，2006)。但是这一方法的效率很低，约0.01％-0.1％。多年的

随后研究表明这种诱导多能干细胞能够在注射至囊胚后形成嵌合鼠，证明了这种细胞的多能性与胚胎干细胞的多能性十分地相似(Okita et al.，2007；Wernig et al.，2007)。2007年11月Yamanaka和Thomson实验室分别在Cell和Science上发表论文，宣布他们使用人类皮肤细胞各自独立地培育出了人类iPS细胞(Takahashi et al.，2007；Yu et al.，2007)。同年Jaenisch研究组利用iPS细胞技术在治疗老鼠的镰刀型细胞贫血症获得了进展，这是科学界利用iPS细胞技术进行医疗研究的首次尝试(Hanna et al.，2007)。通过导入几个简单的转录因子来使已分化的体细胞发生重编程恢复多能性这一革命性的技术突破提供了获得病人自身体细胞来源的多能性干细胞的体外培养途径，不但避免了自身免疫排斥问题，而且规避了伦理问题，为获得患者自身遗传背景的胚胎干细胞提出一条新途径，为再生医学的发展掀开了崭新的一页(Jaenisch and Young，2008；Yamanaka，2007)。

目前科学界关于iPS细胞的研究主要集中在两个方面，一个是iPS细胞技术的改进：

1)作为原癌基因的c-Myc对于产生iPS细胞已不再不可缺少的(Nakagawa et al.，2008；Wernig et al.，2008)，而且在其他类型细胞中Sox2，Klf4等都可省去或可用小分子化合物替代(Ichida et al.，2009b；Maherali and Hochedlinger，2009；Shi et al.，2008a；Shi et al.，2008b；Utikal et al.，2009a)，在神经前体细胞中甚至仅仅Oct4就能完成重编程(Kim et al.，2009)。

2)用于iPS细胞实验的体细胞来源从成纤维细胞扩展至其他细胞类型(Aoi et al.，2008；Haase et al.，2009；Lowry et al.，2008；Okabe et al.，2009)，从遗传改造过的体细胞发展为未经过遗传改造的体细胞(Meissner et al.，2007)。继人和小鼠的iPS细胞之后，还成功建立了大鼠，猴子和猪的iPS细胞(Esteban et al.，2009；Liao et al.，2009；Liu et al.，2008；Wu et al.，2009)。

3)已经发现多种大幅度提高iPS细胞效率的方法：抑制p53信号通路(Kawamura et al.，2009；Li et al.，2009；Marion et al.，2009；Utikal et al.，2009b)；全能性相关的microRNA(Judson et al.，2009)；TGFβ信号通路(Ichida et al.，2009a；Woltjen and Stanford，2009)；Wnt信号通路(Marson et al.，2008)；SMAD信号通路(Chambers et al.，2009)；MAPK信号通路(Silva et al.，2008)等等。

4)外源基因的转运系统也从依赖于病毒的体系发展到不需要病毒并且在基因组上无DNA插入痕迹的非病毒体系(Hotta et al.，2009；Kaji et al.，2009；Okita et al.，2008；Woltjen et al.，2009；Zhou et al.，2009)。

另一个则是iPS细胞重编程分子机制的研究。现在关于iPS细胞重编程分子机制的研究还处在探索时期，目前认为，上述四个分子可能通过以下机制在体细胞核中重新建立了多能性状态：首先，c-Myc的表达能够启动DNA复制，同时使得染色质结构变得松散；而疏松的染色质结构使得Oct4能够结合至其下游基因启动子的调控区域；与此同时，Sox2和Klf4也能够与Oct4共同作用，激活并形成建立多能性状态所需的转录因子网络；这些被激活的转录因子与Oct4、Sox2、Klf4共同作用，激活了表观遗传调控过程，最终使得多能性细胞的表观基因组状态得以建立。在iPS细胞中，Oct4和Nanog启动子区域原来的抑制性组蛋白修饰标记被活化性标记(如H3K4me和H4Ac)所代替，而DNA甲基化状态则发生了部分的抹去。这些结果提示：Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4的外源导入确实能够改变体细胞中的表观遗传状态，从而使多能性的表观基因组状态得以建立(Brambrink et al.，2008；Jaenisch and Young，2008；Maherali et al.，2007；Stadtfeld et al.，2008；Yamanaka，2007)。

iPS细胞多能性的维持主要依赖于内源性基因Oct-4和Nanog表达的激活，而病毒的LTR(long terminal repeat)由于在重编程过程中发生甲基化，外源基因随即沉默呈现低表达(Wernig et al.，2007)。利用可诱导表达的病毒系统研究发现，在病毒表达的4个因子持续表达10天后即使没有病毒来源的因子表达，形成的iPS细胞仍能够传递数代并保持生长特性和形态的稳定(Brambrink et al.，2008；Maherali et al.，2007)。这表明，病毒携带的基因对于iPS细胞多能性的形成只是启动作用，而多能性的维持主要依赖于内源性基因的表达。

iPS细胞与ES细胞具有类似的表观遗传修饰特性(DNA甲基化和组蛋白修饰)，如多能性相关基因(如Oct-4和Nanog)启动子区域的DNA低甲基化，耐受基因组的DNA去甲基化作用(Wernig et al.，2007)。另外，对雌性iPS细胞X染色体的分析发现：联合四个转录因子，就足以诱导激活已失活X染色体(X inactivation，Xi)，使调节Xi的三个非编码转录子复位并清除Xi的染色质修饰，DNA的甲基化被除去除，并在随后的iPS细胞分化过程中经历了X染色体的随机失活(Maherali et al.，2007)。

因此，仍需要一种将体细胞重编程为iPS细胞的方法，该方法能够高效地将体细胞重编程为iPS细胞。本发明满足了这种要求。

发明内容

本申请提供一种融合蛋白，该融合蛋白含有细胞全能性相关的基因编码的蛋白或其片段和转录调控结构域或其具有转录调控活性的片段。

在一具体实施例中，所述细胞全能性相关的基因选自OCT4、NANOG、SOX2、Tcl1、Tcf3、Rex1、Sal4、lefty1、Dppa2、Dppa4、Dppa5、Nr5a1、Nr5a2、Dax1、Esrrb、Utf1、Tbx3、Grb2、Tel1、Sox15、Gdf3、Ecat1、Ecat8、Fbxo15、eRas或Foxd3。

在一具体实施方式中，细胞全能性相关的基因选自OCT4、NANOG或SOX2。

在一具体实施方式中，所述细胞全能性相关的基因编码的蛋白选自Oct4第127-352位氨基酸序列或Oct4第1-286位氨基酸。

在一具体实施方式中，所述转录调控结构域选自病毒蛋白的转录调控结构域。

在一具体实施方式中，所述转录调控结构域选自病毒蛋白的VP16、EBNA2、E1A的转录调控结构域或其具有转录调控活性的片段，或者选自酵母的Gal4、Oaf1、Leu3、Rtg3、Pho4、Gln3、Gcn4、Gli3、Pip2、Pdr1、Pdr3、Lac9、Tea1的转录调控结构域或具有转录调控活性的片段，或者选自哺乳动物的p53、NFAT、Sp1(如Sp1a)、AP-2(如Ap-2a)、Sox2、NF-κB、MLL/ALL、E2A、CREB、ATF、FOS/JUN、HSF1、KLF2、NF-IL6、ESX、Oct1、Oct2、SMAD、CTF、HOX、Sox2、Sox4或Nanog的转录调控结构域或其具有转录调控活性的片段，或者选自植物HSF的转录调控结构域或其具有转录调控活性的片段。

在一具体实施例中，所述转录调控结构域选自病毒蛋白的VP16的转录调控结构域或其具有转录调控活性的片段，或者选自酵母的Gal4、Oaf1、Leu3、Rtg3、Pho4、Gln3或Gcn4的转录调控结构域或其具有转录调控活性的片段，或者选自哺乳动物的p53、NFAT、Sp1a、Ap-2a、Sox2、NF-κB或Nanog的转录调控结构域或其具有转录调控活性的片段。

在一具体实施例中，所述转录调控结构域选自：VP16第446-490位氨基酸序列、VP16第437-448位氨基酸序列、酵母Gal4第768-881位氨基酸序列、人NFκB第451-551位氨基酸、小鼠p53第8-32位氨基酸序列、人Sp1a第139-250位氨基酸序列、人Ap-2a第31-117位氨基酸序列、小鼠Sox2第121-319位氨基酸序列和小鼠Nanog第244-305位氨基酸序列。

在一具体实施例中，所述融合蛋白含有一个或多个相同或不同的转录调控结构域。

在一具体实施例中，所述融合蛋白选自：SEQ ID NO：74-76和92-106所示的氨基酸序列。

在一具体实施例中，所述病毒蛋白的转录调控结构域为单疱病毒编码蛋白VP16的转录调控结构域。

在一具体实施方式中，所述转录调控结构域选自酵母的转录调控结构域。

在一个具体实施例中，所述转录调控结构域选自酵母的Gal4、Oaf1、Leu3、Rtg3、Pho4、Gln3、Gcn4、Gli3，Pip2，Pdr1，Pdr3，Lac9，Tea1的转录调控结构域或其片段。

在一个具体实施例中，所述转录调控结构域选自酵母的Gal4、Oaf1、Leu3、Rtg3、Pho4、Gln3或Gcn4的转录调控结构域。

在一个具体实施例中，所述转录调控结构域选自哺乳动物的p53、NFAT、Sp1(如Sp1a)、AP-2(如Ap-2a)、Sox2、NF-κB、MLL/ALL、E2A、CREB、ATF、FOS/JUN、HSF1、KLF2、NF-IL6、ESX、Oct1、Oct2、SMAD、CTF、HOX、AP-2、Sox2、Sox4或Nanog的转录调控结构域或其片段。

在一个具体实施例中，所述转录调控结构域选自哺乳动物的p53、NFAT、Sp1a、Ap-2a、Sox2或NF-κB的转录调控结构域。

在具体实施方式中，所述转录调控结构域连接在所述细胞全能性相关基因编码蛋白的N端或者C端均能够高效地将体细胞重编程为iPS细胞。

在一具体实施方式中，细胞全能性相关的基因编码的蛋白和转录调控结构域通过多甘氨酸接头连接。

在一具体实施例中，所述接头选自：G(SGGGG)₂SGGGLGSTEF、RSTSGLGGGS(GGGGS)₂G、QLTSGLGGGS(GGGGS)₂G、QLTSGLGGGS(GGGGS)₂G、G(SGGGG)₂SGGGLGSTEF、和RSTSGLGGGS(GGGGS)₂G。

在一具体实施例中，所述串联序列是两个或三个VP16第446-490位氨基酸序列或VP16第437-448位氨基酸序列的串联序列。

本申请提供一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码本申请的融合蛋白。

在一具体实施方式中，所述融合蛋白如前文所述。

在一具体实施方式中，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：77-91。

本申请提供一种表达载体，该载体表达本申请的融合蛋白。

在一具体实施例中，该表达载体表达SEQ ID NO：74-76和92-106中任一所示的氨基酸序列。

在一具体实施例中，该表达载体含有本申请的核苷酸序列。

在一具体实施例中，该表达载体含有SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ IDNO：73或SEQ ID NO：77-91中的任一条核苷酸序列。

在一具体实施例中，该表达载体为慢病毒载体。

本申请提供一种组合物，该组合物含有本申请的融合蛋白、核苷酸序列和/或表达载体，和运载体或赋形剂。

在一具体实施方式中，所述组合物含有至少一种选自下组的融合蛋白：OCT4蛋白与单疱病毒编码蛋白VP16的转录调控结构域融合形成的融合蛋白、NANOG与单疱病毒编码蛋白VP16的转录调控结构域融合形成的融合蛋白、和SOX2蛋白与单疱病毒编码蛋白VP16的转录调控结构域融合形成的融合蛋白、以及Oct4与酵母Gal4或人NFκB或小鼠p53或人Sp1a或人Ap-2a或小鼠Sox2或小鼠Nanog的转录调控结构域融合形成的融合蛋白。

在一具体实施方式中，所述组合物还含有Klf4蛋白。

在一具体实施方式中，所述组合物含有SEQ ID NO：71、72、73或SEQ ID NO：77-91中任一所述的核苷酸序列和/或SEQ ID NO：74-76和92-106任一所述的氨基酸序列。

本申请提供一种将体细胞重编程为诱导的多能干细胞或具有不同功能的其它细胞谱系细胞的方法，该方法包括：

(1)用本发明所述的融合蛋白、核苷酸序列、表达载体或组合物处理体细胞，

(2)经过培养后筛选出具有多能干细胞理化特征的细胞或其它细胞谱系的细胞，从而获得多能干细胞或具有不同功能的其它细胞谱系的细胞。

所述其它细胞谱系的细胞包括心肌细胞、血液细胞(如血小板和免疫细胞)、神经细胞等。

在一具体实施例中，所述方法包括通过病毒感染、质粒转染、蛋白转导和/或mRNA转染将所述融合蛋白、核苷酸序列、表达载体和/或组合物导入体细胞中。

在一具体实施例中，使用附加体质粒实施所述方法，将体细胞重编程为诱导的多能干细胞。

本申请提供一种试剂盒，该试剂盒含有本申请的融合蛋白、核苷酸序列、表达载体或组合物。

本申请提供一种细胞，该细胞含有本申请的融合蛋白、表达载体和/或核苷酸序列。

在一个具体实施例中，该细胞不是人胚胎干细胞。

在一个具体实施例中，该细胞是诱导的多能干细胞。

在一具体实施例中，该细胞含有SEQ ID NO：71-106中任一所示的序列。

附图说明

图1显示人工因子提高重编程效率。a.被用于重编程MEF细胞的人工因子构建示意图。GL：多甘氨酸接头。Oct4、Sox2和Nanog分别与VP16激活结构域融合。b.逆转录病毒感染后15天时，产生的AP和Oct4-GFP阳性的iPS细胞克隆数目的比较。使用的不同逆转录病毒载体的组合如图所示。O：Oct4；S：Sox2；K：Klf4。标准差的计算是根据三次独立的实验结果。c.XYKZ因子诱导产生的iPS细胞的克隆形态。病毒感染后14天的克隆如图所示。刻度尺表示200μm。

图2显示人工因子诱导产生的小鼠iPS细胞的鉴定。a.Klf4和人工因子X、Y、Z诱导产生的iPS细胞具有典型的ES细胞形态。如图所示，iPS细胞均一地表达Oct4-GFP，而且呈AP染色阳性。刻度尺为200μm。b.iPS细胞的多能性标志基因SSEA-1和Nanog的免疫荧光染色呈阳性。刻度尺为200μm。c.RT-PCR检测iPS细胞的关键ES标志性基因的表达。GAPDH作为上样对照。d.定量RT-PCR检测6株iPS细胞株中病毒来源的Oct4、Nanog、Sox2和Klf4的转录表达水平，显示病毒来源的外源基因的表达被沉默。Actin作为上样对照，病毒感染4天后MEF细胞的相应基因的表达水平作为本底。e.iPS细胞、ES和MEF细胞中Oct3/4和Nanog基因启动子区域甲基化程度的亚硫酸盐测序比较。空心圆代表未甲基化的CpG，实心圆代表甲基化的CpG。iPS细胞与ES细胞一样，Oct4和Nanog基因启动子区域发生了去甲基化。

图3显示人工因子诱导产生的小鼠iPS细胞呈现多能性。a.iPS细胞、ES与MEF细胞全基因表达谱式的比较。证实iPS细胞与ES细胞比较接近。b.小鼠iPS细胞产生的的嵌合鼠及经生殖系传递的后代。iPS细胞株被显微注射到ICR小鼠的囊胚中产生嵌合鼠，再通过生殖系传给后代。iPS细胞的贡献导致产生的嵌合鼠及其后代的野生色和有色眼睛。c.四倍体胚胎补偿法产生的E13.5天的胚胎。iPS细胞被显微注射到ICR四倍体囊胚中产生嵌合囊胚，然后这种嵌合囊胚被移植到代孕母体内继续发育。d.XYKZ iPS细胞的生殖系贡献能力。iPS细胞被显微注射到ICR小鼠的囊胚中。E13.5天嵌合胚胎生殖脊的GFP信号代表iPS细胞已掺入生殖系。

图4显示人工因子提高人类iPS细胞产生的效率。a.5×10⁵个人类包皮成纤维细胞被含有人工因子的三因子(XYK)或四因子(XYKZ)慢病毒颗粒感染后所产生的iPS细胞克隆的数量，远高于用相应的天然因子所产生的克隆数。b.人工因子组合XYKZ诱导产生的人类iPS细胞的典型原位图。建系后克隆形态正常，且碱性磷酸酶AP检测呈阳性。刻度尺为200μm。c.人类iPS细胞OCT4、NANOG、SOX2、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81全能性标志基因的免疫荧光检测呈阳性。所有的刻度尺均为200μm。d.RT-PCR检测iPS细胞多能性标志基因的表达。e.用体外诱导分化的方法证实制成的人类iPS细胞具有多能性。分别针对三个胚层标记的抗体对分化的iPS细胞免疫组化染色呈阳性。刻度尺为100μm。DAPI(蓝色)染色细胞核。f.用体内鉴定方法验证制成的人类iPS细胞具有多能性。人类iPS细胞注入裸鼠皮下产生的畸胎瘤含有不同的、属于三个胚层的组织类型。g.人类iPS细胞具有正常的核型。

图5显示人工转录因子在MEF细胞中的表达。左边注明的是Western实验所用抗体。

图6显示病毒感染的MEF细胞全细胞群体中多能性基因重激活的动力学结果比较。RNA样品从图示的各样品中抽提出来后，利用半定量RT-PCR进行检测。表达GFP的病毒感染的MEF细胞作为阴性对照。人工因子的使用使内源Oct4等基因的激活提前，第6天就能明显地检测到表达。

图7显示病毒感染的MEF细胞全细胞的Oct4启动子区域DNA去甲基化的动力学结果比较。DNA样品从图示的各样品中抽提出来后，利用COBRA和亚硫酸盐测序方法检测。显示人工因子的使用能使MEF细胞中内源Oct4基因启动子更容易发生去甲基化。

图8显示MEF细胞重编程动力学和DNA去甲基化。a.FACS结果显示在包含三组重编程因子(OSKN，OSKN+p53sh和XYKZ)的病毒感染后第6，9和12天的MEF细胞中SSEA-1和Oct4-GFP重新激活的动态变化。用人工因子组合XYKZ时，SSEA-1和Oct4-GFP单阳性和双阳性的细胞数目在各个时间点都增加了。b.对从三组重编程因子感染的MEF中通过流式细胞技术分选得到细胞亚群Oct4启动子区域进行DNA甲基化分析。DNA样品从图示各时间点的各细胞亚群中制备并用COBRA分析。白色肩头所示条带反应了Oct4区域的去甲基化水平。最大规模的去甲基化发生在第12天的被XYKZ所感染的SSEA-1/GFP双阳性细胞中。

图9显示iPS细胞克隆出现数量的动力学结果比较。a.FACS结果显示MEF细胞被XYKZ病毒感染后第9天，出现更多的GFP阳性细胞(24.7％)。PE通道检测到的信号作为自发荧光对照。b.XYKZ感染后21天，更多的GFP阳性克隆产生。图中显示的是长在培养皿中的克隆的照片。c.OG2-MEF被DsRed与XYKZ或OSKN的逆转录病毒感染后2天通过FACS将DsRed阳性的MEF细胞分选至96孔板中(每孔一个细胞)，每种组合分选10块96孔板。分选后的第10天和20天对GFP+/DsRed-和GFP+/DsRed+的iPS克隆分别进行计数。GFP+反映了内源Oct4的激活，DsRed-则表示逆转录病毒载体的沉默。

图10显示外源表达的人工因子不影响内源p53，p21和p16的表达量。图中显示的是携带XYKZ因子的逆转录病毒感染MEF细胞后的Western分析结果。

图11显示使用一个人工因子Oct4-VP16就能产生具有多能性的iPS细胞。a.Oct4-VP16和Oct4-3×VP16诱导MEF细胞重编程的动力学曲线。MEF细胞被携带Oct4和Oct4融合蛋白基因的病毒分别感染后，从感染后第9天至第17天，每天对看到的GFP阳性的iPS克隆进行计数。三个VP16串联使人工因子的重编程能力进一步提高。b.Oct4-VP16诱导产生的iPS克隆和建立的iPS细胞系的形态正常。刻度尺为250μm。c.免疫荧光实验显示Oct4-VP16产生的iPS细胞表达全能性标志基因Oct4，Nanog和SSEA-1。刻度尺为100μm。d.定量PCR检测Oct4-VP16 iPS细胞中全能性基因的表达。MEF细胞中的表达量被设定为1。被检测的5个全能性基因的表达水平与ES细胞株R1接近。e.基因组PCR确认用Oct4-VP16建立的iPS细胞系中只有通过逆转录病毒导入的Oct4转基因存在。f.用Oct4-VP16单因子产生iPS细胞能够形成嵌合小鼠(黑色箭头)并能发生生殖系传递(白色箭头)。

图12显示利用一个携带人工因子的附加体质粒就能够从小鼠体细胞高效产生无DNA插入的iPS细胞。a.用于iPS诱导的附加体质粒图谱。OCT4-VP16，KLF4，SOX2-VP16和NANOG-VP16的编码序列通过2A原件依次串连后克隆至附加体载体pCEP4上。b.pCEP4-XKYZ诱导形成的iPS克隆和细胞系的形态正常。刻度尺为200μm。c.通过PCR分析显示用附加体质粒产生的iPS细胞基因组中不含质粒的插入。以附加体质粒诱导的iPS细胞和MEF细胞的基因组DNA为模版，以pCEP4-XKYZ质粒DNA与MEF细胞基因组DNA的混合物为阳性对照，利用针对转基因和载体骨架部位的特异性引物进行PCR扩增，检测质粒DNA的插入。d.将用附加体质粒产生的2号iPS细胞株显微注射到ICR小鼠的囊胚中，获得了嵌合鼠。嵌合鼠出现的野鼠色(毛色)和有色眼睛表明iPS细胞的掺入。e.附加体iPS细胞具有掺入生殖系的能力。iPS细胞被显微注射到ICR小鼠的囊胚中。在E13.5天嵌合胚胎的生殖脊中的见到的GFP阳性信号表明iPS细胞能进入生殖系。

图13显示用附加体质粒诱导成的小鼠iPS细胞的鉴定。a.利用南方杂交分析证明附加体iPS细胞基因组中无质粒DNA插入。将15μg基因组DNA用EcoRV酶切并转膜后用图示探针进行杂交。稀释后的质粒DNA用作阳性对照。b.免疫染色显示附加体iPS细胞中Oct4，Nanog和SSEA-1的表达。刻度尺为100μm。c.定量PCR分析表明附加体iPS细胞中全能性基因的表达正常。d，e.附加体质粒产生的iPS细胞与MEF细胞和ES细胞的基因表达谱比较，显示其与ES细胞接近。f.附加体iPS细胞的核型正常。

图14显示VP16、酵母Gal4、人NFκB、小鼠p53、人Sp1a、人Ap-2a、小鼠Sox2和小鼠Nanog的Genbank登陆号及其序列。下划线标示了用于融合的氨基酸序列。

图15显示Tcl1、Tcf3、Rex1、Sal4、lefty1、Dppa2、Dppa4、Dppa5、Nr5a1、Nr5a2、Dax1、Esrrb、Utf1、Tbx3、Grb2、Tel1、Sox15、Gdf3、Ecat1、Ecat8、Fbxo15、eRas和Foxd3与VP16 AD(446-490)融合的氨基酸序列。

具体实施方式

本申请第一方面提供一种融合蛋白，该融合蛋白含有细胞全能性相关的基因的编码蛋白或其片段和转录调控结构域或其具有转录调控活性的片段。

本文中，“细胞全能性相关”意指与细胞全能性的调控、控制、产生或恢复等相关的基因。细胞全能性相关的基因包括OCT4、NANOG、SOX2、Tcl1、Tcf3、Rex1、Sal4、lefty1、Dppa2、Dppa4、Dppa5、Nr5a1、Nr5a2、Dax1、Esrrb、Utf1、Tbx3、Grb2、Tel1、Sox15、Gdf3、Ecat1、Ecat8、Fbxo15、eRas和Foxd3等。

在某些实施例中，本发明的融合蛋白中也可含有细胞全能性相关的基因的活性片段。示范性的活性片段的例子包括但不限于Oct4第127-352位氨基酸序列和Oct4第1-286位氨基酸。

本文中，“转录调控结构域”意指调控(例如激活或抑制)转录的常由30-100氨基酸残基组成的氨基酸序列，富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类，通常为酸性结构域，包括VP16、EBNA2、E1A、Gal4、Oaf1、Leu3、Rtg3、Pho4、Gln3、Gcn4、Gli3、Pip2、Pdr1、Pdr3、Lac9、Tea1、p53、NFAT、Sp1(如Sp1a)、AP-2(如Ap-2a)、Sox2、NF-κB、MLL/ALL、E2A、CREB、ATF、FOS/JUN、HSF1、KLF2、NF-IL6、ESX、Oct1、Oct2、SMAD、CTF、HOX、Sox2、Sox4或Nanog等的转录调控结构域及所述结构域中具有转录调控功能的片段。

其它可用于本发明的转录调控结构域还可选自植物HSF的转录调控结构域或其具有转录调控功能的片段。

示范性的转录调控结构域或其具有转录调控功能的片段的例子包括但不限于VP16第446-490位氨基酸序列、VP16第437-448位氨基酸序列、酵母Gal4第768-881位氨基酸序列、人NFκB第451-551位氨基酸、小鼠p53第8-32位氨基酸序列、人Sp1a第139-250位氨基酸序列、人Ap-2a第31-117位氨基酸序列、小鼠Sox2第121-319位氨基酸序列和小鼠Nanog第244-305位氨基酸序列。

本发明的融合蛋白可含有一个或多个相同或不同的转录调控结构域。这些相同或不同的转录调控结构域可相互之间直接串联，也可通过接头序列进行连接。

示范性的串联的转录调控结构域的例子包括但不限于SEQ ID NO：81所示的三个串联的VP16的第446-490位氨基酸片段，以及SEQ ID NO：82所示的两个串联的VP16的第437-448位氨基酸片段。

本申请中可以使用病毒蛋白如VP16、EBNA2、E1A等的转录调控结构域。在一个实施例中，所述病毒蛋白可以选自单疱病毒编码蛋白VP16。在一个具体实施例中，所使用的转录调控结构域是单疱病毒编码蛋白VP16的转录激活结构域及其具有转录调控功能的片段。

此外，在酵母中以Gal4、Oaf1、Leu3、Rtg3、Pho4、Gln3、Gcn4、Gli3、Pip2、Pdr1、Pdr3、Lac9、Tea1和在哺乳动物中以p53、NFAT、Sp1(如Sp1a)、AP-2(如Ap-2a)、Sox2、NF-κB、MLL/ALL、E2A、CREB、ATF、FOS/JUN、HSF1、KLF2、NF-IL6、ESX、Oct1、Oct2、SMAD、CTF、HOX、Sox2、Sox4或Nanog等为代表的转录因子中的转录调控结构域及其具有转录调控功能的片段都可用于本申请。

本申请中，哺乳动物包括人、小鼠等。

因此，本申请的融合蛋白可以是OCT4、SOX2和/或NANOG蛋白与单疱病毒编码蛋白VP16的转录调控结构域融合形成的蛋白。

本申请的融合蛋白中所述细胞全能性相关的基因的编码蛋白或其片段和转录调控结构域或其具有转录调控活性的片段可直接相连，或者可含有接头序列，用于连接所述细胞全能性相关的基因的编码蛋白和转录调控结构域，例如，用于连接所述OCT4、SOX2和/或NANOG蛋白与单疱病毒编码蛋白VP16的转录调控结构域。所述接头序列优选是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2-40个，例如2-30、2-25、2-20、2-15、2-10、2-8或者3-30、3-25、3-20、3-15、3-10个，或者4个以上30、25、20、15、12或10个以下。

本申请的融合蛋白实例包括其氨基酸如SEQ ID NO：74-76和92-106任一所示的融合蛋白。

本申请第二方面提供一种核苷酸序列，其编码本申请的融合蛋白。

具体而言，本申请的核苷酸序列含有细胞全能性相关的基因或其片段的核苷酸序列和转录调控结构域或其片段的编码序列。

所述细胞全能性相关的基因包括OCT4、NANOG、SOX2、Tcl1、Tcf3、Rex1、Sal4、lefty1、Dppa2、Dppa4、Dppa5、Nr5a1、Nr5a2、Dax1、Esrrb、Utf1、Tbx3、Grb2、Tel1、Sox15、Gdf3、Ecat1、Ecat8、Fbxo15、eRas和Foxd3等。

本发明的多核苷酸序列可包括这些细胞全能性相关的基因的全长序列或其片段。

所述转录调控结构域包括VP16、EBNA2、E1A、Gal4、Oaf1、Leu3、Rtg3、Pho4、Gln3、Gcn4、Gli3、Pip2、Pdr1、Pdr3、Lac9、Tea1、p53、NFAT、Sp1(如Sp1a)、AP-2(如Ap-2a)、Sox2、NF-κB、MLL/ALL、E2A、CREB、ATF、FOS/JUN、HSF1、KLF2、NF-IL6、ESX、Oct1、Oct2、SMAD、CTF、HOX、Sox2、Sox4或Nanog等的转录调控结构域及所述结构域中具有转录调控功能的片段。

在具体的实施例中，所述核苷酸序列含有OCT4、SOX2和/或NANOG蛋白的编码序列和单疱病毒编码蛋白VP16、Gal4、p53、NFAT、Sp1a、Ap-2a、Sox2或NF-κB的转录调控结构域的编码序列。在其它实施例中，在OCT4、SOX2和/或NANOG蛋白的编码序列和单疱病毒编码蛋白VP16的转录调控结构域的编码序列之间还可含有多甘氨酸接头的编码序列。

在一优选实施例中，本发明的核苷酸序列选自：编码选自SEQ ID NO：74-76和92-106任一所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

在其它优选实施例中，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：77-91。

本申请第三方面提供一种将体细胞重编程为诱导的多能干细胞或具有不同功能的其它细胞谱系细胞的方法，该方法包括：

(1)用本发明所述的融合蛋白、核苷酸序列、表达载体或组合物处理体细胞，

(2)经过培养后筛选出具有多能干细胞理化特征的细胞或其它细胞谱系的细胞，从而获得多能干细胞或具有不同功能的其它细胞谱系的细胞。

具体的方法可以分为以下几步：

1、将本发明的融合蛋白、核苷酸序列通过病毒感染、质粒转染、蛋白转导以及mRNA转染等方式导入至体细胞中。

2、经过一段时间的培养，挑取产生的iPS克隆，并建立稳定的iPS细胞系。

3、对建立的iPS细胞株进行基因表达和发育全能性等方面的鉴定。

本申请第四方面提供一种iPS细胞，其采用本申请所述方法获得。利用本申请所述方法通过存在DNA插入情况的技术手段获得的iPS细胞在其基因组上存在有特有的插入序列。这些特有的插入序列本发明融合蛋白的编码序列，包括但不限于OCT4、SOX2和/或NANOG蛋白和转录调控结构域(尤其是单疱病毒编码蛋白VP16、Gal4、p53、NFAT、Sp1a、Ap-2a、Sox2或NF-κB的转录调控结构域)的融合蛋白的编码序列。

本申请第五方面提供一种试剂盒，其含有本申请的蛋白质、核苷酸序列和/或表达载体。试剂盒还可含有其它适用于递送所述蛋白质和/或核苷酸序列的试剂。试剂盒还可含有一说明书，用于指导技术人员使用该试剂盒处理体细胞，将体细胞重编程为诱导的多能干细胞或通过不同因子的组合将体细胞诱导成其他类型的细胞。

本申请第六方面提供一种转录调控结构域在制备用于将体细胞重编程为诱导的多能干(iPS)细胞的试剂中的用途。所述试剂包括融合蛋白，例如本申请的融合蛋白。所述转录调控结构域可选自VP16、EBNA2、E1A、Gal4、Oaf1、Leu3、Rtg3、Pho4、Gln3、Gcn4、Gli3、Pip2、Pdr1、Pdr3、Lac9、Tea1、p53、NFAT、Sp1a(如Sp1a)、AP-2(如Ap-2a)、Sox2、NF-κB、MLL/ALL、E2A、CREB、ATF、FOS/JUN、HSF1、KLF2、NF-IL6、ESX、Oct1、Oct2、SMAD、CTF、HOX、Sox2、Sox4或Nanog等的转录调控结构域及所述结构域中具有转录调控功能的片段。更优选的转录调控结构域可选自单疱病毒编码蛋白VP16的转录结构域，还可选自在酵母中以Gal4、Oaf1、Leu3、Rtg3、Pho4、Gln3及Gcn4和在哺乳动物中以p53、NFAT、Sp1a、Ap-2a、Sox2、NF-κB等为代表的转录因子中的转录调控结构域。

本文中，OCT4、NANOG、SOX2蛋白、以及转录调控结构域可以是任何已知的OCT4、NANOG、SOX2蛋白、以及转录调控结构域(尤其是单疱病毒编码蛋白VP16的转录调控结构域)，包括其保留了所需性能、活性和/或结构的衍生物或类似物。特别优选的衍生物或类似物包括性质上保守的取代，即这些取代发生在与它们的侧链有关的一类氨基酸中。具体而言，氨基酸一般被分成四类：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)无电荷的极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。例如，有理由预测：单独用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构上相关的氨基酸取代类似的保守的氨基酸，这样的取代将不会对生物活性有重要影响。例如，感兴趣的多肽可包括多达约5-10个保守的或不保守的氨基酸取代，甚至多达约15-25个保守的或不保守的氨基酸取代，或2-25之间任何整数，只要该分子的所需功能仍维持完整。本领域的熟练技术人员可结合本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲线图，容易地测定感兴趣的分子中可耐受改变的区域。

本申请的核苷酸序列中编码OCT4、NANOG、SOX2蛋白、以及转录调控结构域(尤其是单疱病毒编码蛋白VP16的转录调控结构域)的序列也包括编码它们的类似物或衍生物的序列，只要这样的编码序列在进入细胞后表达的OCT4、NANOG、SOX2蛋白以及转录调控结构域能够实现它们原本所具有的功能和/或活性即可。

可采用各种方法给予本申请的蛋白质或核苷酸序列。例如，可将包含本申请核苷酸序列的质粒利用转染试剂(Fugene6，Roche；Lipofectamine，invitrogen等)转入细胞瞬时表达。也可用含有本申请的蛋白质溶液孵育细胞。可采用本领域常规培养基孵育所得的细胞。

可用于实施本申请所述方法的体细胞包括哺乳动物任何体细胞。优选的哺乳动物是人、鼠等，优选的体细胞包括：皮肤成纤维细胞、血液细胞、口腔上皮细胞等。

在使用本申请的蛋白或核苷酸序列处理体细胞后，可采用例如，Takahashi，K.& Yamanaka，S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined fa

本申请提供一种组合物，该组合物含有本申请的融合蛋白、核苷酸序列、和/或表达载体，和运载体或赋形剂。可用于本申请的运载体或赋形剂包括本领域常用的各种运载体或赋形剂。例如，所述运载体或赋形剂可以是与所述融合蛋白相容的可用于培育体细胞或iPS细胞的培养基成分，或者可以是与所述核苷酸序列相容的可用于例如转化体细胞的转化剂成分。这些成分的量通常可根据实际的需要由本领域技术人员采用常规技术手段加以确定。

本申请提供一种试剂盒，该试剂盒可含有本申请的融合蛋白、核苷酸序列、表达载体和/或组合物。该试剂盒还可含有指导技术人员使用该试剂盒由体细胞制备iPS细胞的说明书。试剂盒中还可包括例如可用于配制融合蛋白以用所配制得到的产物孵育体细胞的试剂，该试剂还可适于培育体细胞或iPS细胞。或者试剂盒中可包括适于将核苷酸序列转染入体细胞的试剂。试剂盒中的融合蛋白或核苷酸序列可以纯物质的形式提供，在使用前先与适当的运载体或赋形剂配制；或者可以混合物的形态例如本文所述的组合物形式提供。

下文将以具体实施方式的形式描述本发明。应理解，这些实施方式仅仅是阐述性的，而非限制性的。除非另有说明，所使用的试剂都是从市场上购得的试剂。

实施例

材料与方法

细胞培养：小鼠ES细胞和iPS细胞在DMEM(Invitrogen)中经丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的饲养层中维持，该DMEM添加有15％热灭活胎牛血清(FBS，Invitrogen)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、0.1mM β-巯基乙醇(sigma)、1000单位/ml的白细胞抑制因子(LIF，Chemicon)和50单位/50mg/ml的青霉素和链霉素。由雄性TgOG2转基因小鼠22和雌性野生型C57BL小鼠杂交获得的E13.5胚胎制得Oct4-GFP MEF。使MEF在添加有10％FBS(Hyclone)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸和100单位/100mg/ml的青霉素和链霉素的DMEM中生长。用前几代的MEF(至多到第4代)产生iPS细胞。

人ES和iPS细胞维持于添加有20％Knockout血清替代品(KSR，Invitrogen)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、4ng/ml碱性FGF(Invitrogen)和100单位/100mg/ml的青霉素和链霉素的DMEM中。从25岁正常男性获得人包皮成纤维细胞，并培养于含有10％FBS和100单位/100mg/ml的青霉素和链霉素的DMEM中。

逆转录病毒制备和小鼠iPS细胞诱导：逆转录病毒制备和感染根据之前公开的方案进行〔Takahashi，K.，Okita，K.，Nakagawa，M.&Yamanaka，S.Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.Nat Protoc2，3081-3089(2007)。以每100-cm培养皿7×10⁶细胞的量接种Plat-E细胞(Morita，S.，Kojima，T.& Kitamura，T.Plat-E：an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.Gene Ther 7，1063-1066，2000)。次日，使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)并根据制造商建议将9μg pMXs逆转录病毒载体(Addgene)转染入Plat-E细胞中。过夜转染后，替换培养基。48小时后，收集含病毒的上清，用加有4μg/ml聚凝胺(Sigma)的0.45μm PVDF滤纸(Millipore)过滤。将Oct4-GFP MEF细胞(接种中6孔平板上，每孔5×10⁴个细胞)与含有病毒的上清孵育12小时。感染2天后，将培养基换成小鼠ES培养基。感染8天后，将诱导的Oct4-GFP MEF细胞以5×10⁴个细胞/孔重新接种到6孔平板中丝裂霉素C处理的MEF饲养层上。重新接种后大约7天，计算GFP阳性和碱性磷酸酶阳性克隆的数量。使用NBT/BCIP(Roche)并根据制造商的建议进行碱性磷酸酶染色。

人iPS细胞的诱导：用经过滤的慢病毒上清过夜感染6cm皿中接种的5×10⁵个人包皮成纤维细胞(HFF)，然后在添加了强力霉素(Sigma)至1μg/μl的HFF培养基中培养。感染2天后，将诱导的HFF以1∶3的比例重新接种到丝裂霉素C处理的MEF饲养层中，并将培养基换为人ES培养基。感染约3周后，挑取iPS细胞克隆，计算碱性磷酸酶阳性的hES样克隆(圆的边缘，直径超出50μm)的数量。

免疫荧光分析。细胞用4％多聚甲醛固定30分钟，然后用0.2％TritonX-100渗透45分钟，接种用2％BSA(Sigma)阻断。将细胞置于一抗中4℃过夜培养，接着室温中与二抗孵育1小时。使用到下述抗体：SSEA-1(Santa Cruz)、SSEA-4(R&D)、Nanog(Chemicon)、Oct4(Santa Cruz)、SOX2(R&D)、TRA-1-60(Chemicon)、TRA-1-81(Chemicon)、FOXA2(abeam)、SOX17(Santa Cruz)、SMA(AbboMax)、BRACHYURY(abcam)、GFAP(Dako)、β-TUBULIN(Covance)。使用Vector Red substrate kit(Vector Laboratories)进行碱性磷酸酶染色。

嵌合体的产生、生殖系传代和四倍体囊胚补偿法。为了产生嵌合体，将iPS细胞注射入ICR E3.5胚泡中。嵌合体产生的下一代用于观察是否发生iPS细胞的生殖系传递。为了由四倍体囊胚补偿法产生小鼠，从ICR雌鼠(斯莱克实验动物中心)的输卵管中收集2细胞胚胎，将其电融合，产生单细胞四倍体胚胎，然后将其培育于KSOM培养基(Chemicon)中。将约10-15个iPS细胞注射入该四倍体胚泡的空腔中。将胚泡维持在含有氨基酸的KSOM中，直到胚胎移植。将15-20个经注射的胚泡移植到2.5天大的交配后假受孕ICR雌鼠的子宫角中。在E13.5上解剖得自四倍体胚泡注射物(4N)的胚胎。

人iPS细胞的染色体组型分析。用0.1μg/ml秋水仙酰胺(Invitrogen)于37℃处理人iPS细胞3小时，然后用胰酶处理，并再悬于0.075M KCl中20分钟。然后室温下在甲醇∶乙酸(3∶1)中固定经低渗溶液处理的细胞30分钟。然后将细胞置于预先清洁的切片上，用DAPI染色。计数并计算染色体中期分裂相。

人iPS细胞的体外和体内分化。对于EB形成，用胶原酶IV处理人iPS细胞并收获。将细胞块转移到低粘附皿中的DMEM/F12中，该DMEM/F12含有20％Knockout血清替代品、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸和0.1mM β-巯基乙醇。隔天更换培养基。悬浮培养8天后，将EB转移到凝胶包被的平板上，并在相同的培养基中培养8天。测试人iPS细胞的体内分化能力利用裸鼠皮下注射，具有全能性的iPS细胞能形成含三个不同胚层组织的畸胎瘤。

Western分析。用2∶1的重编程因子：pMIG逆转录病毒(Addgene)感染MEF，感染后3天收集细胞裂解液。一抗包括anti-Oct4(Santa Cruz)、Nanog(Chemicon)、Sox2(Chemicon)、Klf4(SantaCruz)、Flag(Sigma)、VP16(Clontech)、GFP(Santa Cruz)、p53(Santa Cruz)、p21(Santa Cruz)、p16(Santa Cruz)和β-actin(Sigma)。

RT-PCR。使用TRIZOL(Invitrogen)分离总RNA，1μg用ReverTra AceFirst-Strand cDNA synthesis kit(Toyobo)并根据制造商建议分析cDNA。所用PCR引物如下表1所示。使用EvaGreen(Stratagene)进行定量PCR。

表1：PCR反应所用引物

小鼠iPS细胞RT-PCR

Endo-Oct4  正向：TCTTTCCACCAGGCCCCCGGCTC(SEQ ID NO：1)

反向：TGCGGGCGGACATGGGGAGATCC(SEQ ID NO：2)

Endo-Sox2  正向：TAGAGCTAGACTCCGGGCGATGA(SEQ ID NO：3)

反向：TTGCCTTAAACAAGACCACGAAA(SEQ ID NO：4)

Endo-Nanog  正向：TAGGCTGATTTGGTTGGTGTCTTG(SEQ ID NO：5)

反向：AGTGTGATGGCGAGGGAAGG(SEQ ID NO：6)

Tg-gfp      正向：AGAAGAACGGCATCAAGG(SEQ ID NO：7)

反向：GCTCAGGTAGTGGTTGTC(SEQ ID NO：8)

Esg1        正向：GAAGTCTGGTTCCTTGGCAGGATG(SEQ ID NO：9)

反向：ACTCGATACACTGGCCTAGC(SEQ ID NO：10)

Dax1        正向：TGCTGCGGTCCAGGCCATCAAGAG(SEQ ID NO：11)

反向：GGGCACTGTTCAGTTCAGCGGATC(SEQ ID NO：12)

eRas        正向：ACTGCCCCTCATCAGACTGCTACT(SEQ ID NO：13)

反向：CACTGCCTTGTACTCGGGTAGCTG(SEQ ID NO：14)

Rex1        正向：ACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA(SEQ ID NO：15)

反向：TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT(SEQ ID NO：16)

Zfp296      正向：CCATTAGGGGCCATCATCGCTTTC(SEQ ID NO：17)

反向：CACTGCTCACTGGAGGGGGCTTGC(SEQ ID NO：18)

Ecat1       正向：TGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT(SEQ ID NO：19)

反向：ATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT(SEQ ID NO：20)

Thy1        正向：AGAAGGTGACCAGCCTGACA(SEQ ID NO：21)

反向：GTTCTGAACCAGCAGGCTTA(SEQ ID NO：22)

Dnmt3a2     正向：CTCACACCTGAGCTGTACTGCAGAG(SEQ ID NO：23)

反向：CTCCACCTTCTGAGACTCTCCAGAG(SEQ ID NO：24)

Dnmt3b      正向：TTCAGTGACCAGTCCTCAGACACGAA(SEQ ID NO：25)

反向：TCAGAAGGCTGGAGACCTCCCTCTT(SEQ ID NO：26)

Dnmt3L      正向：GTGCGGGTACTGAGCCTTTTTAGA(SEQ ID NO：27)

反向：CGACATTTGTGACATCTTCCACGTA(SEQ ID NO：28)

Ink4a       正向：GTGTGCATGACGTGCGGG(SEQ ID NO：29)

反向：GCAGTTCGAATCTGCACCGTAG(SEQ ID NO：30)

Arf         正向：GCTCTGGCTTTCGTGAACATG(SEQ ID NO：31)

反向：TCGAATCTGCACCGTAGTTGAG(SEQ ID NO：32)

Gapdh       正向：AGTCAAGGCCGAGAATGGGAAG(SEQ ID NO：33)

反向：AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATG(SEQ ID NO：34)

特别针对病毒转录物的定量PCR

Viral-X     正向：TCTCCCATGCATTCAAACTG(SEQ ID NO：35)

反向：CTTTTATTTTATCGTCGACC(SEQ ID NO：36)

Viral-Y     正向：CTGCCCCTGTCGCACATGTG(SEQ ID NO：37)

反向：CTTTTATTTTATCGTCGACC(SEQ ID NO：38)

Viral-Z      正向：CATCGCAGCTTGGATACAC(SEQ ID NO：39)

反向：GCATTGATGAGGCGTTCC(SEQ ID NO：40)

Viral-Klf4   正向：CCTTACACATGAAGAGGCAC(SEQ ID NO：41)

反向：CTTTTATTTTATCGTCGACC(SEQ ID NO：42)

β-actin     正向：GAAATCGTGCGTGACATCAAAG(SEQ ID NO：43)

反向：TGTAGTTTCATGGATGCCACAG(SEQ ID NO：44)

人iPS细胞RT-PCR

Endo-OCT4    正向：GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG(SEQ ID NO：45)

反向：CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC(SEQ ID NO：46)

Endo-SOX2    正向：GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG(SEQ ID NO：47)

反向：TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG(SEQ ID NO：48)

Endo-Nanog   正向：CAGCCCCGATTCTTCCACCAGTCCC(SEQ ID NO：49)

反向：CGGAAGATTCCCAGTCGGGTTCACC(SEQ ID NO：50)

胎x1         正向：CAGATCCTAAACAGCTCGCAGAAT(SEQ ID NO：51)

反向：GCGTACGCAAATTAAAGTCCAGA(SEQ ID NO：52)

DPPA5        正向：ATATCCCGCCGTGGGTGAAAGTTC(SEQ ID NO：53)

反向：ACTCAGCCATGGACTGGAGCATCC(SEQ ID NO：54)

GDF3         正向：CTTATGCTACGTAAAGGAGCTGGG(SEQ ID NO：55)

反向：GTGCCAACCCAGGTCCCGGAAGTT(SEQ ID NO：56)

ECAT-1       正向：GGAGCCGCCTGCCCTGGAAAATTC(SEQ ID NO：57)

反向：TTTTTCCTGATATTCTATTCCCAT(SEQ ID NO：58)

ECAT15-1     正向：GGAGCCGCCTGCCCTGGAAAATTC(SEQ ID NO：59)

反向：TTTTTCCTGATATTCTATTCCCAT(SEQ ID NO：60)

GAPDH        正向：TGTTGCCATCAATGACCCCTT(SEQ ID NO：61)

反向：CTCCACGACGTACTCAGCG(SEQ ID NO：62)

亚硫酸氢盐PCR

Oct4-outside  正向：GAGGATTGGAGGTGTAATGGTTGTT(SEQ ID NO：63)

反向：CTACTAACCCATCACCCCCACCTA(SEQ ID NO：64)

Oct4-inside   正向：CAAGCTTTGGGTTGAAATATTGGGTTTATTT(SEQ ID NO：65)

反向：CGGATCCCTAAAACCAAATATCCAACCATA(SEQ ID NO：66)

Nanog-outside 正向：AAGTATGGATTAATTTATTAAGGTAGTT(SEQ ID NO：67)

反向：AAAAAACCCACACTCATATCAATATA(SEQ ID NO：68)

Nanog-inside  正向：AAGTATGGATTAATTTATTAAGGTAGTT(SEQ ID NO：69)

反向：CAACCAAATCAACCTATCTAAAAA(SEQ ID NO：70)

DNA微阵列。用藻红蛋白分别标记Oct4-GFP MEFs、J1 ES细胞和iPS细胞序列(克隆XSKZ#4)的总RNA。根据制造商建议，使样品与Mouse Genome 430 2.0Array(Affymetrix)杂交。阵列用Gene array Scanner 3000(Affymetrix)扫描。使用Affymetrix GCOS1.2软件分析数据。

亚硫酸氢盐基因组测序。用亚硫酸氢钠处理基因组DNA，并如之前所述〔Li，J.Y.et al.Synergistic function of DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b in the methylation of Oct4 and Nanog.Mol Cell Biol 27，8748-59(2007)〕进行归巢式PCR。为进行测序分析，将PCR产物克隆人T-载体(Takara)中，并对单个克隆进行测序。

流式细胞术。收获培养物，并通过反复移液和转移通过40μm细胞滤器而获得单细胞悬液。用Alexa647 anti-mouse SSEA-1(BioLegend)孵育细胞，并在FACSAria(BD Biosciences)上拣选/分析。用FlowJo软件(Tree Star)分析数据。

实验结果

1.人工因子在重编程MEF到iPS细胞过程中的作用

将单疱病毒编码蛋白VP16的转录激活结构域分别与Oct4、Sox2和Nanog融合表达(图1a)。融合蛋白的表达是正常的(图5)。之后将这些因子转入MEF细胞，检测了重编程过程中一些干细胞标记基因的重新激活。当利用人工因子进行重编程时，包括Nanog与Oct4在内的内源基因在第六天时就已开始表达，而使用自然转录因子时这些基因直到第12天才开始表达(图6)。与早期基因重激活相对应的是，当利用人工因子时，Oct4启动子区域DNA去甲基化发生得更加迅速(图7)。在第6、第9和第12天分选出来的碱性磷酸酶(AP)、SSEA-1与Oct4-GFP阳性的细胞亚群体在Oct4启动子区域表现出更高的DNA去甲基化程度，从而将标记基因的重新激活和DNA的去甲基化联系起来(图8)。

之后本发明人检测了各个融合蛋白在MEF细胞重编程中的作用。本发明人采用了三因子系统(Oct4、Sox2与Klf4，简写为OSK)和四因子系统(OSK加Nanog)，没有加入原癌基因c-Myc。当利用OSK重编程Oct4-GFP转基因MEF细胞时，发明人从5×10⁴细胞中获得了3±1(平均值±标准偏差；n＝3)个GFP阳性克隆(图1b)。相对应地，当利用Oct4-VP16(X)代替Oct4时，获得了236±35个GFP阳性克隆，增加了78倍。相似地，用Sox2-VP16(Y)代替Sox2时，获得了108±19个GFP阳性克隆，增加了36倍。在四因子(OSKN)系统中用Nanog-VP16(Z)代替Nanog(N)时，获得了95±27个克隆，比采用OSKN获得的5±3个克隆增加了19倍。将三个人工因子组合起来共获得了511±47个克隆，效率提高了超过100倍。AP阳性克隆的数目变化与GFP阳性克隆的数目变化非常相符。并且这些GFP阳性克隆与正常的ES细胞在细胞形态上并无二致(图1c)。绝大部分iPS细胞克隆都在XKYZ因子导入第九天出现，比用自然因子提前了一周(图9)。这些数据表明人工因子可以显著促进重编程的发生，提高产生的iPS细胞细胞数目。

2.用人工因子建立的iPS细胞系的鉴定

本发明人用不同的人工因子组合产生了多株iPS细胞系。这些细胞系具有与小鼠胚胎干细胞(ES)相近的形态和增殖速率(图2a)。它们的AP活性染色呈阳性，并且表达ES细胞的表面标记物SSEA-1和核内标记物Nanog(图2b)。iPS细胞与ES细胞在多个关键基因的表达水平上趋于一致，其中包括了激活的内源性Oct4、Sox2和Nanog以及表达下调的MEF细胞中特异表达的基因Thy1(图2c)。在这些人工因子的iPS细胞中，来自于逆转录病毒转基因的转录水平已经被沉默至与自然因子的iPS细胞中相当的水平(图2d)。即使起始性DNA甲基转移酶Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L的表达被上调(图6)，内源Oct4和Nanog还是通过其启动子区域的DNA去甲基化而实现了激活(图2e)，这一结果提示，这些iPS细胞的表观遗传学调控已经回复到了一个典型的ES细胞状态。

3.基于人工因子的iPS细胞具有完整的发育全能性

人工因子产生的iPS细胞在全基因组水平上的表达谱式与ES细胞类似(图3a)。这些细胞能够为小鼠胚胎的发育作出贡献证明了其个体发育的全能性。将iPS细胞注射到二倍体囊胚中产生了具有高度毛色嵌合的成活嵌合小鼠及生殖系传代的后代(图3b)。利用人工因子诱导的iPS细胞不仅能够通过二倍体囊胚注射产生高度毛色嵌合的成活嵌合小鼠，并且这些嵌合小鼠还能通过生殖系传递形成完全来自iPS细胞的小鼠，表2小结了小鼠iPS细胞株进行二倍体囊胚注射产生嵌合小鼠和生殖系传递的情况。此外，嵌合小鼠和其生殖系传递的子代小鼠(至少4代)到至今近1年的饲养过程中都没有出现肿瘤。此外，将iPS细胞系(XSKZ #4)注射至四倍体囊胚中后得到了活的E13.5天小鼠胚胎(图3c)。另外，在生殖嵴中能发现GFP阳性细胞，这说明这些iPS细胞能够产生生殖细胞(图3d)。以上的实现数据表明，通过人工因子重编程产生的iPS细胞具有与ES细胞相似的发育全能性。

表2、小鼠iPS细胞株二倍体囊胚注射情况小结

*括号中的“只”指被证实发生了生殖系传递的嵌合鼠数目。

**括号中的“否”指截至申请递交时未观察到生殖系传递。

4.人工因子也能促进人类诱导多能干细胞的产生

接下来，本发明人检测了人工转录因子是否能够提高人类诱导多能干细胞的产生效率。利用可诱导表达的慢病毒载体将这些人工因子导入人类包皮纤维细胞中以诱导iPS细胞。不论是在三因子还是在四因子的实验体系中，用人工因子都能够产生显著多于自然因子的iPS细胞克隆(图4a)。这些iPS细胞具有正常的人类胚胎干细胞形态并且呈AP阳性(图4b)。接下来鉴定了人类iPS细胞中其他标记物的表达。免疫荧光染色显示，这些细胞均一地表达ES细胞的标记物OCT4、NANOG、SOX2、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81(图4c)。基因表达分析显示，iPS细胞中常见ES细胞标记基因的表达量与ES细胞中相当(图4d)。这些iPS细胞具有正常的核型(图4g)并且在生长于体外分化培养基中和注射至免疫缺陷小鼠体内时都能够产生三个胚层的细胞类型(图4e，f)。以上这些结果表明人工因子不仅能提高产生小鼠iPS细胞的效率，同样也能提高从人类体细胞产生iPS细胞的效率。

5.使用一个人工因子就能把体细胞诱导成iPS细胞

之前的报道显示将已分化的体细胞重编程至少需要3个外源因子并且效率极低(Nakagawa et al.，2008；Wernig et al.，2008)，小分子化合物的加入能够替代其中的某个因子但效率依然十分低(Huangfu et al.，2008；Ichida et al.，2009；Li et al.，2010；Lyssiotis et al.，2009；Shi et al.，2008)。既然人工因子能大大地提高重编程的效率，我们尝试只使用一个人工因子Oct4-VP16来对MEF细胞进行重编程。5×10⁴个MEF细胞被Oct4-VP16的逆转录病毒感染后第17天，平均出现了18个GFP阳性的iPS克隆(图11a，b)。实验还显示人工因子中VP16拷贝数的增加大大提升重编程的效率和加快其进程，使用Oct4与3个VP16融合的单因子诱导重编程，在病毒感染后第9天就已经有GFP阳性克隆出现，这一数目在第17天时已经上升至120(附图11a)，达到约0.24％的重编程效率，这与OKS三因子(Nakagawa et al.，2008；Wernig et al.，2008)或OKSM四因子(Okita et al.，2007；Wernig et al.，2007)的效率相当甚至更高。用Oct4-VP16单因子建立iPS细胞表达Oct4，Nanog，SSEA-1(附图11c)和其他全能性基因(图11d)。这些iPS细胞经PCR确认只含有Oct4-VP16的转基因(图11e)，并能产生具有生殖系系传递能力的嵌合小鼠(图11f)。这些结果第一次证明只用一个因子就能对MEF细胞进行高效的重编程。

6.通过基于附加体质粒的导入方法，利用人工因子能高效地产生无DNA插入的iPS细胞。

到目前为止产生无DNA插入的iPS细胞依然十分困难。我们成功地完成了通过一个附加体质粒将人工因子导入MEF细胞进行重编程的尝试。编码OCT4-VP16，KLF4，SOX2-VP16和NANOG-VP16的序列通过2A原件依次串连后克隆至附加体载体pCEP4(Invitrogen)中产生附加体质粒pCEP4-XKYZ(图12a)。通过电击将pCEP4-XKYZ转染至1×10⁶个MEF细胞中，经过18天后我们观察到了55-450个Oct4-GFP阳性的iPS克隆。我们随机挑取了24个iPS克隆，证实它们都能建立稳定的细胞系(图12b)。通过基因组DNA的PCR的检测，我们发现这些细胞系中都不含有质粒DNA的插入(图12c)。使用针对转基因的探针进行的Southern杂交也证明这些细胞中没有质粒DNA的插入(图13a)。进一步的免疫荧光(图13b)，定量PCR(图13c)和基因组表达谱分析(图13d，e)都证明附加体iPS细胞与ES细胞十分接近。这些iPS细胞核型正常(图13f)，并能产生嵌合小鼠，具有进入生殖系的能力(图12d，e)。之前报道的制备无DNA插入的iPS细胞的工作都需要使用c-Myc促癌基因，并且效率极低(Kim et al.，2009a；Okita et al.，2008；Yu et al.，2009；Zhou et al.，2009)。我们首次证明了在不使用c-Myc的条件下，利用人工因子使这一效率达到了约0.03％。

7.重编程因子只要与具有转录激活功能的结构域融合后都能增强其重编程能力(如Oct4与VP16、Gal4、p53、NFκB、Sp1、AP2和Nanog的转录激活结构域的融合)。

我们利用含Oct4-GFP报告基因的小鼠MEF细胞的重编程实验系统，测试了Oct4与一系列转录因子的转录激活结构域融合后形成的人工因子对重编程的作用(见表3)。这些转录激活结构域包含了富含酸性氨基酸、谷氨酰胺、脯氨酸和丝氨酸/苏氨酸等各种类型，所属物种包括了单纯疱疹病毒，酵母，小鼠和人，具有了一定的广谱性。我们的实验结果显示Oct4只要和具有转录激活能力的结构域融合，所形成的人工因子和Oct4相比在都能显著地提高重编程效率，并且这种效率提升的程度随着所融合结构域转录激活能力的增强而增强。此外我们还发现Oct4只要与2个串连的、来自VP16中的一段只含12个氨基酸的短肽(DALDDFDLDMLG)融合，就能大大地提高其重编程的效率。

8.重编程因子的一部分，即含有DNA结合结构域的部分与较强的转录激活蛋白融合后也能诱导iPS细胞产生。如Oct4的一部分与VP16的转录激活结构域融合后与Oct4整体一样能够用于重编程(见SEQ ID NO：90和91)。

表3

表中，“+”表示有刺激效果；“-”表示抑制效果。

表中GCNF、RARα、PPARγ、SF-1和LRH-1为报道的能结合至Oct4启动子区域并调控其表达的蛋白，我们选用了这些蛋白中具有DNA结合能力的部分与VP16AD进行融合。

讨论

我们证明了具有增强转录激活能力的人工因子能通过重新激活包括Oct4、Sox2和其他目的基因在内的内源性全能性因子来促进类似ES转录调控网络的建立。这些重新激活的内源性因子可能为进一步的重编程做出贡献并最终提高产生iPS细胞的效率。

最近的报道指出，p53信号通路抑制了细胞的复制潜能；抑制p53信号通路后能显著提高iPS细胞的产生效率〔Zhao，Y.et al.Two supporting factors greatly improve the efficiency of human iPSC generation.Cell Stem Cell 3，475-9(2008)；Hong，H.et al.Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.Nature(2009)；Utikal，J.et al.Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells.Nature 460，1145-8(2009)；Marion，R.M.et al.A p53-mediated DNA damage response limits reprogramming to ensure iPS cell genomic integrity.Nature 460，1149-53(2009)；Li，H.et al.The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming.Nature 460，1136-9(2009)；Kawamura，T.et al.Linking the p53tumour suppressor pathway to somatic cell reprogramming.Nature 460，1140-4(2009)〕。我们发现人工因子并不是通过降低p53的表达量来实现其增强重编程的能力的，实验结果显示在被转导的MEF细胞中p53的表达量其实是有所上调的(图S6)。用人工因子产生的iPS细胞不会因p53的失活而危害其基因组的稳定性，所以也不会存在肿瘤的风险。用人工因子诱导的多能干细胞成瘤没有增加，与天然因子诱导的多能干细胞相比不会增加肿瘤发生比率。

与前述不同，我们证明人工因子是通过加速DNA去甲基化和全能性基因的重新激活这两大限速步骤来提高重编程效率的(图4f)。在体细胞中，Nanog和Oct4的启动子因DNA甲基化而稳定地沉默〔Li，J.Y.et al.Synergistic function of DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b in the methylation of Oct4and Nanog.Mol Cell Biol 27，8748-59(2007)〕。与此一致的是，在开始的几天中即使MEF细胞已经高量表达Oct4-VP16和其他因子，仍然没有检测到Oct4-GFP的表达。这表明含有抑制标记的不活跃染色质使转录因子难以到达基因的启动子区域，从而严重阻碍了转录起始。VP16与Oct4、Nanog和Sox2融合后通过一些未知的机制加快了抑制性标记的移除和目标基因的重新激活。我们的发现支撑了这一概念：在不同时期分选的GFP阳性细胞都在Oct4启动子区域发生了广泛的DNA去甲基化(图S4)。

已知在小鼠ES细胞中外源表达Nanog-VP16会引起ES细胞的分化〔Wang，Z.，Ma，T.，Chi，X.& Pei，D.Aromatic residues in the C-terminal domain 2 are required for Nanog to mediate LIF-independent self-renewal of mouse embryonic stem cells.J Biol Chem 283，4480-9(2008)〕，但在我们的系统中，这种有害的作用会被避免，因为已经重编程的细胞由于内源性Dnmt3L和Dnmt3a2的激活会将逆转录病毒的启动子区域进行起始性DNA甲基化。尽管如此，人工因子外源表达的持续时间还需要进行试验以优化iPS细胞重编程。此外，人工因子还可以通过增强其转录激活活力、蛋白稳定性和细胞内定位等方法改善人工因子的效率。例如，改进可以通过融合Oct4和三个串联的VP16或者利用移去了泛素化位点的可以抵抗蛋白酶体介导蛋白质降解的Oct4突变体〔Xu，H.et al.WWP2promotes degradation of transcription factor OCT4 in human embryonic stem cells.Cell Res 19，561-73(2009)〕。当重编程因子以非病毒的方法导入细胞时，它们在细胞中的浓度将处于一个比较低的水平，这时利用增强的转录因子将变得至关重要。我们利用质粒瞬时转染人工因子产生iPS细胞得到了很高的效率和可重复性。经过改造的人工因子在包括定向分化干细胞和前体细胞产生能用于再生医学的功能性细胞在内的细胞重编程中可能存在着广泛的应用前景。