构建基因工程菌以增强微生物发酵甘油产1,3-丙二醇的方法

摘要

本发明提供了一种构建基因工程菌以增强微生物产1，3-丙二醇的方法，包括构建插入苹果酸酶基因的表达载体；将插入苹果酸酶基因的表达载体转入产生1，3-丙二醇的宿主菌中；在发酵培养过程中添加诱导剂诱导苹果酸酶基因过量表达；采用有氧发酵并流加底物甘油的发酵方式生产1，3-丙二醇。其特点在于：所构建的基因工程菌较出发菌在发酵过程中表达了更多的苹果酸酶，促进了丙酮酸到苹果酸的转化，从而促进了三羧酸循环，使菌体产生更多的还原性辅酶NADH和能量ATP，提高了菌体内1，3-丙二醇氧化还原酶的活性，提高了甘油转化速率。本发明的优点在于：促进生产菌对底物甘油的利用，显著提高了发酵产1，3-丙二醇的浓度和生产强度，提高了1，3-丙二醇的得率，从而降低生产成本。

说明书

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一种构建基因工程菌以增强微生物产1，3-丙二醇的方法。

背景技术

1，3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂，应用于耐压高润滑剂、染料、油墨、防冻剂等行业。PDO吸引工业界的关注并迅速发展的主要原因是它可以用作合成聚酯PTT的单体，而PTT是继50年代聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、70年代聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)之后实现工业规模的新的可成纤聚酯高分子材料，是一种极有发展前途的新型聚酯材料。由于PTT具有诸多的优良特性，它在地毯工业、服装材料、工程热塑料以及其它众多领域有着很广泛的应用。

生产PTT纤维的关键在于单体原料PDO的来源。Dupont和Shell公司曾采用化学合成路线，以环氧乙烷或丙烯为原料生产PDO。化学合成法生产PDO的缺点是副产物多，选择性和产率较低，操作条件需要高温高压，设备投资巨大，原料不可再生；同时由于产量有限，长期以来PDO售价偏高。

目前1，3-丙二醇的生产方法主要是微生物发酵法。与化学合成法相比，微生物发酵法生产1，3-丙二醇具有显著的优点：1、利用成本较低的可再生资源(如甘油、玉米、淀粉)为原料；2、生产条件温和，操作简便，不需贵重金属催化剂；3、选择性好，副产物较少，易于分离纯化；4、环境污染小。微生物发酵法是以生物技术为特征的“绿色工业”向传统石油化工提出的强有力的挑战，具有重要的现实意义，因而越来越受到重视。

生物合成法生产PDO是利用微生物歧化甘油产生。至今所有被发现的1，3-丙二醇生产菌种均为细菌，其中克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freudii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)具有较高的1，3-丙二醇转化率和1，3-丙二醇生产强度，而且对底物和产物具有较高的耐受性，因此具有较高的开发前景，从而得到了较多关注。

在利用微生物发酵甘油生产1，3-丙二醇的过程中，甘油作为碳源与能源进行氧化和还原歧化反应，氧化途径中产物与糖类发酵产物一致，产生供细胞生长所必需的ATP，在产物形成的同时释放还原力NADH；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力NADH，生成PDO。克雷伯氏菌合成1，3-丙二醇的还原代谢途径包括两步反应：第一步，由依赖于辅酶B12的甘油脱水酶催化甘油脱水生成3-羟基丙醛；第二步，由PDO氧化还原酶催化3-羟基丙醛还原生成PDO。氧化途径中丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰CoA和甲酸，甲酸往往又会分解为CO2和H2。乙酰CoA在经乙酰磷酸形成乙酸的过程中产生ATP，而在经乙醛形成乙醇的两步反应中要消耗2摩尔还原力。在pH值较低的条件下，丙酮酸经α-乙酰乳酸产生3-羟基-2-丁酮并转化为2，3-丁二醇。此外，发酵产物中还有乳酸和琥珀酸等。另外，细胞生长也可为PDO生成提供还原力。

微生物产生1，3-丙二醇的途径可用来替代化学合成途径，但目前生物合成法生产1，3-丙二醇存在产物在发酵液中终浓度较低，甘油转化率以及生产强度较低等问题，在微生物法生产PDO工业化之前，必须降低生产成本。构建基因工程菌生产PDO是降低生产成本的有效方法之一。目前多种方法已经被用来构建产生PDO的基因工程菌：

(1)通过基因工程方法强化表达生成PDO还原途径中关键酶(如甘油脱水酶，PDO氧化还原酶)[Sun JB.，Heuvel J.，Soucaille P.，Qu Y.，and Zeng A.P.Comparative Genomic Analysis of dha Regulon and  Related Genes for Anaerobic Glycerol Metabolism in

(2)敲除代谢副产物编码基因，切断副产物代谢途径：[杨光.1，3-丙二醇产生菌肺炎克氏杆菌的分子育种[D].北京：中国农业大学，2003]；[李季伦等，产乳酸途径缺失的工程菌及其构建方法与应用，专利公开号：ZL200510127744]；[张延平，刘铭，曹竹安.醛脱氢酶基因敲除的K.pneumoniae重组菌的构建，中国生物工程杂志，2005，25(12)：34～38]；[张延平等，醛脱氢酶基因敲除对克雷伯氏菌合成1，3-丙二醇的影响，化工学报，2006，57(11)：2689-2692]。

(3)在PDO生产菌中构建辅酶再生系统；[黄志华，张延平，曹竹安等.甲酸脱氢酶在Klebsiella pneumoniae中的表达和功能分析，微生物学报，2007，47(1)：64～68][黄志华，张延平，曹竹安.在Klebsiella pneumoniae醛脱氢酶失活菌中构建NADH2再生系统.中国生物工程杂志，2006，26(12)：75～80]。

(4)在E.coli中构建利用葡萄糖合成PDO的基因工程菌[Bulthuis B A，Gatenby A A，Haynie S L等，Method for the production of glycerol by recombinant organisms[P].United States Patent：6 358 716，2002-05-19.Diaz-Torres M，Dunn-Coleman N S，Chase M W等，Method for the Recombinant Production of 1，3-Propanediol[Pl.United States Patent：6 136 576，2000-10-24.Emptage M，Haynie S L，Laffend L A等，Process for the Biological Production of 1，3-Propanediol with High Titer.United States Patent：6 514 733，2003-08-21.]。

(5)在E.coli中构建利用甘油合成PDO的基因工程菌[Xueming Tang，Yongsong Tan，Hong Zhu，Kai Zhao，and Wei Shen.Microbial  Conversion of Glycerol to 1，3-Propanediol by an Engineered Strain of Escherichia coli.Appl.Environ.Microbiol.2009，75，6：1628-1634]。

(6)在甘油产生菌中构建合成PDO的基因工程菌[Cameron DC，Altaras NE，Hoffman ML等，Metabolic Engineering of Propanediol Pathways.Biotechnol.Prog.1998，14：116-125]。

(7)采用基因工程方法改造生产菌种提高生产性能[刘德华等，构建基因工程菌增强1，3-丙二醇生产菌株抗逆性的方法，专利公开号：CN101381696]。

目前，还没有构建基因工程菌强化表达苹果酸酶基因以增强微生物发酵甘油产1，3-丙二醇的报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种产1，3-丙二醇的基因工程菌及其在发酵甘油生产1，3-丙二醇中的应用。

本发明的另一目的是提供一种构建转苹果酸酶基因工程菌以增强微生物产1，3-丙二醇的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种产1，3-丙二醇的基因工程菌，其是通过构建插入苹果酸酶基因的表达载体，然后将插入苹果酸酶基因的表达载体转入产1，3-丙二醇的宿主菌中而获得的。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

上述基因工程菌的构建过程如下：

(1)以克雷伯氏菌属细菌基因组DNA为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)的方法将苹果酸酶基因完整克隆下来；

(2)PCR产物经纯化后与克隆载体(如pMD18-T)连接，转化感受态细胞DH5α；

(3)筛选阳性克隆菌，培养，提取质粒，用EcoR I和Sal I酶切，回收酶切片段，与经过同样双酶切的表达载体(如表达载体pET28a)连接，构建重组表达载体，命名为pET-ME；

(4)将构建好的重组表达载体pET-ME转化到感受态大肠杆菌中(如DH5a)，在卡那霉素抗性培养平板上筛选阳性克隆；

(5)从阳性克隆菌里提取重组表达载体pET-ME，并通过电转化或化学转化法将其转化到克雷伯氏菌属等可产生PDO的野生型菌株感受态细胞里，分离出阳性克隆，即为目的菌株。

前述的可产生PDO的野生型菌株包括肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)等。

本发明还提供利用上述的基因工程菌发酵生产1，3-丙二醇的方法，其是将上述的基因工程菌进行发酵培养，在发酵过程中添加诱导剂诱导苹果酸酶基因过量表达，采用有氧发酵并流加底物甘油的发酵方式生产1，3-丙二醇。

前述的方法，在发酵培养过程中添加的诱导剂为IPTG，诱导苹果酸酶基因过量表达的时机是从菌种进行发酵开始至对数生长期；诱导剂的剂量为0.1-1.0mM。

前述的方法，发酵过程中流加甘油使发酵液中底物甘油浓度为1-50g/l。

前述的方法，发酵底物为精甘油、甘油发酵液、生物柴油副产物粗甘油或肥皂行业的副产物粗甘油。

本发明进一步提供一种构建转苹果酸酶基因工程菌以增强微生物产1，3-丙二醇的方法，包括步骤：I)构建插入苹果酸酶基因的表达载体；将插入苹果酸酶基因的表达载体转入产生1，3-丙二醇的宿主菌中；II)将步骤I)中获得的基因工程菌进行发酵培养，在发酵过程中添加诱导剂诱导苹果酸酶基因过量表达，采用有氧发酵并流加底物甘油的发酵方式生产1，3-丙二醇。

前述的方法，步骤I)中所述的构建插入苹果酸酶基因的表达载体的步骤包括：

1)以微生物基因组DNA为模板，通过PCR克隆苹果酸酶基因；

2)PCR产物经纯化后与克隆载体连接；

3)筛选阳性克隆，培养，提取质粒进行酶切，回收酶切的苹果酸酶基因的DNA片段与表达载体pET28a连接，构建重组表达载体，命名为pET-ME；

4)用PET-ME转化感受态大肠杆菌，通过卡那霉素抗性培养基平板筛选阳性克隆，培养阳性克隆菌，提取重组表达载体pET-ME。

前述的方法，所述的步骤II)具体包括：

1)将所构建的基因工程菌在斜面培养基上培养12-24小时；

2)接入一环斜面培养基上的菌种到种子培养基中，30-37℃有氧培养12-24小时；

3)以1％-10％的体积接种量将发酵种子接入发酵培养基中，发酵温度30-37℃，通过流加碱液，控制pH值在6.0-8.0；

4)发酵过程中通入空气0.2-0.8vvm；搅拌速率100-300rpm；发酵过程中流加甘油使发酵液中底物甘油浓度控制在1-50g/l，发酵40-60小时后停止流加甘油，发酵结束。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明构建的基因工程菌在发酵过程中诱导苹果酸酶过量表达，可促进丙酮酸转化为苹果酸，增强三羧酸循环，为菌体代谢提供更多还原性辅酶NADH及能量ATP，有效提高1，3-丙二醇合成关键酶活性，降低菌体内NAD/NADH比例，使1，3-丙二醇浓度与得率提高，从而提高生产效率，降低生产成本。

附图说明

图1为本发明实施例3苹果酸酶过量表达对克雷伯氏菌KP-pET-ME发酵甘油产1，3-丙二醇的影响。

图2A和图2B为本发明实施例3苹果酸酶过量表达对克雷伯氏菌KP-pET-ME发酵副产物的影响(实验组图2A，对照组图2B)。

图3为本发明实施例4苹果酸酶过量表达对克雷伯氏菌 KPL-pET-ME发酵甘油产1，3-丙二醇的影响。

图4A和图4B为本发明实施例4苹果酸酶过量表达对克雷伯氏菌KPL-pET-ME发酵副产物的影响(实验组图2A，对照组图2B)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。

实施例1基因工程菌的构建

(1)菌种：出发菌种克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae(CGMCC1.9131)；

(2)以克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae(CGMCC1.9131)基因组DNA为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)的方法克隆苹果酸酶基因；克隆引物为：上游引物ME-F：5’-gcgaattcatggatgagcagttaaaacag-3’，下游引物ME-R：5’-cagtcgacttacagcggttcggtttgcg-3’；PCR条件：95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，35个循环，72℃延伸10min。所得苹果酸酶基因PCR产物序列如SEQ ID No.1所示。

(3)把苹果酸酶基因PCR产物基因片段纯化后与克隆载体pMD18-T连接，转化感受态细胞DH5α；

(4)筛选阳性克隆菌，培养，提取质粒，用EcoR I和Sal I酶切，回收，连接经过相同双酶切的表达载体pET28a，构建重组表达载体，命名为pET-ME；

(5)将构建好的重组表达载体pET-ME转化到感受态大肠杆菌DH5α，在卡那霉素抗性培养平板上筛选阳性克隆；

(6)从阳性克隆菌里提取重组表达质粒载体pET-ME，并通过电转化或化学转化法将其转化到克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae(CGMCC1.9131)感受态细胞，鉴定并分离出阳性克隆，即为目的菌株，转化了苹果酸酶基因质粒载体pET-ME后的重组克雷伯氏菌命 名为KP-pET-ME。

实施例2基因工程菌的发酵培养

(1)培养基

LB培养基(g·L^-1)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，琼脂10，调节至pH 7.0，用于克雷伯氏菌菌种的短期保藏及活化。种子及发酵培养基组成见表1：

表1培养基组成

(2)培养方式：

(i)种子活化

从甘油管保藏的实施例1中的重组克雷伯氏菌KP-pET-ME菌种接种至LB培养基斜面活化，温度37℃下培养12小时活化种子。

(ii)种子培养

种子培养：250mL三角瓶9层纱布封口，装液量100mL，接入斜面菌苔一环，摇床中进行好氧种子培养，温度30℃，转速150r·min^-1，培养液中加入50mg/l的卡那霉素抗生素。

(iii)发酵培养

摇瓶发酵培养：250mL三角瓶，100mL发酵培养基，接种量1％，培养温度37℃，150r·min^-1摇床培养，CaCO₃调节pH。为了考察所构建的基因工程菌过量表达苹果酸酶对发酵甘油产PDO的影响，以诱导基因工程菌苹果酸酶过量表达为实验组，以不诱导重组苹果酸酶表达 为对照组，在发酵培养基中加入诱导剂IPTG 0.5mM，发酵12和24小时取样分析结果。

(iv)发酵结果

发酵12和24小时，结果见表2。

表2诱导苹果酸酶过量表达对KP-pET-ME摇瓶发酵甘油产PDO的影响

从摇瓶发酵12小时结果可以得出诱导苹果酸酶过量表达后，1，3-丙二醇得率比对照提高了6.95％，但由于表达重组酶的负担和诱导剂的压力，在发酵的前期，甘油消耗速率和PDO生产强度比对照均有所下降；摇瓶发酵24小时后，底物甘油消耗完全，与对照相比，PDO生产强度提高5.56％，得率比对照提高了5.57％，副产物丁二酸产量增加，乙酸、2，3-丁二醇、乙醇产量下降，乳酸产量比对照略高。

实施例3基因工程菌的发酵培养

采用实施例1构建得到的重组克雷伯氏菌KP-pET-ME菌种进行发酵培养。

(1)培养基：种子培养基组成同实施例2，发酵培养基除初始甘油浓度为20g/l外，其它组成同实施例2。

(2)培养方式：

(i)种子活化，同实施例2；

(ii)种子培养，同实施例2；

(iii)发酵培养

在5L搅拌发酵罐中进行时，装液量4L，接种量1％，通入0.5vvm 空气进行微氧发酵培养，搅拌转速为250rpm。发酵温度恒定在37℃；NaOH调节pH至6.8，发酵过程中体系pH通过流加40％的NaOH溶液调控。待菌株进入对数生长期后进行甘油补料，甘油浓度控制在1-50g/l。实验组在发酵6小时加入诱导剂IPTG 0.5mM，对照组不加入诱导剂。

(iv)发酵结果

发酵进行48小时，1，3-丙二醇及副产物生产情况结果见图1、图2A和图2B及表3。其中，图1为苹果酸酶过量表达对克雷伯氏菌KP-pET-ME发酵甘油产1，3-丙二醇的影响；图2为苹果酸酶过量表达对克雷伯氏菌KP-pET-ME发酵副产物的影响(图2A和图2B分别代表实验组和对照组)。

表3诱导苹果酸酶过量表达对KP-pET-ME流加补料发酵甘油产PDO的影响

从5L搅拌发酵罐流加甘油发酵48小时结果可以得出诱导苹果酸酶过量表达后，促进了菌体对甘油的利用，甘油消耗速率比对照提高7.57％，1，3-丙二醇浓度比对照提高7.90％，1，3-丙二醇生产强度比对照提高7.47％，1，3-丙二醇质量得率与对照相当，但同时促进了副产物丁二酸、乳酸及乙酸的合成。

实施例4基因工程菌的构建及发酵培养

1、基因工程菌的构建

(1)菌种：出发菌种克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae(CGMCC1.9131)敲除乳酸脱氢酶后的工程菌KPL，切断了乳酸代谢途径；

(2)构建重组表达质粒载体pET-ME的过程同实施例1；

(3)将重组表达质粒载体pET-ME，通过电转化或化学转化法将其 转化到克雷伯氏菌KPL感受态细胞，鉴定并分离出阳性克隆，即为目的菌株，转化了苹果酸酶基因质粒载体pET-ME后的重组克雷伯氏菌命名为KPL-pET-ME。

2、发酵过程

(1)培养基：种子培养基同实施例2，发酵培养基除初始甘油浓度为20g/l外，其它组成同实施例2。

(2)培养方式：

(i)种子活化，同实施例2；

(ii)种子培养，同实施例2；

(iii)发酵培养

在5L搅拌发酵罐中进行时，装液量4L，接种量1％，通入0.5vvm空气进行微氧发酵培养，搅拌转速为250rpm。发酵温度恒定在37℃；NaOH调节pH至6.8，发酵过程中体系pH通过流加40％的NaOH溶液调控。待菌株进入对数生长期后进行甘油补料，甘油浓度控制在1-50g/l。实验组在发酵6小时加入诱导剂IPTG 0.5mM，对照组不加入诱导剂。

(iv)发酵结果

发酵进行48小时，1，3-丙二醇及副产物生产情况结果见图3、图4A和图4B及表4。其中，图3为苹果酸酶过量表达对克雷伯氏菌KPL-pET-ME发酵甘油产1，3-丙二醇的影响；图4为苹果酸酶过量表达对克雷伯氏菌KPL-pET-ME发酵副产物的影响(图4A和图4B分别代表实验组和对照组)。

表4诱导苹果酸酶过量表达对KPL-pET-ME流加补料发酵甘油产PDO的影响

从5L搅拌发酵罐流加甘油发酵48小时结果可以得出诱导苹果酸 酶过量表达后，促进了菌体对甘油的利用，甘油消耗速率比对照提高5.52％，1，3-丙二醇浓度比对照提高10.70％，1，3-丙二醇生产强度比对照提高10.50％，1，3-丙二醇质量得率比对照提高4.90％，同时促进了副产物丁二酸及2，3-丁二醇的合成，其中丁二酸浓度提高28.03％；由于乳酸脱氢酶缺失，乳酸产量没有明显变化。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。