利用柠檬酸废水生产类球红细菌微生物肥料的方法

摘要

本发明公开了一种利用柠檬酸废水生产类球红细菌微生物肥料的方法，属于微生物领域。该方法包括a、先用清水稀释柠檬酸废水至COD浓度12000～15000mg/L，再用氢氧化钠水溶液调节pH到6.5-7.5，于115～126℃灭菌10～35分钟；b、向装有上述柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的类球红细菌，于30～37℃，120～200转/分振荡培养24～48小时，得到液体种子；c、以2％～20％的体积比向装有上述柠檬酸废水发酵罐中接种上述液体种子，于25～37℃通无菌空气培养12～48小时，得到发酵液；d、上述培养好的发酵液经分光光度计测定OD660值1.0～1.5或细菌计数达至10

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地说是一种利用柠檬酸废水生产类球红细菌微生物肥料的方法。

背景技术

柠檬酸作为一种重要的化工原料和食品添加剂被广泛应用，其生产是以薯干或玉米为原料，依次经原料处理、发酵、提取、精制等工序制得产品。柠檬酸废水主要来自发酵和提取工序产生的中和液、洗糖水、洗罐水和洗滤布水，COD浓度多为15000～25000mg/L，属于高浓度有机废水。据统计，每生产1吨柠檬酸，产生高浓度废水7.5～15吨。直接排放会对环境将造成严重污染，处理达标排放费用高昂。

类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)属于细菌域中紫色细菌群的α亚群，具有广泛的代谢方式，可以在多种生长条件下生长。如它具有广泛的能量代谢机制，包括：光合作用、无机营养、好氧和厌氧呼吸等。它还可以固定氮分子，合成重要生物活性物质四吡咯(tetrapyrroles)、叶绿素(chlorophylls)、血红素(heme)、维生素B12等(http://mmg.uth.tmc.edu/sphaeroides/introduction/introduction.html)。

大量研究文献表明，类球红细菌已经成为一种非常有工业化开发潜力的微生物(赵凯，于影，姜丹等.1株类球红细菌及其降解敌敌畏的特性。环境科学，2009，30(4)：1199-1204)。已有多篇文章报道了利用类球红细菌发酵生产5-氨基乙酰丙酸(ALA)；ALA可促进植物叶绿素合成，增强植物抗逆性，促进植物生长。用类球红细菌来生产辅酶Q10的文献也很多；辅酶Q10是人体内具有重要作用的辅酶之一，又称泛醌，它在体内呼吸链中质子移位及电子传递中起重要作用，是细胞呼吸和细胞代谢的激活剂，也是重要的抗氧化剂和非特异性免疫增强剂，已经广泛应用于临床药物、保健品和化妆品。还有文献报道了类球红细菌发酵生产类胡萝卜素、氢气等。我们也发现了类球红细菌促进植物生长的特性。鉴于类球红细菌的巨大应用潜力，美国休斯顿得克萨斯大学健康科学中心微生物学和分子遗传学系的研究人员已经开展了类球红细菌基因组计划研究，测序工作已经于2005年完成，功能基因研究也取得了长足进展。

类球红细菌的培养方法有多种，如：中国专利(专利号：200510132627.3)中公开了一种类球红细菌的生产方法，其培养基以乳酸为主要碳源，添加少量无机盐、微量元素和生长因子，实现了工业化发酵培养规模。中国专利(申请号：200810116206.5)中公开了一种利用类球红细菌生产辅酶Q10的方法，其培养基以葡萄糖、白砂糖和玉米浆为碳源，添加少量无机盐，实现了辅酶Q10的高产率。而以柠檬酸废水为主要培养基原料，培养类球红细菌的方法未见文献报道。

发明内容

本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供一种能够资源化利用柠檬酸废水生产类球红细菌微生物肥料的方法。

本发明所使用的菌株是由发明人分离筛选出来的一株高效促进植物生长的类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)菌株，该菌株于2010年4月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.3757，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

本发明的技术任务是按以下方式实现的：利用柠檬酸废水生产类球红细菌微生物肥料的方法，其特点是，该方法包括以下步骤：

a、柠檬酸废水预处理：

先用清水稀释柠檬酸废水至COD浓度12000～15000mg/L，再用氢氧化钠水溶液调节柠檬酸废水pH到6.5-7.5，于115～126℃灭菌10～35分钟；

b、液体种子制备：

向装有上述预处理好的柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的类球红细菌，于30～37℃，120～200转/分振荡培养24～48小时，得到液体种子；

c、液态发酵：

以2％～20％的体积比向装有预处理好的柠檬酸废水发酵罐中接种上述液体种子，于25～37℃通无菌空气培养12～48小时，得到发酵液；

d、后处理：

上述培养好的发酵液经分光光度计测定OD660值1.0～1.5或细菌计数达至10⁹～10¹⁰CFU/mL后包装，即得类球红细菌微生物肥料成品。

进一步的：

步骤a中所用清水是指自来水或井水。

步骤b中氢氧化钠水溶液的浓度为12-20N。

本发明的利用柠檬酸废水生产类球红细菌微生物肥料的方法与现有技术相比具有以下突出的有益效果：

(一)利用柠檬酸废水生产微生物肥料，变废为宝，既降低了肥料生产成本，又节省了废水处理的高额费用，节能环保，具有巨大的社会效益及经济效益；

(二)该方法制备的微生物肥料能够促进作物对养分的吸收和利用，减少化肥的使用量，从而改善农田环境质量，提高农产品的品质。

附图说明

附图1是本发明方法所制备微生物肥料所做对比实验(实验例二)的效果图；

附图2是本发明方法所制备微生物肥料所做对比实验(实验例三)的效果图。

具体实施方式

以具体制备实施例、实验例对本发明的利用柠檬酸废水生产类球红细菌微生物肥料的方法作以下详细地说明。

制备实施例一：

以取自江苏宜兴协联生物化学有限公司3#管道柠檬酸废水为原料。废水COD为18000mg/L。

生产步骤：

a、柠檬酸废水预处理：

先用自来水稀释柠檬酸废水至COD浓度15000mg/L，再用浓度为12N的氢氧化钠水溶液调节废水pH到6.5-7.5，于121℃灭菌20分钟。

b、液体种子制备：

向装有上述预处理好的柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的类球红细菌，于32℃，150转/分振荡培养30小时，得到液体种子。

c、液态发酵：

向装有预处理好的柠檬酸废水发酵罐中接种10％(体积比)的液体种子，于32℃通无菌空气培养30小时。

d、后处理：

培养好的发酵液经分光光度计测定OD660值1.22；细菌计数5×10⁹CFU/mL，包装即得类球红细菌微生物肥料成品，于避光、阴凉处保存。

制备实施例二：

以取自宜兴市协联生物化学有限化工有限公司的1#管道檬酸废水为原料，废水COD为21000mg/L。

生产步骤：

a、柠檬酸废水预处理：

先用井水稀释柠檬酸废水至COD浓度14000mg/L，再用18N氢氧化钠水溶液调节废水pH到6.5-7.5，于116℃灭菌30分钟。

b、液体种子制备：

向装有上述预处理好的柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的类球红细菌，于35℃，180转/分振荡培养40小时，得到液体种子。

c、液态发酵：

向装有预处理好的柠檬酸废水发酵罐中接种15％(体积比)的液体种子，于35℃通无菌空气培养36小时。

d、后处理：

培养好的发酵液经分光光度计测定OD660值1.4；细菌计数至8×10⁹CFU/mL包装，即得类球红细菌微生物肥料成品，于避光、阴凉处保存。

实验例一；

以制备实施例一所得类球红细菌微生物肥料及尿素为肥料进行对比实验。

采用蔬菜大棚小区实验，设置12个条件完全相同的实验小区，每个小区60m²，种植油菜，在油菜幼苗期，保留3个不施肥小区；3个小区按照50L/亩的施肥量在油菜完全发芽后和3周后各施用类球红细菌微生物肥料一次；3个小区按照15kg/亩的施肥量在油菜完全发芽后和3周后各施用尿素一次；3个按照15kg/亩的施肥量在油菜完全发芽后和3周后各施用尿素一次，并在每次施用尿素后1天按照50L/亩的施肥量施用微生物肥料一次，各小区相同的灌溉和管理方式。油菜生长5周后调查产量和品质。单独施用微生物肥料和单独施用尿素的油菜产量基本一致，都比不施肥的小区增产50％左右，两种肥料都施用的比只施用1种的增产30％左右，单独施用尿素的油菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量分别比不施肥油菜高出50％和20多倍，而单独施用微生物肥料和两种肥料都施用的油菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量与不施肥油菜中的相当。表明该微生物肥料既有良好的增产效果，又可以明显提高油菜的品质。

实验例二：

实施例一制备的类球红细菌微生物肥用于萝卜生长实验

实验地点：宜兴市太华农场

试验时间：2010.09.08--11.20

土壤条件：粘性黄棕壤保护地

施肥背景：每亩施入土杂肥2000kg

实验方法：共设6个实验小区；3个对照小区，每个小区20平方。

实验组每个小区用撒特利三元复合肥2kg+类球红细菌微生物肥500ml(兑水50倍)一同施入土壤，划锄均匀后播种。对照组每个小区用同等量的复合肥和水，划锄均匀后播种。

于11月20日收获后称重计算产量，结果如下：

对照小区平均产量为98.4kg，实验组平均产量为132.2kg，平均比对照组提高产量34.9％，而硝酸盐、亚硝酸盐含量比对照组分别下降1.8倍和19.6倍，且明显改善萝卜的口感和外观质量，表明该肥有显著增产和改善萝卜品质的效果。

对比实验效果如附图1所示。

实施例三：

实施例二制备的类球红细菌微生物肥用于苋菜生长实验

实验地点：江苏宜兴市万石镇

实验时间：2010年4月4日——5月30日

土壤背景：建筑工地回填土，属黄棕粘性土壤，共设6个小区，每个小区20平方，其中三个实验，三个对照。

对照组与实验组全部都以金山牌复合肥(每个小区使用1kg)作为基肥，于4月4日播种；

于5月6日进行喷施试验；实验组每个小区用类球红细菌微生物肥50ml兑水50倍喷施；对照小区用同样量的清水喷施，25天后贴地割菜称重。

结果：实验组每个小区平均收菜41.6kg，对照组平均每个小区29.7kg，增产40％，具有显著的增产效果，其硝酸盐、亚硝酸盐含量实验组比对照组下降1.5倍和16倍，明显提高了苋菜的品质。

对比实验效果如附图2所示。