一种土壤和沉积物总DNA提取方法及提取试剂盒

摘要

本发明涉及一种土壤和沉积物总DNA提取方法及提取试剂盒，即首先应用腐殖酸溶解液，最大程度地溶解和去除土壤和沉积物中的腐殖酸，再将剩余腐殖酸进行络合沉淀，然后无选择地裂解释放细菌体内的基因组DNA，离心后去除溶液中的络合腐殖酸和蛋白质，而含DNA的上清溶液则通过酸碱调节试剂和高盐溶液调节后，以硅胶吸附膜特异吸附而使基因组DNA得以纯化回收。本发明的方法可以在较短时间内同时提取多个样品，正常操作时间小于70min，可以获得高纯度、适合下游分析的大量DNA样品。依据本发明方法建立的试剂盒获得的DNA样品纯度高，无降解，可直接用于后续分子生物学分析，同时避免了传统DNA提取方法需要酚/氯仿等毒性试剂纯化DNA的步骤，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于土壤微生物基因组DNA分离纯化技术领域，具体涉及一种土壤和沉积物总DNA提取方法及提取试剂盒。

背景技术

分子指纹图谱技术已经成为微生物生态学、环境生物学、环境工程学等领域普遍应用的微生物生态学技术，然而环境样品中(如土壤、海洋和湖泊沉积物等)总DNA的提取技术作为该技术体系的关键步骤和核心内容，已经受到人们的广泛关注。土壤和沉积物中总DNA提取的特异性、浓度、纯度等直接影响到微生物群落结构的客观真实性，是近年来国外期刊审稿过程中争议较多的内容之一。

目前，对于从土壤和沉积物中获取总DNA，仍没有一致认同的较佳方法，而普遍应用的酶裂解法、化学药品提取法等只能针对样品中的敏感菌起作用，而且无法去除样品中的腐殖酸。这些方法均人为的改变了环境中真实的微生物群落结构，且存在以下问题：1)DNA提取过程繁杂，时间过长，且需要较多的大型仪器设备，如酶提取法需要长时间的水浴过程；2)一般DNA提取过程往往应用高毒高污染的化学试剂，如DNA纯化过程中应用酚/氯仿等“三致”试剂；3)提取的DNA质量较差，碎片较多，存在腐殖酸、RNA、蛋白质等污染；4)DNA的量太少，尤其是从沉积物中获取DNA，无法满足下游实验的需要。因此，建立一种有效的从土壤和沉积物中提取总DNA的方法已成为当务之急。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速从土壤和沉积物中获得总DNA的方法，并提供成套的试剂盒新产品，应用该试剂盒，研究者可以快速从环境样品中获得需要的DNA，以进行后续的分子生物学研究。

本发明首先应用腐殖酸溶解液，最大程度地溶解和去除土壤和沉积物中的腐殖酸，再将剩余腐殖酸进行络合沉淀，然后无选择地释放所有细菌体内的DNA，离心后去除溶液中的络合腐殖酸和蛋白质，而含DNA的上清溶液则通过高盐溶液调节后，以硅胶吸附膜特异吸附得以纯化回收。

本发明的土壤和沉积物总DNA提取方法，依次包括如下步骤：

1)用腐殖酸溶解液去除样品大部分腐殖酸，得到沉淀；

2)向上述步骤1)的沉淀样品中加入腐殖酸络合剂，悬浮起沉淀使剩余的腐殖酸充分络合，离心使腐殖酸络合物和细菌样品充分沉淀；

3)向上述步骤2)的沉淀中加入细胞裂解液，漩涡振荡释放出细菌总DNA，离心后得到含细菌总DNA的上清液；

4)向上述步骤3)的上清液中加入酸碱调节剂，离心得到去除蛋白质和糖类物质的上清溶液；

5)向上述步骤4)的上清溶液中加入高盐溶剂后，过硅胶吸附膜吸附DNA；

6)将上述步骤5)吸附的DNA进行清洗后，用洗脱液洗脱得到样品的总DNA。

上述的腐殖酸络合剂为钙离子水溶液，优选为氯化钙溶液，为0.20mol/L，pH 5.5～7.5；且土壤或沉积物样品的湿重同钙离子的添加比例为1.5g/mmol/L。

上述的酸碱调节剂为0.5～1.5mol/L醋酸钾，pH 4.8～5.0，具有调节溶液体系至酸性，以进一步沉淀腐殖酸和糖类物质，以及变性蛋白质的作用。

上述的步骤3)漩涡振荡释放时间为10～12min。

根据上述的提取方法建立的提取试剂盒，包括如下组分：

1)腐殖酸溶解液和海砂，其中海砂直径为1～2mm，海砂和腐殖酸溶解液的质量体积比为0.2～0.3g/mL；

2)腐殖酸络合剂：0.20mol/L氯化钙溶液，pH 5.5～7.5

3)细胞裂解液：50～100mmol/L Tris-HCl，1.5～3.5mol/L NaCl，1％～3％CTAB，pH 8.0～10.0；

4)变性剂：20％SDS，pH 9.0；

5)酸碱调节剂：0.5～1.5mol/L醋酸钾，pH 4.8～5.0；

6)高盐溶剂：3.0～6.0mol/L盐酸胍，pH 5.0～8.0；

7)清洗液：70％乙醇；

8)洗脱液：2～10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0～9.0；

9)基因组DNA吸附柱：包含硅胶吸附膜内柱的2mL离心管套装。

依据本发明的方法建立的试剂盒可以在70min时间内同时提取多个样品，获得的DNA样品纯度高，无降解，可直接用于后续分子生物学分析，同时避免了传统DNA提取方法需要酚/氯仿等毒性试剂纯化DNA的步骤，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：应用本发明试剂盒提取的不同土壤样品DNA电泳结果图。

图2：不同土壤样品DNA 16S rRNA基因PCR扩增电泳结果。

图3：不同土壤样品DNA 16S rRNA基因V3区PCR扩增电泳结果。

图4：不同土壤样品DNA氨氧化菌特异序列PCR扩增电泳结果。

其中，M为marker，各片段标注于图右；1，2，3和4分别为农田土、草地土、湿地土、海洋沉积物，C为阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细描述。

本发明从土壤和沉积物中获得总DNA的方法，依次包括如下步骤：

1)用海砂和腐殖酸溶解液来处理样品，离心得到去除了大部分腐殖酸的沉淀样品：

取0.3g直径1～2mm海砂于2mL的离心管中，进行高压蒸汽灭菌，加入1.0～1.5mL灭菌的腐殖酸溶解液(100～200mmol/L Tris，50～100mmol/LNa₄P₂O₇，50～100mmol/L Na₂EDTA，1.0～3.0％PVP，100～200mmol/L NaCl，0.05～0.1％Triton X-100，pH 8.0～10.0)，置于室温备用；

将土壤或沉积物样品0.3g加入到装有腐殖酸溶解液和海砂的离心管中，中速涡旋振荡1～3min，完全混匀，使土壤样品中的腐殖酸充分释放出，然后10000×g离心30s，尽量吸弃上清，得到沉淀样品；

2)向上述步骤1)的沉淀样品中加入腐殖酸络合剂，悬浮起沉淀使剩余的腐殖酸充分络合，离心使海砂、腐殖酸络合物和细菌样品充分沉淀：

向上述步骤1)的沉淀样品加入1mL 0.20mol/L氯化钙溶液，pH 5.5～7.5，然后中速涡旋1～3min，完全混匀，10000×g离心30s，尽量吸弃上清，得到含有DNA的沉淀。

钙离子可以与带负电荷的大分子有机物络合，形成不溶性沉淀，腐殖酸、蛋白质和DNA等在中性条件下均为带负电荷的大分子有机物，但此时细菌细胞尚未破碎，DNA还未释放，所以加入的钙离子仅与腐殖酸络合形成不溶性沉淀。而其它腐殖酸络合试剂，由于不能与腐殖酸形成稳定的络合物沉淀，在后续的细胞裂解中又会使腐殖酸进入样品体系中。本发明需要选用水溶性好的钙盐，优选氯化钙溶液。

另外，加入的腐殖酸络合剂中的钙离子浓度也对DNA提取产生重要的影响。钙离子浓度过低，将使样品中腐殖酸络合不全，而过高又将残存过多，影响后续DNA的产量和质量。本研究表明，在步骤1)中，取0.3g土壤或沉积物的条件下，加入1mL 0.2mol/L氯化钙溶液(即样品湿重和钙离子的比例为1.5g/mmol/L)就可以将剩余腐殖酸完全络合，而对DNA产量影响较小。

3)向上述步骤2)的沉淀中加入细胞裂解液和变性剂并漩涡振荡释放出细菌总DNA，离心后得到含细菌总DNA的上清液：

沉淀中加入720μL细胞裂解液50～100mmol/L Tris-HCl，1.5～3.5mol/LNaCl，1％～3％CTAB，pH 8.0～10.0；和80μL变性剂20％SDS，pH 9.0，最大速度漩涡振荡10～12min，10000×g离心60s，将上清液(＜650μL，避免吸取上层气泡)转移到一个新管内；

4)向上述步骤3)的上清液中加入酸碱调节剂，离心得到去除蛋白质和糖类物质的上清溶液：

加入100μL酸碱调节剂0.5～1.5mol/L醋酸钾，pH 4.8～6.0；颠倒5次混匀，4℃静置5min，10000×g离心60s，上清(＜700μL)移至新管；

步骤3)中获得的上清液小于650μL，加入的酸碱调节剂为100μL，即为得到较理想的酸盐调节效果，二者的体积比需大于6.5。

5)向上述步骤4)的上清溶液中加入高盐溶剂后，过硅胶吸附膜吸附DNA：

向步骤4)的上清溶液中加入1400μL高盐溶剂：3.0～6.0mol/L盐酸胍，pH5.0～8.0；混匀后，分三次(每次取700μL)加入同一硅胶吸附膜吸附DNA，10000×g离心30s；

向上述步骤4)获得的上清溶液中，加入高浓度的盐溶液与DNA分子竞争有效水分时，DNA分子将被析出而与有机相中的硅胶吸附膜结合。盐酸胍具有盐的特性，同时可以高浓度溶解于水，这是其他盐类无法比拟的，这也是本发明应用高浓度盐酸胍的原因。

6)将上述步骤5)吸附的DNA进行清洗后，用洗脱液洗脱得到样品的总DNA：

加入700μL70％乙醇，10000×g离心60s，去除滤过液后，再离心一次，将吸附柱置于新管，然后用100μL洗脱液：2～10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0～9.0加入到吸附柱中，于60℃水浴5min，10000×g离心60s，收集滤过液，于-20℃保存。

本发明的提取试剂盒包括如下的组分：

1)腐殖酸溶解液和海砂，其中海砂直径为1～2mm，海砂和腐殖酸溶解液的质量体积比为0.2～0.3g/ml；

2)腐殖酸络合剂：0.20mol/L氯化钙溶液，pH 5.5～7.5；

3)细胞裂解液：50～100mmol/L Tris-HCl，1.5～3.5mol/LNaCl，1％～3％CTAB，pH 8.0～10.0；

4)变性剂：20％SDS，pH 9.0；

5)酸碱调节剂：0.5～1.5mol/L醋酸钾，pH 4.8～5.0；

6)高盐溶剂：3.0～6.0mol/L盐酸胍，pH 5.0～8.0；

7)清洗液：70％乙醇；

8)洗脱液：2～10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0～9.0；

9)基因组DNA吸附柱：包含硅胶吸附膜内柱的2ml离心管套装。

应用本试剂盒，仅需要常规非冷冻型的高速离心机、漩涡振荡器、水浴锅及微量移液器等一般微生物学、分子生物学等实验室都具备的简单设备，对于熟练研究者，同时提取6个样品DNA时间可缩短至70min之内，极大的节省了科研工作者宝贵的时间，同时可获得高质量的DNA样品，对下游的分子生物学操作无抑制，表现出极大的应用潜力。通过对农田土、草地土、湿地土、海洋沉积物中总DNA的提取试验，均得到理想的结果，并且不影响PCR扩增等后续分子生物学分析。

实施例1：腐殖酸络合剂浓度的选择

应用本试剂盒，以湿地土、海洋沉积物和农田土为对象，探讨腐殖酸络合剂浓度对提取效率的影响。样品量为0.3g，其中氯化钙溶液浓度分别为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mol/L，各加入1ml，按照本发明的方法进行提取，用时约60min。将提取的DNA进行电泳、染色、照相，并应用紫外分光光度计进行定性定量分析。结果表明，氯化钙溶液浓度分别为0和0.1mol/L时(即样品湿重和钙离子的比例≥3g/mmol)，虽然DNA的回收率较高，为10～15μg/g干土，但提取的DNA溶液为黄色，含有大量腐殖酸，表明腐殖酸没有被完全去除，加入的氯化钙相对量过低，这样的DNA样品将对分子生物学实验中的酶具有极大的抑制作用。同样，应用浓度为0.3mol/L以上(即样品湿重和钙离子的比例≤1g/mmol/L)的氯化钙溶液为腐殖酸络合剂时，虽然DNA溶液透明清澈，但DNA回收率过低，电泳时低于检测限值，紫外检测表明低于100ng/g干土，这表明过高的氯化钙溶液残留太多，也络合了大量的DNA分子，这样的DNA样品无法满足后续分子生物学需要。而加入1mL 0.2mol/L氯化钙溶液(即样品和钙离子的比例为1.5g/mmol/L)时，不但提取的DNA浓度高(5～7μg/g)，而且质量能够满足文库构建、变性梯度凝胶电泳(DGGE)等后续分子生物学的要求。

实施例2：细菌细胞裂解漩涡振荡时间选择

应用本试剂盒，分别以0.3g湿地土、农田土为对象，对加入细胞裂解液和变性剂后的漩涡振荡时间做了优化。其中腐殖酸络合剂用1ml的0.2mol/L的氯化钙溶液，pH 7.5，细胞裂解时的漩涡振荡时间分别选择5min，10min，15min，按照本发明的方法进行提取，用时约70min。DNA电泳、染色、照相，并应用紫外分光光度计进行定性定量分析。结果表明，振荡5min的环境样品DNA回收率明显偏低，低于1.0μg/g干土；而高于15min后，DNA回收率并无明显增加，且出现了大量的DNA碎片，这对于需要长片段基因组DNA的分子生物学实验是不允许的，所以振荡时间选取10～12min为宜。

实施例3：从不同土壤样品中提取总DNA

应用本试剂盒和确定的提取条件，分别对农田土、草地土、湿地土、海洋沉积物中总DNA进行提取试验，按照本发明的方法进行提取，用时约60min。取10μL DNA进行电泳，凝胶以EB染色，凝胶成像系统照相，并应用紫外分光光度计进行定性定量分析，电泳结果如图1所示。根据该图，该试剂盒可从不同土壤和沉积物中获得的总DNA，DNA片段长度在10～20kb，没有降解，也没有RNA污染。分别对各样品进行紫外吸收检测，表明所获得的DNA样品在260nm处形成均一的DNA吸收峰，在280nm处没有明显的蛋白吸收峰出现，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.8～1.9，说明获得的DNA比较纯净，没有蛋白和RNA污染，计算得知DNA的回收率为5～12μg/g干土。

为确认应用本试剂盒提取DNA质量能否满足分子生物学需要，以获得的DNA为模板，分别应用细菌16S rRNA基因全长的通用引物8F/1541R、变性梯度凝胶电泳(DGGE)常用的16S rRNA基因V3区特异引物341F/534R，以及氨氧化细菌特异的16S rRNA基因引物CTO189f/CTO654r进行PCR扩增。PCR结束后，取5μL电泳，结果分别如图2，图3和图4。图2显示以8F/1541R为引物获得接近全长的16S RNA基因，约1500bp，浓度大约为10ng/tL。该产物纯化后可用于16S rRNA基因文库的构建，以解析环境中微生物的种类、组成与比例。图3显示各样品均获得了约200bp目标序列，浓度大约为20ng/μL，可用于DGGE分析，以解析微生物群落的结构及动态。图4显示以TO189f/CTO654r为引物进行PCR后，各样品均得到了长度约500bp目标序列，浓度大约为10ng/μL。可见，应用本试剂盒，可以从土壤、沉积物样品中提取高质量的DNA，能够满足下游分子生物学的需要。