一种植物根系分泌物的化感潜力的生物测定方法

摘要

本发明是一种植物根系分泌物的化感潜力的生物测定方法，属生物测定技术领域。该方法用水配制浓度≤0.3％的琼脂液，灭菌后倒入培养皿；对供体植物进行消毒后播种于培养皿中，封盖放置在25～28℃的培养室12小时光/暗条件培养10～14天，第11～15天移除所有供试植物；对受体植物相同消毒后播种在移除了所有供体植物的培养皿中，封盖放置在25～28℃的培养室12小时光/暗培养5～7天后取出受体植物测量生长量，与未受供体植物影响的受体植物的生长量作为对照计算植物根系分泌物对受体植物生长的影响情况进行化感潜力评价。本发明的特色是排除了植物种间对水分、养分的竞争作用，充分反应供体植物根系分泌物对受体的作用。

说明书

技术领域

本发明属生物测定技术领域，具体涉及以植物根系分泌物的化感潜力评价的生物测定方法。

背景技术

生物间的相生相克现象自古就为人类所认识，但直到1937年才被奥地利植物生理学家Hans Molisch正式命名为“化感作用”(allelopathy)，定义为所有植物、微生物间的抑制与促进的生化互作；1996年国际化感协会(International Allelopathy Society)作了最新的定义：生物个体通过向环境释放化合物影响其周围其他生物生长发育的作用。植物化感作用是植物对环境适应的一种化学表现形式，植物通过根系分泌物——“化感物质”影响其他植物的作用是化感作用的一个组成部分，也是植物自身防御或抗逆能力的表现。植物化感作用的研究是以探明化感作用的本质为中心，阐明植物种间和种内化学作用关系。利用植物体在生态系统中的这种自身防御或抗逆能力，可以减少化学农药的使用，减少生产成本投入，降低环境压力，因此生物体化感潜力的发掘与利用是一种资源节约、环境友好的有害生物控制新途径。

化感作用已成为当今生物科学的一个重要研究方向，也是促进农业可持续发展的重要组成部分。筛选和评价化感作用潜力是化感作用研究的第一步，需要采用简单、快速、准确的生物测定方法进行筛选评价。我国植物化感研究自1995年以来发展迅速，由于评价方法不一致，影响了评价的准确性，甚至同样的评价方法而评价结果相互矛盾。1985年以来，国内外的科学家研究报道了许多化感作用潜力的生物测定方法，如水培测定^[1]、阶梯测试法^[2]、国际水稻研究所的稗草迟播法^[3]、日本科学家的琼脂根箱法^[4]和三明治法^[5]、植株水浸提液法^[6，7]、澳大利亚科学家的琼脂共培养法^[8]等。水培法、阶梯法尽管测定的结果直接与植物的根系分泌物相关，但操作过程是在半封闭的条件下进行，存在微生物的干扰，所得到的结果受到微生物代谢影响的可能性极大；植物水浸提液法采用植物地上部分或地下部分的水提取液，其测定结果反应的是植物体内所含有的水溶性物质，并不能代表为该植物向环境中释放的化学物质；迟播法、根箱法中供体植物与受体生物共同生长，其间存在的竞争关系无法排出，更何况迟播法的两种生物播种时间、生长期不同，人为给予了对供体植物有利的条件。在以上这些方法中，由于不同的植物材料要求采用的方法不同，造成结果间没有平行可比性，而且这些方法在应用中存在着准确性不高的问题。因此，在化感作用潜力的评价中仍需要一种能直接反应根系分泌物生物活性、经济、可靠的生物测定方法^[9，10]。

琼脂法是采用琼脂作为介质，供体植物与受体植物同时生长在一个培养系统中一段时间后测定受体植物的生长量进行化感潜力评价，琼脂共培养法是澳大利亚科学家报道的一种生物测定方法，与琼脂法极为相似，但要进行灭菌处理，而且培养系统分隔成两个部分，供体植物和受体植物分别生长在不同的部分中，其目的是排除微生物的干扰和两种植物共同生长时的竞争作用。琼脂法以及琼脂共培养法具有简便、快速的特点，琼脂法的缺点在于物种之间的竞争作用不能排除，如果没有在无菌条件下操作、培养还存在微生物的干扰；琼脂共培养法存在的最大缺陷或不足在于根系分泌物在介质中分布的不均匀性，增加生测结果的误差、重演性下降。因此我们以琼脂法、琼脂共培法和迟播法为基础，进行改进形成了本发明的植物根系分泌物化感潜力生物测定方法。

本发明是针对植物化感作用潜力评价生物测定的需要，根据植物种子萌发生长的特性，以提供足够的温、光、水条件，排除植物种间竞争作用，严格控制可能的微生物干扰，直接反应根系分泌物生物活性为前提，通过综合分析、改进现有的常用的生物测定方法而发明的一种简便、快速、经济、准确的生物测定方法。

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发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的(1)琼脂共培养法中根系分泌物在介质中分布的不均匀性，(2)琼脂法、迟播法所存在的植物种间竞争、根系分泌物在环境中受到微生物影响的技术问题，其发明目的是为植物种质资源根系分泌物化感潜力的评价提供一种简便、快速、准确性高的生物测定方法。

为解决上述技术问题，本发明所提供的一种植物根系分泌物化感潜力的生物测定方法是：

1、培养基制备，用水配制以质量分数计的浓度为≤0.3％的琼脂液，将所述的琼脂液高压灭菌后倒入培养皿中待用；

2、供体植物A的种子表面消毒和种植，所述的供体植物A的种子表面消毒是用容积分数为3～6％次氯酸钠对供体植物A进行种子表面消毒，然后将供体植物A种子均匀播种于步骤1所述的培养皿中，封盖后将培养皿放置在25～28℃的培养室内，12小时光/暗条件培养10～14天，第11～15天移除所有的供试植物A；

3、受体植物B的种子表面消毒和种植，供体植物和受体植物的个体数量一致，所述的受体植物B的表面消毒与步骤(1)相同，将消毒后的受体植物B均匀播种在移除了所有的供体植物A的培养皿中，封盖后将该培养皿放置在25～28℃的培养室内，12小时光/暗培养5～7天后，从培养皿中取出受体植物B，测量受体植物B的生长量，以受体植物B的生长量测定值作为生长影响计算、评价的参数；

4、对照处理，将受体植物B的种子按步骤3进行种子表面消毒后直接种植在步骤1所述的培养皿中，封盖后该培养皿放置在25～28℃的培养室内，12小时光/暗培养5～7天后，从培养皿中取出受体植物B，测量受体植物B的生长量，以对照植物的生长量测定值作为生长影响计算、评价的参数；

5、植物根系分泌物化感潜力的计算，植物根系分泌物化感潜力的计算公式为IR＝(1-Tr/ck)×100，其中Tr表示在供体植物A影响下的受体植物B的生长量测定值，ck表示作为对照的受体植物B的生长量测定值，IR表示供体植物A对受体植物B的影响作用，当IR＜0时，表示供体植物A的根系分泌物对受体植物B的作用为刺激生长；当IR＞0时，表示供体植物A的根系分泌物对受体植物B具有抑制作用；当IR＝0时，表示供体植物A的根系分泌物对受体植物B没有活性或表示两种植物间无化感作用存在。

所述的生长量测定是测量受体植物B的主根长。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明采用≤0.3％的琼脂水溶液，其状态介于水和固体之间，有助于根系分泌物在介质中分布的均匀性，同时为供体植物、受体种子萌发、生长提供足够的水分条，以及根系生长的固着、支撑作用；

2、本发明所有操作在无菌条件下进行最大限度地控制了微生物的干扰以及微生物可能对化感物质的分解作用；

3、本发明供体植物所产生的根系分泌物完全滞留在培养皿中，而供体植物与受体植物在相同的基质和生长条件下分别生长，排除了植物种间对水分、养分的竞争作用，充分反应供体植物根系分泌物对受体的作用。

4、本发明方法与迟播法相比，排除了植物种间共同生长的竞争作用，直接反应植物根系分泌物对其它生物的影响作用，具有准确的特点，非常适于实验室的植物种质资源的大量筛选评价工作。

5、本发明是一种有效、经济、快速、准确的实验室植物根系分泌物化感潜力评价方法。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形成、如所采用的试验植物材料种类、数量、培养器皿进行替换、改动，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1本发明实施例

试验材料：为水稻和稗草，其中水稻是供体植物分别采用(1)Kouketsumochi，是已报道过的化感品种；(2)Lemont，是已报道的非化感品种；(3)PI312777，是已报道过的化感品种)；(4)YAAS11002，为非洲栽培稻，具有较强的竞争能力；(5)云陆28，为陆稻品种，具有较强的竞争能力；(6)紫糯，为云南地方稻种，具有较好的抗逆性；(7)黄壳糯，为云南地方稻种；(8)维系红谷，为云南地方水稻品种，具有较强的耐冷性；(9)维系紫谷，云南地方水稻品种，具有较强的耐冷性。受体(靶标)植物为稗草。试验重复3次。

本发明实施例试验步骤如下：

1、培养基制备，用水配制以质量分数计的浓度为0.3％的琼脂水溶液，高压灭菌后倒入培养皿中待用；

2、供体植物A为不同品种的水稻种子，用容积分数为6％的次氯酸钠对供体植物A的种子进行表面消毒，然后将不同品种水稻种子分别均匀播种于步骤1所述的培养皿中，15粒每皿封盖后将培养皿放置在25～28℃的培养室内，12小时光/暗条件培养，3天后检查培养皿中的水稻种子，将没有萌发的种子剔除，在培养皿中保留10粒水稻放回培养室继续生长，至播种后第15天移除所有的水稻；

3、受体植物B为稗草种子，用容积分数为6％次氯酸钠对稗草种子进行表面消毒，将消毒后的受体植物稗草20粒均匀播种在移除了所有的供体植物A的培养皿中，封盖后将该培养皿放置在25～28℃的培养室内，12小时光/暗培养，稗草播种后第3天检查稗草萌发情况，剔除未萌发的种子，在培养皿中保留10粒稗草封盖后放回培养室继续生长。稗草播种7天后从培养皿中取出受体植物稗草，测量受体植物稗草的主根长度，作为生长影响评价计算的参数即受体植物稗草的生长量测定值Tr；

4、对照处理，为受体植物稗草按步骤3进行种子表面消毒后直接种植在步骤1所述的培养皿中，每皿20粒，封盖后将该培养皿放置在25～28℃的培养室内，12小时光/暗培养，第3天检查稗草萌发情况，剔除未萌发的种子，在培养皿中保留10粒稗草封盖后放回培养室继续生长。稗草播种7天后从培养皿中取出受体植物稗草，测量受体植物稗草的主根长度，作为生长影响评价计算的参数即受体植物稗草的生长量测定值ck；

5、植物根系分泌物化感潜力的计算，植物根系分泌物化感潜力的计算公式为IR＝(1-Tr/ck)×100，其中Tr表示在供体植物水稻移除后种植受体植物稗草的主根生长的测定值，ck表示无供体植物水稻生长条件下的受体植物稗草的主根生长的测定值。

6、测定、计算结果见表1。

表1本发明方法对水稻化感潜力的评价结果

 供体植物名称  Tr(cm)  本发明方法(IR)  化感潜力排名 Kouketsumochi  3.33  11.67  8 Lemont  3.72  1.33  9 PI312777  3.28  13.00  7 云陆28  2.73  27.59  5 YAAS 11002  2.71  28.12  4 紫糯  3.1  17.77  6 黄壳糯  2.43  35.54  3 维西红谷  1.47  62.01  1 维西紫谷  1.7  54.91  2 ck(cm)  3.77  0

从评价结果看，采用的供体植物的根系分泌物化感潜力由大至小的顺序为维系红谷、维系紫谷、黄壳糯、YAAS11002、云陆28、紫糯、kouketsumochi、PI312777、Lemont。已知的化感水稻品种均具有化感抑制稗草生长的作用，非化感水稻品种的抑制作用最小。

实施例2为琼脂共培法

琼脂共培法由澳大利亚科学家报道(Wu，H.，D.Pratley，T.，Memerle and T.Haig.2001.Screening methods for the evaluation of crop allelopathic potential.Bot.Rev.67(3)：171-180.)，其具体步骤是：0.6％的琼脂培养基灭菌后倒入9厘米直径的培养皿中，用灭菌的薄纸板将培养皿分为相等的两部分，12粒经表面灭菌、催芽的水稻(供体植物)分为3行，以每行3-4-5粒播种在培养皿的一部分，同时在该培养皿的另一部分(即薄纸板隔开的另一部分)以相同的方式播种12粒经表面消毒、催芽的稗草；不播种水稻、仅在培养皿的一部分(用薄纸板隔成两部分之一)以上述相同的方式播种12粒经表面消毒、催芽的稗草的作为对照。培养皿分别封盖后放入25-28℃的培养箱中光照条件下生长5天，之后取出稗草测量其主根长度，水稻、稗草共同生长的测量值作为Tr值，稗草单独生长的测量值最为ck值。以公式IR＝(1-Tr/ck)×100计算化感潜力，结果见表2。

表2琼脂共培养法水稻化感潜力评价结果

 水稻品种  Tr(cm)  琼脂共培法(IR)  化感潜力排名 Kouketsumochi  3.93  3.44  5

 Lemont  4.55  -11.79  8 PI312777  4.59  -12.78  9 云陆28  4.0  1.72  6 YAAS 11002  4.27  -4.9  7 紫糯  3.23  20.64  4 黄壳糯  3.15  22.60  3 维西红谷  3.08  24.32  2 维西紫谷  3.04  25.31  1 Ck(cm)  4.07  0

从评价结果看，化感水稻PI312777对稗草根长的抑制作用低于非化感水稻Lemont，与其他报道的情况存在矛盾之处。在琼脂共培养方法中，培养皿分隔成两个部分，稗草、水稻分别生长在分开的两个部分中，稗草生长的区域可能没有水稻的根系分泌物或者量极少，因此这一方法水稻根系分泌物在介质中的分布不均匀、导致评价结果的偏差和重演性不佳。

实施例3迟播法

迟播法由国际水稻所科学家^[3]报道的方法，并被广泛应用于水稻化感潜力评价对杂草的生长抑制作用测定，其具体步骤是：培养皿底部放一张圆形滤纸，然后放入较大的容器内，3-5厘米宽的长条形滤纸放入培养皿正中间，条形滤纸两端长处培养皿进入容器中成为滤纸桥，然后在较大的容器中放入50毫升灭菌水。12粒经催芽萌发的水稻种子(供体植物)分2行播种在条形滤纸的两边，将整个培养容器放入25-28℃培养箱中生长7天后在2行水稻中间播种15粒经催芽萌发的稗草种子，不播种水稻只播种稗草在培养皿条形滤纸上的作为对照，整个培养容器在相同条件下生长5天后取出稗草测量其主根长。以公式IR＝(1-Tr/ck)×100计算化感潜力，式中Tr表示与水稻共同生长的稗草的主根长，ck为单独生长的稗草主根长。测定结果见表3。

从评价结果看，化感潜力的顺序为维系红谷、维系紫谷、PI312777、kouketsumochi、、YAAS11002、云陆28、Lemont、黄壳糯、紫糯。对已知的化感水稻材料，迟播法与本发明方法的结果具有较高的一致性。但迟播法的培养系统是一个开放的环境，不可能控制微生物的干扰，此外，迟播法中稗草的播种时间迟于水稻，因此提供了对水稻生长有利的条件，即人为地加强了水稻对稗草的竞争作用，测定结果是根系分泌物和竞争作用的共同结果。

表3迟播法水稻化感潜力评价结果

  水稻品种  Tr(cm)  迟播法(IR)  化感潜力排名  Kouketsumochi  3.2  37.25  4  Lemont  4.15  18.63  8  PI312777  2.9  43.13  3  云陆28  3.7  27.45  6  YAAS 11002  3.3  35.29  5  紫糯  4.15  18.63  8  黄壳糯  3.75  26.47  7  维西红谷  1.8  64.71  1  维西紫谷  2.73  46.47  2  Ck cm  5.1  0.00

迟播法是一种较为公认并被广泛应用于水稻化感潜力评价对杂草的生长抑制作用测定的方法。在此就本发明方法与琼脂共培法、迟播法生物测定评价方法采用IR值通过数据处理平台DPS6.5进行相关性统计分析，结果见表4。结果表明本发明与迟播法的相关性为0.77，与琼脂共培法的相关性为0.74；而迟播法与琼脂法的相关性仅0.32，从相关系数看本发明与该两种方法具有较好的相关性，即本发明与迟播法和琼脂共培法具有较好的兼容性。本发明不仅消除了植物种间共同生长的竞争作用，而且直接反应植物根系分泌物对其它生物的影响作用，具有准确的特点。因此本发明是一种快速、准确的植物根系分泌物化感潜力生物测定方法，非常适于适用于实验室进行植物种质资源的大量筛选评价工作。

表4本发明方法与琼脂共培法，迟播法的相关性分析

  相关系数  本发明X₁  琼脂共培法X₂  迟播法X₃  X₁  1  0.74**  0.77**  X₂  0.74**  1  0.32  X₃  0.77**  0.32  1

差异显著水平*p＜0.05  **p＜0.01

本发明采用≤0.3％的琼脂水溶液，其状态介于水和固体之间，为供体植物种子萌发、生长提供了足够的水分，并为其根系生长提供固着和支撑。

本发明所有操作在无菌条件下进行，最大限度地控制了微生物的干扰以及微生物可能对化感物质的分解作用，即微生物干扰作用。此外，供体植物所产生的根系分泌物完全滞留在培养皿中，而供体植物与受体植物在相同的基质和生长条件下分别生长，排除了植物种间对水分、养分的竞争作用，充分反应供体植物根系分泌物对受体的作用。