一种用于诊断Q热病的蛋白组合物

摘要

本发明公开了一种用于诊断Q热病的蛋白组合物。该蛋白组合物由如下(1)-(7)中所述蛋白组成：(1)氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质；(2)氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；(3)氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的蛋白质；(4)氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的蛋白质；(5)氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示的蛋白质；(6)氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示的蛋白质；(7)氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示的蛋白质。本发明的蛋白组合物及蛋白芯片可对Q热病人或动物的血清进行快速、准确的血清学分析诊断，结果准确可靠，操作简便，样本用量少，省时省力，有望代替传统的繁琐、累人、耗时的血清学诊断方法做Q热血清学诊断。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于诊断Q热病的蛋白组合物。

背景技术

贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)为专性吞噬细胞内寄生的革兰阴性小杆菌。该菌对外界环境抵抗力很强，对人和动物有极强的感染力，可通过气溶胶扩散经呼吸道进入体内导致人及动物发生感染并导致Q热。

Q热是一种呈世界性分布的人兽共患病，在我国分布广泛。人类Q热分为急性和慢性两种类型，急性Q热以发热、头痛、肌肉酸痛为主要症状，并常伴有肺炎发生，部分患者还可发生肝炎、心肌炎甚至脑膜炎。如果急性Q热未得到及时或彻底治疗可转变为慢性，引起慢性肝炎、心内膜炎、骨髓炎等。

目前，Q热最常用的特异性诊断方法为血清学诊断，包括间接免疫荧光(IFA)技术，酶联免疫吸附(ELISA)技术等.这些检测方法特异性较高，是目前临床用得最多的检测方法。但这些检测方法对样本需求量大、步骤较为繁琐费时、并且都需要纯化的贝氏柯克斯体全菌作为抗原，而提取纯化贝氏柯克斯体的防护要求高，工艺复杂，成本昂贵，因此这些方法都难以被广泛推广和使用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于诊断Q热病的蛋白组合物。

本发明所提供的用于诊断Q热病的蛋白组合物，由如下(1)-(7)中所述蛋白组成：

(1)为如下1-a或1-b所示：

1-a、氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质；

1-b、将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1-a衍生的蛋白质；

(2)为如下2-a或2-b所示：

2-a、氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

2-b、将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-a衍生的蛋白质；

(3)为如下3-a或3-b所示：

3-a、氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的蛋白质；

3-b、将SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-a衍生的蛋白质；

(4)为如下4-a或4-b所示：

4-a、氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的蛋白质；

4-b、将SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-a衍生的蛋白质；

(5)为如下5-a或5-b所示：

5-a、氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示的蛋白质；

5-b、将SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由5-a衍生的蛋白质；

(6)为如下6-a或6-b所示：

6-a、氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示的蛋白质；

6-b、将SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由6-a衍生的蛋白质；

(7)为如下7-a或7-b所示：

7-a、氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示的蛋白质；

7-b、将SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由7-a衍生的蛋白质。

上述蛋白组合物中，所述Q热病是由病原菌贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)感染动物引起的。

上述蛋白组合物中，所述动物为人或家畜或鼠；所述家畜为牛、羊或马。

本发明的另一个目的是提供一种用于诊断Q热病的蛋白芯片。

本发明所提供的用于诊断Q热病的蛋白芯片，由基底、检测点、阳性质控点和阴性质控点组成，检测点、阳性质控点和阴性质控点均点制在所述基底上；所述检测点分为七种，每种检测点由如下(1)-(7)所示蛋白中的一种点制而成；

(1)为如下1-a或1-b所示：

1-a、氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质；

1-b、将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1-a衍生的蛋白质；

(2)为如下2-a或2-b所示：

2-a、氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

2-b、将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-a衍生的蛋白质；

(3)为如下3-a或3-b所示：

3-a、氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的蛋白质；

3-b、将SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-a衍生的蛋白质；

(4)为如下4-a或4-b所示：

4-a、氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的蛋白质；

4-b、将SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-a衍生的蛋白质；

(5)为如下5-a或5-b所示：

5-a、氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示的蛋白质；

5-b、将SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由5-a衍生的蛋白质；

(6)为如下6-a或6-b所示：

6-a、氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示的蛋白质；

6-b、将SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由6-a衍生的蛋白质；

(7)为如下7-a或7-b所示：

7-a、氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示的蛋白质；

7-b、将SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由7-a衍生的蛋白质。

上述蛋白芯片中，所述基底可为任何制备蛋白芯片时所用的基底，具体可如醛基化玻片。

上述蛋白芯片中，所述阴性质控对照可为任何本领域中常用的阴性质控对照，具体可如水、PBS缓冲液，还具体可为蛋白洗脱缓冲液或转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液。

其中，转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液按照如下方法制备：将转入pET-32a(+)的BL21(DE3)接入安苄抗性(Amp⁺)LB液体培养基中，37℃震摇过夜，次日按1∶100接种新鲜安苄抗性(Amp⁺)LB液体培养基，37℃震摇至OD₆₀₀＝0.4，加入诱导剂IPTG，浓度为0.4mM，于37℃继续震摇4小时，得到发酵液。取诱导表达的发酵液100ml，8000rpm/min离心5min，集菌，弃上清。用30ml裂解缓冲液重悬菌体，以25％振幅超声破碎(超3s，停9s)1小时，得到转入pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液。

其中，每1升裂解缓冲液按照如下方法制备：将50mmol NaH₂PO₄·H₂O、300mmol NaCl、10mmol咪唑和水混合，用NaOH调节pH至8.0，用水定容至1L，得到裂解缓冲液。

其中，每1升洗脱缓冲液组成：将50mmol NaH₂PO₄·H₂O、300mmol NaCl、250mmol咪唑、0.3L甘油和水混合，用NaOH调节pH至8.0，用水定容至1L，得到洗脱缓冲液。

上述任一所述蛋白芯片中，所述阳性质控点由人源IgG或除人外的其它动物来源的IgG点制而成。

上述任一所述蛋白芯片中，每个所述检测点中蛋白的量为4.5μg；每个所述阳性质控点中IgG的量为4.5μg；

上述任一所述蛋白芯片中，所述除人外的其它动物来源的IgG为家畜来源的IgG或鼠来源的IgG；所述家畜来源的IgG为牛来源的IgG、羊来源的IgG或马来源的IgG。

上述任一所述蛋白芯片中，所述Q热病是由病原菌贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)感染动物引起的。

上述任一所述蛋白芯片中，所述感染动物为感染人或感染家畜或感染鼠；所述家畜为牛、羊或马。

本发明的最后一个目的是提供一种用于血清学诊断Q热的试剂盒。

本发明所提供的用于血清学诊断Q热的试剂盒，为如下I或II所示：

I、由上述任一所述蛋白组合物、封闭液、漂洗液和荧光素标记的二抗组成；

II、由上述任一所述蛋白芯片、封闭液、漂洗液和荧光素标记的二抗组成；

所述封闭液按照如下方法制备得到：将BSA溶于pH值为7.4的PBS缓冲液中，BSA与pH值为7.4的PBS缓冲液的配比为1g∶100ml，得到的溶液即为所述封闭液；

所述荧光素标记的二抗为Cy5标记的羊抗人IgG或Cy5标记的羊抗除人以外其它动物来源的IgG；

所述漂洗液为PBST缓冲液；

每1升所述pH值为7.4的PBS缓冲液按照如下方法制备：将8gNaCl、0.2g KCl、3.53gNa₂HPO₄.12H₂O、0.24g KH₂PO₄和水混合，用水定容至1升，得到的溶液的pH值为7.4，即得到所述PBS缓冲液；

所述PBST缓冲液按照如下方法制备：将所述pH值为7.4的PBS缓冲液与Tween-20混合，pH值为7.4的PBS缓冲液与Tween-20的配比为1L∶1ml，得到所述PBST缓冲液。

上述任一所述蛋白组合物在制备Q热病诊断芯片中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述蛋白组合物在制备Q热病诊断试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的蛋白组合物及蛋白芯片可对Q热病人或动物的血清进行快速、准确的血清学分析诊断，结果准确可靠，操作简便，样本用量少，省时省力，可以代替传统的繁琐、累人、耗时的血清学诊断方法做Q热血清学诊断。

本发明属于艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项中内容，项目名称：传染病病原体诊断和组合检测技术研究；课题编号2008ZX10004-002。本发明对国家利益或公共利益具有重大意义，迫切需要采取专利方式予以保护。

附图说明

图1为重组蛋白的电泳结果。

图2为蛋白芯片与感染小鼠血清反应。

图3为蛋白芯片与病人血清反应。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

贝氏柯克斯体新桥株(Coxiella burnetii)Xinqiao strain在文献“Wen，B.，S.Yu，G.Yu，Q.Li，and X.Zhang.1991. Analysis of proteins and lipopolysaccharides fromChinese isolates of Coxiella burnetii with monocl

实施例1、7种抗原蛋白的制备

载体pET-32a(+)购自Novagen公司，产品目录号为69015。pQE30购自qiagen公司，产品目录号为33203。

大肠杆菌BL21购自Novagen公司，产品目录号为69450。大肠杆菌M15购自Novagen公司，产品目录号为34210。

一、7种抗原蛋白的蛋白序列及编码基因序列

7种抗原蛋白的蛋白序列及编码基因序列如表1所示。

表1、蛋白及基因序列

  蛋白名称  蛋白序列  编码基因序列  OmpH  SEQ ID NO：1  SEQ ID NO：8  Com1  SEQ ID NO：2  SEQ ID NO：9  YbgF  SEQ ID NO：3  SEQ ID NO：10  Mip  SEQ ID NO：4  SEQ ID NO：11  DnaK  SEQ ID NO：5  SEQ ID NO：12  GroEL  SEQ ID NO：6  SEQ ID NO：13  RplL  SEQ ID NO：7  SEQ ID NO：14

二、蛋白OmpH的制备

OmpH基因扩增：以贝氏柯克斯体新桥株(Coxiella burnetii)的基因组DNA为模板，用引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；用限制性内切酶BamHI和SalI酶切PCR扩增产物，回收目的基因片段；用限制性内切酶BamHI和SalI酶切出发载体pET-32a(+)，回收载体大片段；将目的基因片段和载体大片段连接，得到重组载体；PCR扩增的通用条件：94℃预变性5min，95℃30sec、55℃30sec、72℃1.5min，循环35次，72℃延伸7min。

重组菌的制备：将重组载体转入出发菌大肠杆菌BL21中，得到重组菌。验证：将重组菌接入含有安苄抗性(Amp⁺)的固体LB平板培养基中，抗性筛选，挑取单性克隆；将单克隆接入LB液体培养基中，培养，提取质粒，进行测序，结果在载体pET-32a(+)的BamHI和SalI酶切位点间插入的基因序列如SEQ ID NO：8所示，表明构建的载体正确。

蛋白表达：将阳性重组菌接入安苄抗性(Amp⁺)LB液体培养基中，37℃震摇过夜，次日按1∶100接种新鲜安苄抗性(Amp⁺)LB液体培养基，37℃震摇至OD₆₀₀＝0.4，加入诱导剂IPTG，浓度为0.4mM，于37℃继续震摇4小时，得到发酵液。

蛋白纯化：取诱导表达的发酵液100ml，8000rpm/min离心5min，集菌，弃上清。用30ml裂解缓冲液重悬菌体，以25％振幅超声破碎(超3s，停9s)1小时。取出超声裂解物，以12000rpm离心20min，弃掉沉淀，收集上清液。向上清液中加入10ml回收缓冲液后混匀，1h后以12000rpm离心20min，弃掉沉淀，收集上清液。将上清液与2mlNi-NTA混合，室温200rpm振荡混匀4h，使目的蛋白与Ni-NTA完全结合。吸掉上清，依次加入含6M～0M(6M、5M、4M、3M、2M、1M、0M)尿素的复性缓冲液逐级复性；每次加入复性缓冲液后混匀，室温静置作用4h。待加入含0M尿素的复性缓冲液作用4h后，倒入纯化空柱中，加入10ml洗涤缓冲液洗涤，并控制流速为3ml/min。待液体流净，加入洗脱缓冲液，共洗脱4次，每次0.5ml，将每次收集的洗脱液合并，即得到目的蛋白溶液。

每1升裂解缓冲液按照如下方法制备：将50mmol NaH₂PO₄·H₂O、300mmol NaCl、10mmol咪唑和水混合，用NaOH调节pH至8.0，用水定容至1L，得到裂解缓冲液。

0.1mol/L Tris-Cl缓冲液配制：将12.11gTris、800mL ddH₂O和49mL HCl混合，滴加浓盐酸调pH至8.0，用ddH₂O定溶至1000mL，得到0.1mol/L Tris-Cl缓冲液。

每1升回收缓冲液按照如下方法制备：将100mmol NaH₂PO₄·H₂O、0.1LTris-Cl缓冲液(即10mmol Tris)、8mol尿素和水混合，用NaOH调节pH至8.0，用水定容至1L，得到回收缓冲液。

复性缓冲液制备：

每1升含6M尿素复性缓冲液按照如下方法制备：将500mmol NaCl、0.2L Tris-Cl缓冲液、6mol尿素、0.2L甘油和水混合，调节pH至7.4，用水定容至1升，得到含6M尿素复性缓冲液。

每1升无尿素复性缓冲液按照如下方法制备：将500mmol NaCl、0.2L Tris-Cl缓冲液、0.2L甘油和水混合，调节pH至7.4，用水定容至1升，得到无尿素复性缓冲液。

5M-1M尿素复性缓冲液由6M尿素复性缓冲液和无尿素复性缓冲液不同体积配比得到。

每1升洗涤缓冲液组成：将50mmol NaH₂PO₄·H₂O、300mmol NaCl、20mmol咪唑和水混合，用NaOH调节pH至8.0，用水定容至1L，得到洗涤缓冲液。

每1升洗脱缓冲液组成：：将50mmol NaH₂PO₄·H₂O、300mmol NaCl、250mmol咪唑、0.3L甘油和水混合，用NaOH调节pH至8.0，用水定容至1L，得到洗脱缓冲液。

每1升LB液体培养基组成：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和水混合，用水定容至1L，得到LB液体培养基。

三、其它蛋白的制备

制备方法与步骤二中基本相同，不同的是：引物、出发载体、限制性内切酶、出发菌株、重组菌抗性筛选方式不同，具体如表2所示。

当所用出发载体为pET-32a(+)时，用的出发菌株为BL21，对应的抗性筛选采用安苄抗性(Amp⁺)；

当所用出发载体为pQE30时，用的出发菌株为M15，对应的抗性筛选采用安苄(Amp⁺)和卡那(Kan⁺)双抗性。

表2、引物、载体、酶

当用pET-32a(+)构建重组表达载体时，表达得到的蛋白是目的蛋白与pET-32a(+)上的His标签组成的融合蛋白；当用pQE30构建重组表达载体时，表达得到的蛋白就是目的蛋白。

将得到的蛋白溶液进行电泳检测，结果如图1所示。蛋白的分子量大小为：ompH：19+17＝36KD，com1：27KD，ybgF：34KD，mip：25+17＝42KD，dnaK：45+17＝62KD，groEL：54KD，rplL：13+17＝30KD；与预期一致。

同时以转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)作为对照重组菌。发酵该对照重组菌得到的蛋白为载体pET-32a(+)上的标签蛋白TrxA，其大小为17KD。

同时以转入空载体pQE30的M15作为对照重组菌。发酵该对照重组菌没有得到任何蛋白。

综合以上结果，表明制备的目的蛋白正确。

实施例2、蛋白芯片及其制备

鼠源IgG购自北京鸿越创新生物科技有限公司，产品目录号为M401-M422。人源IgG购自北京鸿越创新生物科技有限公司，产品目录号为M401-M422。

一、用于检测人血清的蛋白芯片及其制备

蛋白芯片的结构：由醛基化玻片基底、检测点、阳性质控点和阴性质控点组成，检测点、阳性质控点和阴性质控点均点制在所述基底上。每种检测点、阳性质控点和阴性质控点均有5个重复。检测点、阳性质控点和阴性质控点在基底上呈矩阵式排列。

所述检测点分为七种：由OmpH点制而成(每个点的蛋白量为4.5μg)、由Com1点制而成(每个点的蛋白量为4.5μg)、由YbgF点制而成(每个点的蛋白量为4.5μg)、由Mip点制而成(每个点的蛋白量为4.5μg)、由DnaK点制而成(每个点的蛋白量为4.5μg)、由GroEL点制而成(每个点的蛋白量为4.5μg)、由RplL点制而成(每个点的蛋白量为4.5μg)；

阳性质控点由人源IgG点制而成(每个点的IgG量为4.5μg)；

阴性质控点分为二种：一种由转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液点制而成(每个点的点制量为15ul)，另一种由蛋白洗脱缓冲液点制而成(每个点的点制量为15ul)。

蛋白芯片的制备：将蛋白溶液浓度调整至300μg/ml，取蛋白溶液15μl用3点样仪点制在醛基化玻片上形成一个蛋白检测点(每个检测点蛋白的量为300μg/ml×15ul＝4.5ug)，每个蛋白样品重复5次。以300μg/ml的人源IgG溶液作为阳性质控(每个阳性质控点IgG的量为300μg/ml×15ul＝4.5ug)，并作为矩阵的位置标识点。以转入pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液作为阴性质控I，以洗脱缓冲液作为阴性质控II(每个阴性质控点细胞裂解液或洗脱缓冲液的量为15ul)。点制完成后，在室温(25℃)放置1h，再4℃保存备用。

转入空载体pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液按照如下方法制备：将转入pET-32a(+)的BL21(DE3)接入安苄抗性(Amp⁺)LB液体培养基中，37℃震摇过夜，次日按1∶100接种新鲜安苄抗性(Amp⁺)LB液体培养基，37℃震摇至OD₆₀₀＝0.4，加入诱导剂IPTG，浓度为0.4mM，于37℃继续震摇4小时，得到发酵液。取诱导表达的发酵液100ml，8000rpm/min离心5min，集菌，弃上清。用30ml裂解缓冲液重悬菌体，以25％振幅超声破碎(超3s，停9s)1小时，得到转入pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液。

每1升裂解缓冲液按照如下方法制备：将50mmol NaH₂PO₄·H₂O、300mmol NaCl、10mmol咪唑和水混合，用NaOH调节pH至8.0，用水定容至1L，得到裂解缓冲液。

人源IgG溶液的配制：将人源IgG溶于PBS缓冲液中，使人源IgG的浓度为300μg/ml，得到人源IgG溶液。

二、用于检测鼠血清的蛋白芯片及其制备

用于检测鼠血清的蛋白芯片与用于检测人血清的蛋白芯片基本相同，不同的是：阳性质控为鼠源IgG，鼠源IgG溶液的配制：将鼠源IgG溶于PBS缓冲液中，使鼠源IgG的浓度为300μg/ml，得到鼠源IgG溶液。

实施例3、诊断Q热

Cy5标记的羊抗鼠IgG购自美国KPL公司产品，产品目录号为072-02-18-06。

Cy5标记的羊抗人IgG购自美国KPL公司产品，产品目录号为072-02-10-06。

每1升磷酸盐缓冲液(PBS)按照如下方法制备：将8gNaCl、0.2g KCl、3.53gNa₂HPO₄.12H₂O、0.24g KH₂PO₄和水混合，用水定容至1升，得到的溶液的pH值为7.4，即得到所述PBS缓冲液。

每1升PBST缓冲液按照如下方法制备：将磷酸盐缓冲液(PBS)与Tween-20混合，磷酸盐缓冲液(PBS)与Tween-20的配比为1升∶1ml，得到PBST缓冲液。

小鼠为6周龄雄性BALB/c小鼠，购自军事医学科学院实验动物中心。

一、诊断鼠的Q热

(一)诊断试剂盒组成：

由实施例2中用于检测鼠血清的蛋白芯片、Cy5标记的羊抗鼠IgG、封闭液和漂洗液组成。

封闭液：将BSA溶于PBS缓冲液中，牛血清白蛋白(BSA)与PBS缓冲液的配比为1g∶100ml，得到的溶液即为所述封闭液；

漂洗液：PBST缓冲液。

(二)诊断应用

感染小鼠的制备：用菌株贝氏柯克斯体感染Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射1×10⁸个菌体，取尾静脉血清，分别在感染后1、2、3、4周取血(每次取一份样本)，用于检测。

取感染小鼠及正常小鼠血清，首先分别与转入pET-32a(+)的BL21(DE3)的细胞裂解液在室温(25℃)共孵育2h，以15000×g离心10min，取上清液，为吸收后的感染小鼠血清或吸收后的正常小鼠血清。

将芯片滴加封闭液，室温(25℃)封闭1h，然后加入1∶100稀释的吸收后血清50ul/孔，室温(25℃)作用1h。PBST缓冲液漂洗5次后加入1∶500稀释的Cy5标记的羊抗鼠IgG，室温(25℃)作用1h，PBST缓冲液漂洗5次后再用去离子水漂洗后避光晾干，用芯片扫描仪进行扫描。扫描结果通过GenePieX Pro5.1软件进行图像处理与数据分析，以样品荧光中位值减去背景荧光中位值作为每个检测点(蛋白点)的反应荧光值，每种蛋白所有重复点的反应荧光值的平均值作为该种蛋白的荧光信号值。计算正常小鼠血清样本与每种蛋白点的反应荧光值的平均值(即荧光信号值)和标准差(SD)。设定感染小鼠血清蛋白点对应的荧光信号值大于正常小鼠血清蛋白点对应的荧光信号值与2倍SD之和，认为此蛋白为阳性。7种蛋白中70％以上蛋白均显示阳性时，诊断确定检测样本为Q热病样本。

结果如表3和图2所示。图2中，1蛋白芯片的质控，2-4为蛋白芯片与正常小鼠血清反应；5-8蛋白芯片与感染1-4周小鼠血清反应。

蛋白芯片的质控：为检测蛋白芯片的点样效果，将点制好的蛋白芯片与鼠抗His标签(1抗)的抗体反应稀释比例(1∶100)，具体过程如同蛋白芯片与小鼠血清反应。由于重组蛋白均含有his标签，均能与鼠抗His标签抗体反应，再加入Cy5标记的羊抗鼠IgG，即可显示荧光。

表3、检测小鼠血清结果

结果显示，检测感染时间不同的小鼠血清时，从第2周开始各种蛋白点都是阳性的；而检测正常小鼠血清时，各种蛋白点都是阴性的；证明，该芯片的检测结果是准确的。实验设3次重复，结果均一致。

二、蛋白芯片与病人血清反应

(一)诊断试剂盒组成：

由实施例2中用于检测人血清的蛋白芯片、Cy5标记的羊抗人IgG、封闭液和漂洗液组成。

封闭液：将BSA溶于PBS缓冲液中，牛血清白蛋白(BSA)与PBS缓冲液的配比为1g∶100ml，得到的溶液即为所述封闭液；

漂洗液：PBST缓冲液。

(二)诊断应用

检测方法与实验一中所述基本相同，不同的是检测样本不同。检测样本为Q热病患者的急性期血清、及未感染任何病菌的健康人血清。样本均为医院体检后剩余的血清，且均经过患者和健康者的同意。7种蛋白中70％以上蛋白均显示阳性时，诊断确定检测样本为Q热病样本。

共检测10份Q热病患者的急性期血清样本，结果均为阳性，阳性率为100％。结果如表4-13和图3所示。图3中，图1-4蛋白芯片与正常人血清反应；图5-8蛋白芯片与Q热病人血清反应。

表4、

表5、

表6

表7

表8

表9

表10

表11

表12

表13

结果显示，检测Q热患者血清时，阳性检出率为100％，证明，该芯片的检测结果是准确的。实验设3次重复，结果均一致。