一种人角膜上皮细胞系的构建方法

摘要

本发明涉及一种人角膜上皮细胞系的构建方法，构建方法是先将角膜消毒，再将角膜消化后，取下带有前弹力层的角膜上皮，剪成小的组织块后，将组织块向下平贴于培养孔的底部，然后加入培养液在二氧化碳培养箱中、37℃下进行贴板培养，培养期间更换培养液，细胞长成单层后进行传代培养，现已传至60代以上完成了人角膜上皮细胞系的构建；其中，培养液为含有20％胎牛血清、0.02‰～0.04‰的人表皮细胞生长因子、0.01‰～0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子、0.4‰～1.0‰羧甲基壳寡糖和0.25‰～1‰硫酸软骨素的DMEM/F12培养液，此外培养液还添加了0.08‰～0.1‰的IV型胶原。本发明的构建方法利用人角膜上皮组织成功建立了未经转染的人角膜上皮细胞系，建立的细胞系可以连续传代，能提供出大量的人角膜上皮细胞。

说明书

技术领域

本发明属于角膜细胞培养技术领域，具体涉及一种人角膜上皮细胞系的构建方法。

背景技术

角膜上皮层(epithelial layer)作为角膜的第一道屏障，是由5-7层鳞状细胞、翼状细胞和柱状细胞构成的厚约50-60μm的结构，不仅具有支撑和稳定泪膜的作用，而且还可以有阻止角膜水分的散失和外界病原体的入侵。在角膜上皮层的三种细胞中，柱状细胞是唯一具有分裂能力的细胞，并可向上分化产生翼状细胞和鳞状细胞，向下分化产生基底膜，而柱状细胞更新及再生的源泉为位于角膜缘基底层的角膜缘干细胞。目前研究显示，临床上很多严重的眼表疾病如重度的外伤(化学伤、热烧伤等)，Stevens Johnson综合征和眼瘢痕性类天疱疮等由于角膜缘干细胞受到损伤或缺失而使角膜上皮失去再生和修复能力，而最终致盲。此外还有很多眼表疾病，如反复性角膜上皮糜烂、角膜软化症等虽然角膜缘干细胞没有受到损伤，但由于角膜上皮基底膜或者前弹力层坏死崩溃，角膜缘干细胞增殖移形形成的新的角膜上皮与前弹力层不能紧密结合也会最终致盲。而角膜移植是目前角膜上皮致盲疾病治愈的唯一途径，但由于捐献的供体角膜数量严重不足，致使绝大多数角膜上皮致盲患者无法通过角膜移植而重见光明。近年来兴起的角膜组织工程，使组织工程角膜上皮的体外构建成为可能，也为带来了众多角膜上皮致盲患者重见光明带来了新的希望。但如何在体外获得可用于组织工程角膜上皮构建的大量角膜上皮细胞，一直是该领域的研究热点和主攻方向之一。

研究表明，通过组织块的体外培养获得可持续分裂的细胞群体是一种安全的建立连续性细胞系的方法，所建立的连续性细胞系能够较好的保持细胞原有的生物学特性。细胞自组织块迁出与贴壁是组织块培养法的关键，而通过添加促细胞迁出和贴壁物质羧甲基壳寡糖和IV型胶原可有效促进细胞的迁出与贴壁。目前，已有学者利用猿猴空泡(SV40)病毒和端粒酶转染的方法建立了人角膜上皮细胞系，但是由于细胞携带肿瘤病毒基因或癌基因而具有潜在的致瘤性，而无法用于组织工程角膜上皮的构建和临床角膜移植手术。因此，尽早建立起一种不经过任何病毒或癌基因转染的、可直接用于组织工程角膜上皮构建的人角膜上皮细胞系，已成为全世界眼科专家和细胞生物学家的主攻目标，也是众多角膜上皮致盲患者通过组织工程角膜上皮移植复明的关键所在。

目前已开展了利用人角膜内皮细胞构建人角膜内皮细胞系的相关研究，但由于人角膜内皮和人角膜上皮细胞存在的组织结构上的差异，利用人角膜内皮细胞系的培养液以及培养方法来建立人角膜上皮组织还是存在着成体细胞在体外难分裂增殖和贴壁的问题。此外，也有利用角膜缘组织进行人角膜上皮细胞系的构建研究，但目前为止，未见有利用人角膜上皮组织进行人角膜上皮细胞系构建的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种人角膜上皮细胞系的构建方法，从而有效的建立起人角膜上皮细胞系，为组织工程角膜上皮构建及组织工程全角膜构建提供上皮细胞，以弥补现有技术的补足。

本发明的构建方法如下：

先将角膜取出后用含抗生素的消毒液消毒，再将角膜进行消化处理后，取下带有前弹力层的角膜上皮，剪成小的角膜上皮组织块后，将角膜上皮组织块向下贴于培养孔的底部，使前弹力层向上；然后加入培养液在二氧化碳培养箱中、37℃下进行贴板培养，培养期间换培养液，细胞长成单层后用胰酶消化法进行继代培养，传代至60代以上完成了人角膜上皮细胞系的构建；其中，培养液为含有20％胎牛血清、0.02‰～0.04‰的人表皮细胞生长因子、0.01‰～0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子、0.4‰～1.0‰羧甲基壳寡糖和0.25‰～1‰硫酸软骨素的DMEM/F12培养液。

培养液中所添加的羧甲基壳寡糖与羧甲基壳多糖相比，其分子质量更小，水溶性更好，更易于细胞贴壁和生长，在0.4‰～1.0‰的浓度范围内促细胞贴壁和生长的效果最佳。

为了更好的提高细胞的贴壁与迁出效果，上述的培养液中还添加有质量比为0.08‰～0.1‰的IV型胶原。

所述的消毒液为用0.9％生理盐水配制的质量比为20％～70％的庆大霉素溶液。

上述方法中胰蛋白酶溶液的浓度为0.2～0.5％，最适消化时间为1～2分钟，消化不到1分钟则消化作用太弱，组织不够疏松不利于细胞迁出；消化长于2分钟则消化过度会使细胞损失甚至死亡。

本发明方法原代培养启动时将带有前弹力层的角膜上皮撕下，以保证所获得的细胞不掺杂其它细胞而为纯净的人角膜上皮细胞。

上述的贴壁培养是先将贴有人角膜上皮组织块的培养孔中加入0.1～0.3mL的专用培养液以保证组织块获得足够的营养又不至于培养液过多使组织块不能贴壁，在二氧化碳培养箱中37℃下进行贴板培养12-24小时后，每空再补加培养液至1mL，这样可使组织块牢固贴于孔底有利于细胞的迁出于贴壁。

培养期间每隔3～5天更换上述专用培养液1次。

人角膜上皮细胞自原代培养启动第3天开始从组织块迁出，细胞为上皮样，生长分裂旺盛，30天后长成细胞单层，经过连续的继代培养后已传至60代，完成了人角膜上皮细胞系的构建，细胞形态仍为上皮样，生长分裂依然十分旺盛。

本发明的构建方法利用人角膜上皮组织成功建立了未经任何转染的人角膜上皮细胞系，建立的细胞系可以连续传代，经过这种方法所获得的传代细胞可传60代以上，能提供出大量的人角膜上皮细胞；细胞系未经任何转染、没有致瘤性，可直接应用于组织工程角膜上皮的构建和临床应用；降低了组织工程角膜上皮生产和临床治疗的成本。本发明的方法为进一步进行组织工程全角膜的重建及应用奠定了坚实的基础。

具体实施方式

本发明构建方法的总体步骤如下：

1、角膜片贴板培养的启动：从眼库中取出2个完整的人角膜，放入100毫升玻璃烧杯中，加入10～30毫升浓度为0.9％的生理盐水，清洗5～9分钟；吸出生理盐水后，加入10～30毫升的浓度为20％～70％的庆大霉素，浸泡15～35分钟，于超净工作台中进行消毒，以下操作均在超净工作台中进行，所有用品均是无菌的；用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜，将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中，玻璃培养皿中加入0.2～0.5％胰蛋白酶5～10毫升消化1～2分钟；去除胰蛋白酶液，用眼科镊撕下带前弹力层的角膜上皮，用眼科剪沿角膜中心点把带有前弹力层的角膜上皮平均剪成8片，用眼科镊将角膜上皮面朝下平贴入24孔培养板的孔底，向贴入角膜上皮片的培养孔中加入0.1～0.3毫升培养液，培养液的体积量即保证角膜上皮片能够很好的贴附在培养孔底，又保证组织片不会干燥。将培养板放入5％二氧化碳培养箱中，37℃进行培养；

2、组织块法进行人角膜上皮细胞培养：角膜上皮片贴板培养12-24小时后，向每个培养孔中补加角膜上皮细胞专用培养液至1毫升，于5％二氧化碳培养箱中、37℃培养；每间隔3～5天，更换人角膜上皮细胞专用培养液一次。

3、人角膜上皮细胞专用培养液的配制：取常规配制的DMEM/F12培养液3.0毫升，然后依次加入硫酸软骨素1～4毫克、羧甲基壳寡糖0.2～0.6毫克和IV型胶原0.08～0.4毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入0.8毫升胎牛血清，又添加了0.01‰～0.02‰的人表皮细胞生长因子和0.01‰～0.02‰的碱性成纤维细胞生长因子，补加常规配制的DMEM/F12培养液至4.0毫升，即为本发明的人角膜上皮细胞专用培养液。

4、人角膜上皮细胞的继代培养：待人角膜上皮细胞长成单层后，吸出培养孔中的培养液，向每个培养孔中加入0.5毫升浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化1～2分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养孔中加入1毫升的上述专用培养液，用滴管吹打培养孔底3～5分钟制成人角膜上皮细胞悬液；从每培养孔中分别取出0.5毫升角膜上皮细胞悬液，分别加入到新的培养孔中，每个培养孔补加上述专用培养液0.5毫升，使之最终体积至1毫升；待人角膜上皮细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行继代培养。

实施例1

从眼库中取出2个完整的人角膜，放入100毫升玻璃烧杯中，加入10毫升浓度为0.9％的生理盐水，清洗5分钟；吸出生理盐水后，加入10毫升的浓度为20％的庆大霉素，浸泡35分钟，于超净工作台中进行消毒；以下操作均在超净工作台中进行，所有用品均是无菌的；用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜，将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中，培养皿中加入0.2％胰蛋白酶5毫升消化2分钟后，去除胰蛋白酶液，用眼科镊撕下带有前弹力层的角膜上皮，用眼科剪沿角膜中心点把带有前弹力层的角膜上皮平均剪成8片，用眼科镊将角膜上皮面朝下平贴入24孔培养板的孔底，每个培养孔补加含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液0.1毫升；将培养板放入5％二氧化碳培养箱中，37℃进行培养。取常规配制的DMEM/F12培养液3.0毫升，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入0.8毫升胎牛血清，又加入0.01‰～0.02‰的人表皮细胞生长因子和0.01‰～0.02‰的碱性成纤维细胞生长因子，补加常规配制的DMEM/F12培养液至4.0毫升，即为人角膜上皮细胞专用培养液。贴板培养12小时后，向每个培养孔中补加上述专用培养液至1毫升，于5％二氧化碳培养箱中、37℃培养；每间隔3天，更换人角膜上皮细胞专用培养液一次。待人角膜上皮细胞长成单层后，吸出培养孔中的培养液，向每个培养孔中加入0.5毫升浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化1分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养孔中加入1毫升的上述专用培养液，用滴管吹打培养孔底3分钟制成人角膜上皮细胞悬液；从每个培养孔中分别取出0.5毫升角膜上皮细胞悬液，分别加入到新的培养孔中，每培养孔补加上述专用培养液0.5毫升，使之最终体积至1毫升；待人角膜上皮细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行继代培养。

实施例2

从眼库中取出2个完整的人角膜，放入100毫升玻璃烧杯中，加入30毫升浓度为0.9％的生理盐水，清洗9分钟；吸出生理盐水后，加入30毫升的浓度为70％的庆大霉素，浸泡15分钟，于超净工作台中进行消毒；以下操作均均为无菌状态；用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜，将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中，培养皿中加入0.5％胰蛋白酶10毫升消化1分钟；去除胰蛋白酶液，用眼科镊撕下前弹力层，用眼科剪沿角膜中心点把带有前弹力层的角膜上皮平均剪成8片，用眼科镊将角膜上皮面朝下平贴入24孔培养板的孔底，向贴入角膜上皮片的培养孔中加入0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液；将培养板放入5％二氧化碳培养箱中，37℃进行培养。在上述人角膜上皮细胞专用培养液中，又添加了羧甲基壳寡糖0.2毫克和硫酸软骨素1毫克。贴板培养24小时后，向每个培养孔中补加上述专用培养液至1毫升，于5％二氧化碳培养箱中、37℃培养；每间隔5天，更换人角膜上皮细胞专用培养液一次。待人角膜上皮细胞长成单层后，吸出培养孔中的培养液，向每个培养孔中加入0.5毫升浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化2分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养孔中加入1毫升的上述培养液，用滴管吹打培养孔底5分钟制成人角膜上皮细胞悬液；从每培养孔中分别取出0.5毫升角膜上皮细胞悬液，分别加入到新的培养孔中，每培养孔补加上述培养液0.5毫升，使之最终体积至1毫升；待人角膜上皮细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行继代培养。

实施例3

从眼库中取出2个完整的人角膜，放入100毫升玻璃烧杯中，加入20毫升浓度为0.9％的生理盐水，清洗7分钟；吸出生理盐水后，加入20毫升的浓度为50％的庆大霉素，浸泡20分钟，于超净工作台中进行消毒；以下操作均为无菌状态；用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜，将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中，培养皿中加入0.35％胰蛋白酶7.5毫升消化1.5分钟；去除胰蛋白酶液，用眼科镊撕下前弹力层，用眼科剪沿角膜中心点把带有前弹力层的角膜上皮平均剪成8片，用眼科镊将角膜上皮面朝下平贴入24孔培养板的孔底；向贴入角膜上皮片的培养孔中加入0.2毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液；将培养板放入5％二氧化碳培养箱中，37℃进行培养。在上述人角膜上皮细胞专用培养液中，又添加了0.1‰的IV型胶原，以提高人角膜上皮细胞的贴壁与迁出效果。贴板培养18小时后，向每个培养孔中补加上述专用培养液至1毫升，于5％二氧化碳培养箱中、37℃培养；每间隔4天，将更换人角膜上皮细胞专用培养液一次。待人角膜上皮细胞长成单层后，吸出培养孔中的培养液，向每个培养孔中加入0.5毫升浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化1.5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养孔中加入1毫升的上述培养液，用滴管吹打培养孔底4分钟制成人角膜上皮细胞悬液；从每培养孔中分别取出0.5毫升角膜上皮细胞悬液，分别加入到新的培养孔中，每培养孔补加上述培养液0.5毫升，使之最终体积至1毫升；待人角膜上皮细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行继代培养。

目前实施例1建立的人角膜上皮细胞系已传至180代。已利用该细胞系细胞进行了人角膜上皮体外重建研究，并将重建的角膜上皮进行了的动物移植实验，将所重建的组织工程人角膜上皮移植到去除角膜缘干细胞及刮除角膜上皮层的新西兰兔眼中，实验结果表明，移植的人角膜上皮可使兔眼角膜恢复透明，并且移植的上皮能够防御细菌的侵染实验结果表明，本发明构建的人角膜上皮细胞系能够很好的在移植的动物上起到修复作用，具有广阔的开发前景。