一种可高效降解苯并a芘的短小芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株苯并[a]芘降解菌及其应用，该苯并[a]芘降解菌为Bacilluspumilus strain.Bap9，CGMCC №4585，该菌株能以苯并[a]芘为唯一碳源和能源生长，在苯并[a]芘浓度为40mg/L的无机盐培养基中，37℃振荡培养20天，菌株对苯并[a]芘的降解率达到27.30％，添加适量的共代谢碳源，如醋酸钠等可有效提高菌株对苯并[a]芘的降解速率。当以另一多环芳烃类物质菲为共代谢基质并与苯并[a]芘混合存在时，该菌株对苯并[a]芘的降解率可提高至53.70％，同时可实现对菲100％的去除。本发明所提供的菌株可为水环境或土壤环境中高环多环芳烃的降解提供新的微生物资源。

说明书

技术领域

本发明属于环境污染物处理技术领域，具体涉及一种苯并[a]芘高效降解菌及其应用。

背景技术

苯并[a]芘是一种具有明显致畸、致癌、致突变的有机化合物，它是由一个苯环和一个芘分子结合而成的多环芳烃类化合物。苯并[a]芘主要产生于石油、煤炭、木材、气体燃料和纸张等碳氢化合物的不完全燃烧及其在还原过程中的热分解作用；因此，苯并[a]芘广泛存在于煤焦油、各类碳黑和煤、石油等燃烧产生的烟气、香烟烟雾、汽车尾气中，以及焦化、炼油、沥青、塑料等工业污水中。地面水中的苯并[a]芘除了工业排污外，主要来自洗刷大气的雨水、储水槽及管道涂层淋溶等。人们长期暴露在含有苯并[a]芘的环境中，会造成慢性中毒；研究表明，生活环境中的苯并[a]芘含量每增加1％，肺癌的死亡率即上升5％。目前苯并[a]芘(BaP)与黄曲霉毒素和亚硝胺已被美国环保局列入优先控制的有毒有机污染物黑名单，是全世界公认为的三大致癌物质。

近年来，随着石油及石油产品的大量使用，环境中的苯并[a]芘有不断增多的趋势。在自然环境条件下苯并[a]芘的水解和光解速率都非常缓慢，如不加以处理必定会造成较大的危害。相对于化学和物理处理方法，微生物法由于具有二次污染少，成本低，操作简单等特点而被广泛使用；其在污染物的迁移转化乃至最终消失中占有重要地位，是环境中多环芳烃类物质去除的最主要途径。微生物能将苯并[a]芘完全矿化，最终将其转化为无毒、无害的无机物质CO₂和水，被认为是去除环境中苯并[a]芘的最佳方法。然而，目前发现的具有苯并[a]芘降解能力的细菌种类单一，且降解速率和代谢活性较低，降解能力不强，因此发掘更多的具有较强分解代谢能力的苯并[a]芘降解菌，并将其应用于环境污染物的去除过程，将具有重大的环境意义。

发明内容

本发明的目的是针对上述苯并[a]芘生物降解效率低的难题，提供一种苯并[a]芘高效降解菌及其应用。

本发明提供的短小芽孢杆菌Bacillus pumilus strain.Bap9已于2011年1月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 4585.

菌株Bacillus pumilus strain.Bap9是从北京大学畅春新园宿舍区烧烤场地土壤中取样，经驯化、分离及纯化得到的一株革兰氏阳性细菌。

形态特征：菌株Bap9在37℃下，牛肉膏蛋白胨培养基上培养16h后，生长为奶酪色的圆形菌落，菌落边缘整齐，表面湿润光滑；通过革兰氏染色后在显微镜下，菌体呈细小短竿状，近乎球形，大小为0.5～2.0um，接触酶反应结果为阳性。

根据其形态特征和生理生化特征及其16S rRNA基因序列，鉴定该菌株为短小芽孢杆菌，其16S rRNA具有如序列表示所示的核苷酸序列，序列长度为1402bp。

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该菌能在苯并[a]芘浓度为0～200mg/L的环境中生长繁殖，在好氧条件下，无机盐培养基中，该菌能以苯并[a]芘为唯一碳源和能源生长繁殖，20天内对苯并[a]芘(初始浓度为40mg/L)的降解率达27.3％。

该菌株在中性或偏酸性的较宽pH值范围内均能降解苯并[a]芘，最适生长与降解的pH值为5.5-9.5，优选为6.0-8.0。

该菌株降解苯并[a]芘的最佳装液量为5mL/50mL-30mL/50mL，优选为5mL/50mL-15mL/50mL。

菌株降解的最佳接种量为5％，最佳装液量为5mL/50mL。

添加适量的共代谢底物，可以有效促进该菌株的生长，提高该菌株对苯并[a]芘的降解速率。所述共代谢底物可为蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、醋酸钠或可溶性淀粉。

上述共代谢底物优选为醋酸钠，最适浓度范围为40-100mg/L。

添加适量的共代谢底物菲，也可促进该菌株对苯并[a]芘的降解。菲添加的最适浓度范围为20-40mg/L。

本发明的又一目的在于提供一种用于高效降解苯并[a]芘的微生物菌剂，其活性成分为所述的菌株Bacillus pumilus strain.Bap9。

本发明的短小芽孢杆菌及其应用与现有技术相比较有如下有益效果：

(1)本发明提供的菌株在纯培养条件下，20天内对苯并[a]芘的去除率可达27.30％，与已有菌株相比，降解率大大提高。

(2)当苯并[a]芘和菲的共同存在时，该菌株在20天内对苯并[a]芘的去除率达53.70％，对菲的去除率达100％。

利用这些特点，本发明菌株可用于降解水环境中的单一高环多环芳烃苯并[a]芘或高环多环芳烃混合物污染物，或者用于土壤环境中的生物修复；该菌株同时为高环多环芳烃共代谢机理研究提供了一种新的种质资源。

附图说明

图1为菌株Bacilluspumilus strain.Bap9的生长与苯并[a]芘的降解曲线

图2为不同起始pH值对菌株Bacillus pumilus strain.Bap9降解苯并[a]芘的影响。

图3为不同接种量对菌株Bacillus pumilus strain.Bap9降解苯并[a]芘的影响。

图4为不同装液量对菌株Bacillus pumilus strain.Bap9降解苯并[a]芘的影响。

图5为菌株Bacillus pumilus strain.Bap9对苯并[a]芘和菲混合体系的降解效果。

具体实施方式

以下结合具体实施对本发明作进一步说明。

实施例1：菌株Bacillus pumilus strain.Bap9的分离与降解苯并[a]芘的性能

一、高效降解苯并[a]芘菌株Bap9的分离纯化方法

该方法有以下步骤：

1、称取10g土壤样品，加入装有100mL驯化培养基的三角瓶中，驯化培养基的有效成分为：(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.1g，FeCl₃ 0.5g，CaCl₂ 0.5g，苯并[a]芘0.04g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0；

2、将上述三角瓶置于160r/min、37℃摇床中振荡培养1周，按10％接种量转接到新鲜的驯化培养基中，继续培养1周，反复3次；

吸取反复驯化后的培养液1mL，从平板上挑取特征不同、生长旺盛且稳定的菌落，在牛肉膏蛋白胨固体平板上反复划线分离以获得纯菌种，将分离纯化所得的纯菌种再接种到苯并[a]芘无机盐固体平板上，连续转接3次，选取生长速度最快的菌株Bap9作为研究菌株。并将该菌株于2011年1月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC№ 4585。

二、高效降解菌株Bap9对苯并[a]芘的降解性能

将上述菌株Bap9接种至含苯并[a]芘40mg/L.的无机盐培养液(该培养基的成分为：(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.1g，FeCl₃ 0.5g，CaCl₂ 0.5g，苯并[a]芘0.04g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0)中，在160r/min、37℃摇床中避光振荡培养，在第0、4、8、12、16、20天的同一时间分别取样测定培养液中菌密度和苯并[a]芘的残留量，实验结果见图1。由图1可以看出，菌株对苯并[a]芘的快速降解期为4-12d，到降解的后期(12-20d)，菌株对苯并[a]芘的降解曲线趋于平缓，到第20天时，菌株的OD值达到0.223，苯并[a]芘的降解率达到27.30％。

本实施例说明分离驯化所得到的降解菌可利用苯并[a]芘作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并且具有高效降解苯并[a]芘的能力。

实施例2：不同起始pH值对菌株Bacillus pumilus strain.Bap9的生长和降解苯并[a]芘的影响

调节无机盐培养基(该培养基的成分为：(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.1g，FeCl₃ 0.5g，CaCl₂ 0.5g，苯并[a]芘0.04g，蒸馏水1000mL)的pH值分别为5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、9.5，观察菌株Bap9的生长情况和对苯并[a]芘的降解性能。苯并[a]芘初始浓度为40mg/L，接种量为5％(V/V)，160r/min、37℃摇床中振荡培养7天，测定细菌OD值和苯并[a]芘的残留率，结果如图2。

由图2可以看出，在pH为8.0时，降解菌对苯并[a]芘的降解作用最强，7天后降解率为10.92％，在pH为5.5时降解率受到较大的抑制，仅为0.74％。菌株在不同pH值下的菌密度表明，pH值对微生物生长的影响与降解率相一致。在酸性到弱碱性环境中，菌株都能对苯并[a]芘进行降解，为其在不同pH环境中的应用提供了保证。

实施例3：不同接种量对菌株Bacillus pumilus strain.Bap9的生长和降解苯并[a]芘的影响

在接种量分别为0.5％、1.0％、2.0％、5.0％和10.0％的无机盐培养基(该培养基的成分为：(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.1g，FeCl₃0.5g，CaCl₂ 0.5g，苯并[a]芘0.04g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0)中，7天后苯并[a]芘的残留率分别为98.31％、94.26％、91.75％、89.94％与92.86％(见图3)。由图3可知，一定范围内，接种量越大，菌密度越高，一定范围内菌株的降解率越来越高，但接种量并非越大越好，当接种量为10.0％时，比接种量为5.0％时的降解率低。

实施例4：不同装液量对菌株Bacillus pumilus strain.Bap9的生长和降解苯并[a]芘的影响

以不同的装液量(5ml/50ml、10ml/50ml、15ml/50ml、20ml/50ml、25ml/50ml、30ml/50ml)向三角瓶中加入无机盐培养液(该培养基的成分为：(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.1g，FeCl₃ 0.5g，CaCl₂ 0.5g，苯并[a]芘0.04g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0)，苯并[a]芘初始浓度为40mg/L，接种量为5％(V/V)，于160r/min、37℃摇床中振荡培养7天，苯并[a]芘的残留率分别为87.63％、89.94％、91.24％，94.06％、97.95％、99.14％(见图4)，说明培养基中溶解氧浓度的高低直接影响微生物的生长和代谢，装液量越少，菌密度越高，溶氧量越大，有利于该菌株产生活性物质，所以降解率越高。

实施例5：添加碳源对菌株Bacillus pumilus strain.Bap9的生长和降解苯并[a]芘的影响

将菌株接种至含苯并[a]芘40mg/L的无机盐培养基(该培养基的成分为：(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.1g，FeCl₃ 0.5g，CaCl₂0.5g，苯并[a]芘0.04g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0)中，在培养液中分别添加终浓度为40mg/L的蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、醋酸钠和可溶性淀粉作为共代谢底物，于160r/min、37℃摇床中振荡培养7天，测定培养液中的菌密度和苯并[a]芘残留量，计算降解率。表1为添加终浓度为40mg/L的不同碳源对菌株细胞生长与苯并[a]芘降解的影响。由表1可知，采用醋酸钠作为碳源时降解率最高，添加蔗糖、葡萄糖和麦芽糖对菌株降解苯并[a]芘有抑制作用，添加可溶性淀粉的效果最不明显，可见选择合适的碳源对提高菌株的降解率至关重要。

表1添加碳源对菌株Bacillus pumilus strain.Bap9生长和苯并[a]芘降解率的影响

将菌株接种至醋酸钠浓度分别为0mg/L、10mg/L、40mg/L、100mg/L、500mg/L，苯并[a]芘浓度为40mg/L的无机盐培养基(该培养基的成分为：(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.1g，FeCl₃ 0.5g，CaCl₂0.5g，苯并[a]芘0.04g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0)中，于160r/min、37℃摇床中振荡培养20天后，测定培养液中的菌密度和苯并[a]芘残留量，计算降解率，结果如表2所示。

表2添加不同浓度的醋酸钠对菌株细胞生长与苯并[a]芘降解的影响

由表2可知，当醋酸钠浓度为10mg/L时，苯并[a]芘的降解比不加时提高了4.95％；当醋酸钠的浓度为40mg/L时，苯并[a]芘的降解率提高了8.77％；当醋酸钠的浓度增加到500mg/L时，苯并[a]芘的降解率急剧下降至13.12％。添加了10-40mg/L的醋酸钠会促进菌体生长，提高菌株对芘的降解率，添加过量的醋酸钠，菌株大量利用速效碳源，其对苯并[a]芘的利用受到了抑制。

本实例说明添加适量的碳源可促进菌株的生长，并提高其对苯并[a]芘的降解率。

实施例5：添加共代谢底物菲对菌株的生长降解苯并[a]芘的影响

将菌株接种至菲的浓度分别为0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、100mg/L，苯并[a]芘浓度为40mg/L的无机盐培养基(该培养基的成分为：(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.1g，FeCl₃ 0.5g，CaCl₂ 0.5g，苯并[a]芘0.04g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0)中，于160r/min、37℃摇床中振荡培养20天后，测定培养液中的菌密度和苯并[a]芘残留量，计算降解率，结果如表3所示。

表3为添加不同浓度的菲对菌株细胞生长与苯并[a]芘降解的影响

由表3可知，添加较低浓度的菲(20-40mg/L)，可以提高苯并[a]芘降解率，推测是因为，一方面为菌株提供了更容易利用的碳源，促进了菌株生长，另一方面，菌株在代谢菲的过程中产生诱导酶，能促进菌株降解苯并[a]芘基因的表达，从而提高了降解率。当菲的浓度超过60mg/L时，菌密度有所降低，其对苯并[a]芘的降解也受到抑制。

将菌株接种至菲的浓度为40mg/L，苯并[a]芘浓度为40mg/L的无机盐培养基(该培养基的成分为：(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.1g，FeCl₃ 0.5g，CaCl₂ 0.5g，菲0.04g，苯并[a]芘0.04g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0)中，于160r/min、37℃摇床中振荡培养，分别在第0、4、8、12、16、20天的同一时间取样，测定培养液中菌密度和苯并[a]芘的残留量，计算降解率。如图5所示，共代谢底物菲的浓度为40mg/L时，20天后菌株Bap9可降解53.70％的苯并[a]芘，比以苯并[a]芘为单一碳源时提高了26.4％，在第12天左右即可将菲完全降解。

本实例说明添加适量共代谢底物可促进菌株的生长，诱导菌株降解基因的表达，提高其对苯并[a]芘的降解率，同时，菌株可用于降解高环多环芳烃混合物，或者用于土壤生物修复，并为高环多环芳烃共代谢机理研究提供了一种新的种质资源。