一株高效固氮的紫云英根瘤菌及其培养方法与它的用途

摘要

本发明涉及一株高效固氮紫云英根瘤菌及其培养方法与它的用途。本发明的紫云英根瘤菌CGMCC No.4347采用菌种的活化、种子培养与发酵培养等步骤进行培养。采用本发明改进发酵培养基进行培养时，发酵液活菌数远远高于现有技术。本发明高效固氮紫云英根瘤菌剂接种于紫云英，与不接菌相比，可使紫云英植株鲜重增加241％以上，植株含氮量增加86％以上，产量增加47％以上；与现有生产菌株相比，紫云英植株鲜重增加58％以上，植株含氮量增加18％以上，产量增加12％以上，是紫云英根瘤菌生产及紫云英接种的优良菌株。本发明所述培养方法简便易行，原料来源广泛、价格低廉，适合大规模工业化生产。

说明书

【技术领域】

本发明属于根瘤菌技术领域。更具体地，本发明涉及一株高效固氮紫云英根瘤菌，还涉及所述根瘤菌的培养方法以及它的用途。

【背景技术】

紫云英是一种豆科黄芪属越年生草本植物，其产青量高、肥质好、养分高、易腐熟、肥效大、持久性好，是一种优质高产的有机肥料。紫云英能大量增加土壤有机质，增强土壤的保水、保肥、保温性能。紫云英通常在秋季套播于晚稻田中，作早稻的基肥，可解决双季稻的肥料问题，是我国稻田最主要的冬季绿肥作物。

紫云英根瘤菌(Rhizobium astragula)可侵入紫云英根部，与紫云英进行共生固氮。紫云英生长的状态，尤其是生地种植，关键取决于其接种剂-紫云英根瘤菌，紫云英根瘤菌与紫云英种子的接种组合，已成为紫云英种植一项必不可少的接种技术。我国紫云英根瘤菌的研究起步较早，早在上世纪40年代陈华癸先生就发现紫云英根瘤菌和紫云英是一个独特的互接族群，但是目前，紫云英根瘤菌生产菌种普遍存在结瘤能力差、固氮能力弱等问题。

培养根瘤菌的通用传统培养基为YEM培养基，其组成成分为：甘露醇10g/L，酵母膏1.0g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，NaCl 0.2g/L。其中，主要成分甘露醇和酵母膏的价格较高，从而直接造成其发酵成本高，于是制约了根瘤菌的工业化生产。

本发明人经过大量实验研究，分离选育出具有结瘤固氮能力强的紫云英根瘤菌菌株，并且从替换碳氮源入手，通过改良培养基，有效降低了生产成本，并提高了发酵水平，适合大规模生产，适应我国紫云英根瘤菌生产以及发展紫云英种植的要求。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一株高效固氮的紫云英根瘤菌。

本发明的另一个目的是提供所述高效固氮的紫云英根瘤菌的培养方法。

本发明的另一个目的是提供所述高效固氮的紫云英根瘤菌制成的菌剂。

本发明的另一个目的是提供所述高效固氮的紫云英根瘤菌剂的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一株高效固氮的紫云英根瘤菌(Rhizobium astragula)CGMCC No.4347。

本发明还涉及所述紫云英根瘤菌CGMCC No.4347的培养方法。该方法的步骤如下：

(1)菌种的活化：接种紫云英根瘤菌(Rhizobium astragula)CGMCCNo.4347至斜面培养基，在温度28℃下培养72小时；

所述的斜面培养基组成如下：甘露醇10g/L、酵母膏1.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L、琼脂18g/L，pH6.8～7.0；

(2)种子培养：将活化菌种转接至灭菌液体培养基中，在温度28℃与160～180rpm条件下摇床培养48小时；

所述的种子培养基组成如下：甘露醇10g/L、酵母膏1.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L，pH6.8～7.0；

(3)发酵培养：以体积计按照1％接种量将步骤2)得到的种子液转接入发酵培养基中，在温度28℃与150rpm的条件下培养48小时，得到所述液体紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌剂；

所述的发酵培养基组成如下：大豆糖蜜9g/L、甘露醇1g/L、酵母膏0.2g/L、谷氨酸钠0.8g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L，pH6.8～7.0。

根据本发明的一种优选实施方式，采用本发明培养方法所得到的液体紫云英根瘤菌剂活菌数达到125ml以上。

根据本发明的另一种优选实施方式，根据权利要求2所述培养方法得到的液体紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌剂与经灭菌的pH值7.0～7.2的草炭按照重量份比1∶2～4混合，然后在温度28℃的条件下增殖培养12～36小时，得到活菌数大于5亿/g的固体紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌剂。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的草炭为80～150目。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的草炭在温度121℃下灭菌0.5～1.5小时。

根据本发明的另一种优选实施方式，在温度28℃的条件下增殖培养20～28小时。

本发明还涉及所述紫云英根瘤菌菌剂在种植紫云英中的用途。

根据本发明的另一种优选实施方式，在种植紫云英时，按照每亩地为采用本发明方法制备的液体紫云英根瘤菌剂20～40ml与紫云英种子1.5～2.5kg的比例，将紫云英根瘤菌剂与紫云英种子混拌均匀，然后播种。

根据本发明的另一种优选实施方式，在种植紫云英时，按照每亩地为采用本发明方法制备的固体紫云英根瘤菌剂150～250g与紫云英种子1.5～2.5kg的比例，将紫云英根瘤菌剂与紫云英种子混拌均匀，然后播种。

下面将更详细地描述本发明。

本发明涉及一株高效固氮的紫云英根瘤菌(Rhizobium astragula)CGMCC No.4347。该菌株已于2010年11月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.4347。

本发明的紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌株是从浙江省采集野生紫云英根瘤，采用从根瘤中分离根瘤菌的常规方法分离筛选获得的，具体方法参见联合国粮食及农业组织编写的《共生固氮技术手册》。

紫云英根瘤菌CGMCC No.4347，属革兰氏阴性杆菌，小的短杆状，无芽孢，具有周生鞭毛，能运动。

紫云英根瘤菌CGMCC No.4347在酵母膏甘露醇琼脂培养基上生长3～5天，菌落呈圆形，边缘整齐，稍突起，半透明，具有粘质感。

紫云英根瘤菌CGMCC No.4347需好氧发酵培养，最适生长温度为28℃，最适pH为6.8～7.0，在菌体生长期会降低到5.0～6.5。

本发明还涉及所述紫云英根瘤菌CGMCC No.4347的培养方法。

该方法的步骤如下：

(1)菌种的活化：接种紫云英根瘤菌(Rhizobium astragula)CGMCCNo.4347至斜面培养基，在温度28℃下培养72小时；

所述的斜面培养基组成如下：甘露醇10g/L、酵母膏1.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L、琼脂18g/L，pH6.8～7.0。

(2)种子培养：将活化菌种转接至灭菌液体培养基中，在温度28℃与160～180rpm条件下摇床培养48小时；

所述的种子培养基组成如下：甘露醇10g/L、酵母膏1.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L，pH6.8～7.0。

(3)发酵培养：以体积计按照1％接种量将步骤2)得到的种子液转接入发酵培养基中，在温度28℃与150rpm的条件下培养48小时，得到所述液体紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌剂；

所述的发酵培养基组成如下：大豆糖蜜9g/L、甘露醇1g/L、酵母膏0.2g/L、谷氨酸钠0.8g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L，pH6.8～7.0。

目前，培养根瘤菌的常规培养基为YEM培养基，其组成如下：甘露醇10g/L，酵母膏1.0g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠0.2g/L。

本发明对该YEM培养基进行了修改，增加了工业副产物大豆糖蜜碳源，廉价原料谷氨酸钠氮源，通过选择不同的配比，测定发酵液的最终活菌数，对发酵水平进行评价，最后确定本发明的发酵培养基。

大豆糖蜜富含大豆低聚糖、大豆异黄酮、大豆皂苷。还含有少量蛋白质、脂类物质、酚酸及果胶质和其它糖类等。它富含双歧杆菌因子和蔗糖等，可作为能量源和营养素添加在反刍动物和禽类饲料中，降低饲料生产成本，提高饲料适口性，增加动物采食量，例如山东普尔科技有限公司、秦皇岛金海 粮油工业有限公司、石家庄工大生物制品有限公司生产的大豆糖蜜。

谷氨酸钠是目前市场广泛销售的产品，例如上海嘉利知源实业有限公司、中化河北进出口公司秦皇岛公司销售的谷氨酸钠。

所述的斜面培养基、种子培养基与发酵培养基所使用的原料都是目前市场上销售的在菌种培养中通常使用的原料。

所述的斜面培养、种子培养与发酵培养所使用的设备与器具都是目前市场上销售的在菌种培养中通常使用的设备与器具，这些设备与器具消毒处理都是常规的。

运用本技术领域的技术人员熟知的稀释平板计数法，测定了采用本发明培养方法得到的液体紫云英根瘤菌剂，确定液体紫云英根瘤菌剂活菌数是125亿/ml以上。

本发明还涉及利用所述紫云英根瘤菌CGMCC No.4347制成的固体菌剂。

所述固体菌剂中添加草炭，草炭细度为80～150目，所述紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌液与草炭的重量份数比为1∶2～4。

所述固体菌剂的生产方法是将经本发明培养方法发酵所得到的液体紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌剂与灭菌的pH值7.0～7.2的草炭按重量比1∶2～4混匀，再在28℃条件下增殖培养12～36小时。

所述的草炭在使用前需要按照常规方法进行干燥，使干燥草炭的水分含量达到5.0重量％以下。

所述草炭与液体紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌剂混合前需要通过80～150目筛，优选为100目筛。

草炭与所述液体菌剂混合前需要进行灭菌，其灭菌条件为在温度121℃下灭菌0.5～1.5小时。

本发明还涉及采用本发明得到的紫云英根瘤菌剂在种植紫云英中的用途。

在种植紫云英时，按照每亩地为按照本发明方法制备的液体紫云英根瘤 菌剂20～40ml与紫云英种子1.5～2.5kg的比例，将紫云英根瘤菌剂与紫云英种子混拌均匀，然后播种。

在种植紫云英时，按照每亩地为按照本发明方法制备的固体紫云英根瘤菌剂150～250g与紫云英种子1.5～2.5kg的比例，将紫云英根瘤菌剂与紫云英种子混拌均匀，然后播种。

[有益效果]

本发明具有下述有益效果：

采用本发明改进的发酵培养基进行培养时，本发明高效固氮紫云英根瘤菌CGMCC No.4347发酵液活菌数远远高于现有技术。本发明高效固氮紫云英根瘤菌剂接种于紫云英，与不接菌相比，可使紫云英植株鲜重增加241％以上，植株含氮量增加86％以上，产量增加47％以上；与现有生产菌株相比，紫云英植株鲜重增加58％以上，植株含氮量增加18％以上，产量增加12％以上，是紫云英根瘤菌生产及紫云英接种的优良菌株。本发明的紫云英根瘤菌CGMCC No.4347的培养方法简便易行，所用培养基原料来源广泛，价格低廉，适合大规模的工业化生产。

本发明所述的紫云英根瘤菌(Rhizobium astragula)已于2010年11月15日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.4347。

【具体实施方式】

实施例1：紫云英根瘤菌CGMCC No.4347的培养

培养步骤如下：

制备斜面培养基：按照甘露醇10g/L、酵母膏1.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L、琼脂18g/L分别准确称取甘露醇、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠和琼脂，然后用水溶解，溶解完全后用酸或碱 调节达到pH6.8～7.0，再补充水达到上述浓度，待混合均匀后，分装到试管中，在温度121℃下高压灭菌30分钟后，趁热将试管斜放，制成斜面培养基。

制备种子培养基：按照甘露醇10g/L、酵母膏1.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L分别准确称取甘露醇、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠，然后用水溶解，溶解完全后用酸或碱调节达到pH6.8～7.0，再补充水达到上述浓度，待混合均匀后，分装到三角瓶中在温度121℃下高压灭菌30分钟。

制备发酵培养基：按照大豆糖蜜9g/L、甘露醇1g/L、酵母膏0.2g/L、谷氨酸钠0.8g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L分别准确称取大豆糖蜜、甘露醇、酵母膏、谷氨酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠，然后用水溶解，溶解完全后用酸或碱调节达到pH6.8～7.0，再补充水达到上述浓度待混合均匀后，分装到发酵罐中在温度121℃下高压灭菌30分钟。

首先，菌种的活化：接种紫云英根瘤菌(Rhizobium astragula)CGMCCNo.4347至上述制备的斜面培养基，在温度28℃下培养72小时。

然后，种子培养：将活化菌种转接至上述制备的种子液体培养基中，在温度28℃与160～180rpm条件下摇床培养48小时；

发酵培养：以体积计按照1％接种量将前面步骤得到的种子液转接入上述制备的发酵培养基中，在温度28℃与150rpm的条件下培养48小时，得到活菌数为125.6亿/ml的液体紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌剂。

实施例2：优化紫云英根瘤菌CGMCC No.4347发酵培养基

选择价格低廉的工业副产物大豆糖蜜作为碳源，代替YEM培养基中的一部分碳源甘露醇；选择谷氨酸钠作为氮源，代替YEM培养基中的一部分氮源酵母膏。按照与实施例1同样的培养方法进行发酵培养基的优化。

其中，大豆糖蜜需先进行水解，。具体方法为：将浓硫酸(18.4mol/L)用水稀释至1mol/L，然后将固形物含量60％的大豆糖蜜与稀释后的1mol/L硫酸等体积混合，在温度121℃下灭菌进行水解。

在现有YEM培养基中只是改变碳源而不改变其它成分时的试验结果列于表1中。

表1：紫云英根瘤菌CGMCC No.4347培养基

碳源替代试验结果(按重量计，每升)

在现有YEM培养基中只是改变氮源而不改变其它成分时的试验结果列于表2中。

表2：紫云英根瘤菌CGMCC No.4347培养基

氮源的替代试验结果(按重量计，每升)

通过上述试验确定，本发明的改进培养基成分为大豆糖蜜9g/L、甘露醇1g/L、酵母膏0.2g/L、谷氨酸钠0.8g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L，pH6.8～7.0。

本发明的改进培养基与现有技术YEM培养基试验结果比较列于表3。

表3：紫云英根瘤菌CGMCC No.4347培养基的改进

由表3的结果清楚地表明，采用本发明的改良培养基，培养48h后，通过稀释平板计数，液体紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌剂活菌数可达125.6亿/ml，远远高于现有技术YEM培养基的试验结果。

实施例3：固体紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌剂的制备

草炭的处理：将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用生石灰粉调pH值为7.0，在温度121℃下灭菌1小时。

含草炭的紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌剂的获得：将实施例1中所得到的液体紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌剂与处理过的灭菌、干燥、pH 7.0～7.2的草炭按重量份数比1∶2.5混匀，再在28℃下增殖培养24h，得到固体紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌剂，活菌数大于5亿/g。

实施例4：紫云英根瘤菌CGMCC No.4347水培结瘤试验。

该试验采用的紫云英品种为宁波大桥、余江大叶、安徽弋江、福建闽紫5号。将紫云英根瘤菌CGMCC No.4347与上述紫云英种子形成的不同组合，采用本技术领域里技术人员熟知的滤纸桥试管水培法进行紫云英接种组合效果的水培试验，同时以不接所述紫云英根瘤菌的植株为对照，通过结瘤数、植株鲜重进行紫云英根瘤菌水培接种效果评价。

具体效果评价方法如下：

①结瘤管的制备：配制无氮营养液，灌装于结瘤管中，管中装有带孔滤纸，管口用塑料片封住，在温度121℃下进行灭菌。

②种子的催芽：挑选饱满、无损伤紫云英种子，用0.1％升汞(氯化高汞)溶液浸泡，后用无菌水冲洗干净，在温度28～30℃的培养箱中进行催芽。

③种植：将催芽种子置于紫云英根瘤菌CGMCC No.4347液体菌剂中浸泡10～30min；用手术刀将结瘤管口的塑料片以十字形划开；将催芽种子小心放置于滤纸洞内，种子与水面保持一定距离。每处理设置4个重复。在温 度20～30℃下培养，自然光照，定期进行水分补充。紫云英根瘤菌CGMCCNo.4347水培试验效果列于表4。

表4：紫云英根瘤菌CGMCC No.4347水培试验效果

试验结果如表4所示，将紫云英根瘤菌CGMCC No.4347接种紫云英种子后，能促进紫云英植株结瘤，并使植株鲜重比对照增加28.6～57.1％，表明本发明的紫云英根瘤菌CGMCC No.4347对紫云英具有显著的促结瘤、促生长效果。

实施例5：紫云英根瘤菌CGMCC No.4347田间结瘤试验

使用根据实施例1制备的液体紫云英根瘤菌ACCC(中国农业微生物菌种保藏管理中心)13059菌剂与液体紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌剂。

使用本发明制备的液体紫云英根瘤菌CGMCC No.4347菌剂和ACCC13059菌剂与上述大桥牌紫云英种子混拌均匀，阴干后播种，以不接菌剂为对照，每处理3次重复。

试验地块为首次种植紫云英，每小区面积30m²。每亩地使用液体紫云英根瘤菌剂30ml，紫云英种子2.0kg。在紫云英生长中期及收获期对田间效果进行调查，以单株根瘤数、根瘤鲜重、植株鲜重、植株全氮量、产量等作为评价指标。其试验结果列于表5～8。

表5：田间小区接种试验中期紫云英结瘤效果对比

表6：田间小区接种试验中期紫云英植株生长状况对比

表7：田间小区接种试验紫云英植株含氮量对比

表8：田间小区接种试验紫云英产量对比

表5～8田间试验结果表明，将紫云英根瘤菌CGMCC No.4347接种于紫云英种子后，与不接菌剂相比，使紫云英植株鲜重增加241.3％，植株含氮量增加86.6％，产量增加47.6％；与接种现有生产菌株ACCC13059相比，紫云英植株鲜重增加58.9％，植株含氮量增加18.5％，产量增加12.1％。这 些结果充分地表明，本发明的紫云英根瘤菌CGMCC No.4347对紫云英具有显著的促结瘤、固氮及增产效果，为一株高效固氮紫云英根瘤菌菌株。