花生四烯酸作为黄嘌呤氧化酶抑制剂的用途及在制备治疗高尿酸血症或痛风药物中的应用

摘要

本发明涉及一种花生四烯酸作为黄嘌呤氧化酶抑制剂的用途及在制备治疗高尿酸血症或痛风药物中的应用。黄嘌呤氧化酶是高尿酸血症或痛风发生、发展的关键酶，其底物多数是环状小分子，而花生四烯酸是长链状多不饱和脂肪酸，从网站PDB下载黄嘌呤氧化酶的三维结构；从pubchem中下载花生四烯酸的三维结构；利用iGEMDOCK软件进行花生四烯酸与黄嘌呤氧化酶的分子对接并计算对接能量；体外酶活力检测验证花生四烯酸对黄嘌呤氧化酶的抑制作用。本发明不仅发现了花生四烯酸的又一重要生理功能，同时，为从天然产物中筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂以治疗高尿酸血症或痛风提供了更广阔的思路。

说明书

技术领域

本发明属于天然产物类黄嘌呤氧化酶抑制剂领域，尤其是一种花生四烯酸作为黄嘌呤氧化酶抑制剂的用途及在制备治疗高尿酸血症或痛风药物中的应用。

背景技术

花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)，系统名为5，8，11，14-全顺-二十碳四烯酸，是ω-6系列的一种人体重要的多不饱和脂肪酸。由于花生四烯酸是许多二十碳衍生物如前列腺素E₂、前列环素、血栓烷A2和白三烯等物质的前体，因此，花生四烯酸具有很多重要的保健功能，如益智健脑、提高视敏度、酯化胆固醇、抑制血小板凝集、增加血管弹性、降低血液黏度、调节血细胞功能、调节血脂和血糖、保护皮肤、抗炎症等。作为人乳汁的天然成分，花生四烯酸对婴儿的神经及其生理的发育必不可少，对婴幼儿的生长发育以及大脑和视网膜的功能完善具有特别重要的意义，被认为是人类早期发育的必需营养素。

黄嘌呤氧化酶是一种黄素蛋白，存在于各种生物体内，可催化体内的嘌呤底物形成尿酸。人体内黄嘌呤氧化酶过量会导致体内尿酸含量增加，进而引起高尿酸血症或痛风。研究表明，高尿酸血症或痛风的形成和发展还与高血压、肾脏疾病、代谢综合征、高血脂症、糖尿病、胰岛素抵抗和心脑血管疾病等多种病症有关。近年来，在世界范围内痛风发病率呈逐年上升趋势，30岁以上男性以及50岁以上女性的发病率均高于2％，75岁以上患者的发病率高达4.1％，原发性痛风发病率在过去的20年内增加了1倍多。在我国，痛风的发病率也逐年增高，据不完全统计，我国痛风患者人数超过2000万人，高尿酸血症患者人数近6000万。因此，加强对痛风的预防和治疗的研究具有重要的现实意义。目前，对痛风的防治，主要是服用促尿酸排泄药来促进体内尿酸排泄以及服用黄嘌呤氧化酶抑制剂药物来抑制体内尿酸的过多生成，临床应用的促尿酸排泄药主要有丙磺舒、苯溴马隆和氯沙坦等，但它们普遍存在较大的毒副作用，如严重的肝毒性，肾损伤等，临床应用受到了限制。黄嘌呤氧化酶抑制剂由于作用机理明确、疗效显著等优点，备受关注。

自20世纪60年代以来，别嘌呤醇作为唯一上市的黄嘌呤氧化酶抑制剂药物一直用于治疗痛风和高尿酸血症，虽经长期的临床应用，具有良好的治疗效果，但也存在着肾衰竭、肝毒性、皮疹等严重的不良反应，限制了其应用。因此，亟需研究开发毒副作用小、疗效高的新 型黄嘌呤氧化酶抑制剂来治疗高尿酸血症或痛风。

黄嘌呤氧化酶是一种非特异性酶，很多化合物可以做其底物，其中次黄嘌呤和黄嘌呤是最佳底物，其结构与花生四烯酸有很大的不同，花生四烯酸是长链脂肪烃，而黄嘌呤氧化酶的多数底物均为含有苯环的小分子，这也是到目前为止没有任何研究考虑到花生四烯酸对黄嘌呤氧化酶抑制作用的原因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种花生四烯酸作为黄嘌呤氧化酶抑制剂的用途及在制备治疗高尿酸血症或痛风的药物中的应用。

本发明实现目的的方案如下：

一种花生四烯酸作为黄嘌呤氧化酶抑制剂的用途。

一种花生四烯酸在制备治疗高尿酸血症或痛风药物中的应用。

本发明的优点和积极效果是：

1.本发明提供了花生四烯酸的又一重要生理功能。花生四烯酸对黄嘌呤氧化酶具有抑制作用，黄嘌呤氧化酶作用的底物如黄嘌呤、次黄嘌呤、甲基硫基乙醇等都是含有苯环的小分子，而花生四烯酸却是长链状的多不饱和脂肪酸，经过比较发现，花生四烯酸的能量打分低于黄嘌呤氧化酶作用的底物甲基硫基乙醇，说明相对于底物甲基硫基乙醇，花生四烯酸在与黄嘌呤氧化酶进行分子对接过程中消耗的能量更低，即花生四烯酸比黄嘌呤氧化酶作用的底物甲基硫基乙醇更容易进入黄嘌呤氧化酶的活性位点，起到竞争性抑制黄嘌呤氧化酶活性的作用。

2.本发明的技术方案是通过分子对接提出花生四烯酸能够进入黄嘌呤氧化酶的活性中心，为该技术的应用奠定了基础，使体外酶活力检测更具有准确性和合理性。

3.本发明提供了花生四烯酸在制备治疗高尿酸血症或痛风药物中的应用，扩大了治疗高尿酸血症或痛风药物的资源范围。

4.本发明为脂肪酸类化合物抑制黄嘌呤氧化酶研究奠定了基础，具有重要意义，为从天然产物中筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂提供了更广阔的思路。

附图说明

图1为本发明花生四烯酸与黄嘌呤氧化酶活性中心的作用方式示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以 下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明思想为：发现花生四烯酸对黄嘌呤氧化酶具有抑制作用，先通过分子对接提出花生四烯酸能够进入黄嘌呤氧化酶的活性中心，再通过体外酶活力检测验证花生四烯酸的黄嘌呤氧化酶抑制活性。

一种花生四烯酸作为黄嘌呤氧化酶抑制剂的用途以及在制备治疗高尿酸血症或痛风药物中的应用，作用原理及方法如下：

1.黄嘌呤氧化酶三维结构的处理：从网站PDB下载黄嘌呤氧化酶的三维结构，利用iGEMDOCK构建底物的立体坐标，根据坐标在受体的活性位点设定半径 的对接区域。活性中心由Arg880，Thr1010，Glu1261，Glu802，Phe914，Lys1045，Ala1078，Ser1008，Phe1009，Ala1079，Tyr1083，Gln1194构成。

2.花生四烯酸三维结构的处理：从化合物数据库PubChem下载花生四烯酸三维结构，利用软件Openbabel(http://openbabel.org/wiki/install)进行结构转换、结构优化、去氢等操作，将化合物结构转换为可以用于对接的MOL格式。

3.分子对接：利用iGEMDOCK进行黄嘌呤氧化酶与花生四烯酸的分子对接，计算对接能量(-118.373Kcal/mol)。花生四烯酸在黄嘌呤氧化酶的活性位点处，通过羰基与Tyr1083和Lys1045链接，并通过羟基与Lys1045以及Gln1194链接。对接图见图1。从图1可以看出，花生四烯酸在黄嘌呤氧化酶的活性位点处，通过羰基与Tyr1083和Lys1045链接，并通过羟基与Lys1045以及Gln1194链接。

采用iGEMDOCK软件将花生四烯酸与黄嘌呤氧化酶进行分子对接，经打分和排序，结果如表1所示。

表1花生四烯酸与黄嘌呤氧化酶进行分子对接的得分

从表1中可以看出，花生四烯酸的能量打分低于黄嘌呤氧化酶的底物MTE(甲基硫基乙醇)，说明相对于该底物，花生四烯酸在与黄嘌呤氧化酶进行分子对接过程中消耗的能量更低，即花生四烯酸比MTE更容易进入黄嘌呤氧化酶的活性位点，起到竞争性抑制黄嘌呤氧化酶活性的作用。

4.体外酶活力检测验证花生四烯酸对黄嘌呤氧化酶的抑制作用：将待测的花生四烯酸溶 解于二甲基亚砜中，用缓冲液配制不同浓度的溶液(见表2)。在总体积为1.5mL的离心管中，依次加入250μL样品液，175μL缓冲液(pH＝7.5)和200μL黄嘌呤氧化酶液(0.1U/mL)，充分混匀，25℃下静置15min，加入250μL黄嘌呤溶液(1.5mol/L)使反应开始，反应30mins，加入125μL HCl(1mol/L)使反应终止；以别嘌呤醇作为阳性对照；由全波长酶标仪检测产物尿酸在290nm特征吸收峰处的吸光值。计算出花生四烯酸体外对黄嘌呤氧化酶抑制作用的IC₅₀值为87.2μg/mL。

表2不同浓度花生四烯酸体外抑制黄嘌呤氧化酶活性的抑制率以及IC₅₀

从表2可以看出，阳性对照别嘌呤醇的IC₅₀为1.33μg/mL，花生四烯酸的IC₅₀为87.2μg/mL，花生四烯酸对黄嘌呤氧化酶的活性具有一定程度的抑制效果。

5.体内小鼠模型实验证明了花生四烯酸对黄嘌呤氧化酶的抑制作用：将昆明小鼠随机分成6组，即正常对照组，高尿酸血症模型组，花生四烯酸低、中、高剂量组以及别嘌呤醇阳性对照组，每组10只。花生四烯酸低、中、高剂量组每天按50、100、200mg/(kg·d)的剂量灌胃给药，别嘌呤醇组按10mg/(kg·d)剂量给药，正常组和模型组每天给予等剂量的CMC-Na(羧甲基纤维素钠)溶液，连续7d。第7d给药前2h断食，1h后按280mg/kg的剂量腹腔注射氧嗪酸钾溶液，正常对照组腹腔注射等剂量的生理盐水，给药后1h摘眼球取血，室温凝结1h，3500r/min离心5min，得血清，用尿酸试剂盒(磷钨酸法)检测血尿酸水平。计算出花生四烯酸低、中、高剂量组的血尿酸水平分别为5.05，4.35，3.48mg/dL。其中高尿酸血症模型组的血尿酸水平为5.35mg/dL。

表3花生四烯酸对高尿酸血症小鼠血尿酸水平的影响

注：与正常组比较，*P＜0.01，**P＜0.001；与模型组比较，▲P＜0.01，▲▲P＜0.001

由表3可知，与正常组相比，高尿酸血症模型组与花生四烯酸低剂量组小鼠血尿酸水平均有极显著的差异(P＜0.01)，其余各组无显著性差异(P＞0.05)。与模型组比较，花生四烯酸低剂量组小鼠血尿酸水平有非常显著的差异(P＜0.01)，而花生四烯酸中、高剂量组和别嘌呤醇组有极显著的差异(P＜0.001)。花生四烯酸降高尿酸血症模型小鼠血尿酸水平存在一定的量效关系，且中、高剂量能使模型小鼠血尿酸水平恢复至正常水平。别嘌呤醇能极显著地降低高尿酸血症小鼠血尿酸水平，并降至正常水平以下。