裂谷热病毒荧光定量PCR检测新方法及裂谷热病毒检测PCR体系

摘要

本发明公布了一种裂谷热病毒荧光定量PCR检测新方法及裂谷热病毒检测PCR体系，由引物和探针、Premix Ex Taq反应液、灭菌Tris水组成，该引物和探针检测特异性好，灵敏度高，非常适用于裂谷热病毒，与登革热病毒无交叉反应。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及裂谷热病毒的快速定性和定量检测方法及裂谷热病毒检测PCR体系，提供一对特异性引物和探针。

背景技术

裂谷热(Rift Valley fever，RVF)又名绵羊和牛传染性地方流行性肝炎，是非洲流行的一种致命的传染病，通过蚊子叮咬传染人类和牲畜，主要症状是急性腹泻和高烧，进而严重损害人和牲畜的肝、肾，部分病人还会因血管破裂而死亡。国际兽疫局(OIE)将其列为A类疫病。本病对绵羊、山羊、牛的危害较为严重，可引起怀孕动物流产和新生畜高比例死亡，大龄非怀孕动物也较易感，但临床抗病性较强。直到2000年，RVF只限定在非洲流行循环，但是最近在阿拉伯半岛暴发了致死性的RVF，引人注目地表明急需要快速诊断、有效处理和预防这一疾病。RVF病原即为裂谷热病毒(Rift Valley fever virus，RVFV)，属于布尼病毒科(Bunyaviridae)白蛉病毒属(Phlebovirus)。

目前用于裂谷热病毒的检测方法已经有病毒分离、琼脂糖免疫扩散、免疫荧光染色、ELISA法、病毒中和试验、血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验等等很多种检测方法，但荧光定量PCR核酸检测的方法仍为公认的一种更直观、更快速的一种适合早期诊断的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种裂谷热病毒荧光定量PCR检测新方法及裂谷热病毒检测PCR体系，该方法能够快速定性和定量检测裂谷热病毒，包括一对特异性更高、灵敏度高、重复性好的引物和探针。

为实现上述目的，本发明裂谷热病毒荧光定量PCR检测新方法中设计采用的引物探针为：

  Name   Sequence   Position   Tm℃   Modification   FP   CATGGATTCTATATTATCAAAACAGC  18-43   57.3    RP   AATGTTGGAAGTGCCAGAGTTAG  100-122   58.2  

 Probe   TGGTTTTGTTAGAGTGCCAATCAAGCA  57-83   68.2   HEX/BHQ-1

进一步，所述的裂谷热病毒荧光定量PCR检测新方法，具体为：

1)设计引物探针；

2)根据仪器选择荧光素；

3)合成引物和探针；

4)制备阳性质粒标准品；

5)运行PCR；

6)数据分析；

7)提取病毒RNA进行体系验证。

进一步，所述步骤2)中荧光素的供选择的荧光发射基团有6-FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red，荧光淬灭基团有BHQ-1、BHQ-2、Lowa BlackTMRQ、Lowa BlackTMFQ、Dabcyl。

进一步，所述步骤4)中采取基因合成方式制作阳性质粒CBG234-3作为阳性样品：将引物设计过程中筛选出的高保守区域bp18-bp122前后分别延长10～50bp进行基因合成，然后将其克隆至pMD19-T载体中，即为所述阳性质粒样品，编号CBG234-3。

进一步，所述步骤5)中荧光定量PCR反应适用于所有荧光定量PCR反应仪。

进一步，所述荧光定量PCR仪包括SmartCyclerII、ABI实时PCR系统、BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪。

进一步，所述步骤5)中最佳扩增条件为：

一种检测裂谷热病毒PCR体系，该体系包括引物或者其他能与裂谷热全长序列特异性结合并扩增的等同引物，其相似同源性不能超过90％，引物序列如下：

一种检测裂谷热病毒PCR体系，包括引物及能与裂谷热全长序列特异性探针，探针序列如下：

能与裂谷热全长序列特异性结合并扩增的等同探针，其位点区域的覆盖率不能超过50％，其同源性不能超过70％。

本发明的设计一对新的引物探针，结合运用SmartCyclerII建立一种新的荧光定量PCR体系检测裂谷热病毒。通过序列比对的方式挑选出裂谷热病毒基因组中高度保守的序列，在此序列上设计一对引物及一条Taqman探针，建立实时荧光定量PCR反应体系，并进行优化，检测该方法的灵敏度和特异性。

附图说明

图1为扩增曲线的二维显示图；

图2为引物探针浓度的筛选示意图；

图3为灵敏度检测示意图；

图4为重复性检测示意图；

图5为标准曲线图。

具体实施方式

本发明裂谷热病毒荧光定量PCR检测新方法的工作原理即是利用荧光信号的变化定性分析，实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。本发明还涉及上述检测体系所包含的所有内容。

该方法包括以下步骤：

1)设计引物探针；

2)根据仪器选择荧光素；

3)合成引物和探针；

4)制备阳性质粒标准品；

5)运行PCR；

6)数据分析；

7)提取病毒RNA进行体系验证。

1、引物探针的设计

根据拟研究基因名称裂谷热病毒(Rift Valley fever virus，RVFV)，在genebank中找到相应的全基因序列(www.ncbi.nl m.nih.gov)，运用DNASTAR软件进行同源性分析和blast序列分析，筛出高度保守区域bp18-bp122作为目标序列，采用引物设计 软件Primer Premier 5进行引物探针的设计，序列见表1。

表1荧光定量PCR检测裂谷热病毒的引物和探针

  Name   Sequence  Position  Tm℃   Modification  FP   CATGGATTCTATATTATCAAAACAGC  18-43   57.3    RP   AATGTTGGAAGTGCCAGAGTTAG  100-122   58.2    Probe   TGGTTTTGTTAGAGTGCCAATCAAGCA  57-83   68.2   HEX/BHQ-1

2、荧光素的选择

使用仪器为美国Cepheid公司的SmartCyclerII，荧光发射基团采用特性最为稳定的HEX基团，荧光淬灭基团采用BHQ-1。

3、引物及探针的合成交予宝生物工程(大连)有限公司完成。

4、本发明采取基因合成方式制作阳性质粒作为阳性样品。将引物设计过程中筛选出的高保守区域bp18-bp122前后分别延长30～50bp进行基因合成，然后将其克隆至pMD19-T载体中，即为我们的阳性质粒样品，编号CBG234-3。

5、质粒标准品的制备

由委托公司合成并提取的阳性质粒样品原液，通过超微量紫外分光光度计测得浓度为310ng/μl，根据单链DNA的拷贝数计算公式“拷贝数浓度(copies/μl)＝DNA浓度(ng/μl)×6.02×1023(copies/mol)/324×2×(载体碱基数+目的基因碱基数)”计算得知质粒原液的DNA拷贝数浓度约为1×10¹¹copies/μl。使用EASY Dilution(一种专门用于标准品稀释使用的液体，由大连宝生物公司生产)进行梯度稀释最终得到1×10⁰～1×10¹⁰copies/μl的质粒标准品。

6、引物和探针溶解稀释至所需浓度并避光保存。

引物一般稀释到10μm/L，探针稀释到5μm/L，密封并避光保存到-20℃冰箱。稀释所用水为灭菌Tris水(Ph7.0～8.0)。

7、Real-Time PCR扩增

选用的扩增试剂盒为Premix Ex Taq试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司。反应体系组分及其体积见表2。

表2

扩增条件如下

8、数据分析

9、提取病毒RNA，进行反转录，所得cDNA使用灭菌水梯度稀释，取代阳性样品进行检测验证。

阈值的选择

荧光定量PCR各种参数优化的过程中，Ct值为最关键的参考因素。计算Ct值的方法有结合交点法与二次曲线峰值法两种。我们将反应扩增曲线图中呈现的阈值线进行上下拖移，结合扩增速度变化率的抛物线来观察，当阈值线与扩增曲线的交点所对应的Ct值恰好通过二次曲线的峰值时，此时的阈值即为最佳阈值，Ct值也为最准确的Ct值。参考图1，确定本体系最佳阈值为30。引物探针浓度的优化

1.首先稀释引物探针至低浓度备用，引物稀释到10μm/L，探针到5μm/L；

2.分别向各体系加入0.25μL、0.5μL、1μL已稀释上下游引物(10μm/L)，0.25μL、0.5μL、1μL Taqman探针(5μm/L)，同时运行PCR，体系中其他组分按表2配制；(考虑到体系成分过多易产生抑制，故将引物探针的加入量控制在1μL为上限。)

3.比较法优选最佳反应浓度组合，结果如图2所示：A1、A2、A3是体系加入1μL引物探针的扩增曲线，荧光值显示已超过1000，Ct值较小；A4、A5、A6是加入0.5μL引物探针的扩增曲线，荧光值约550左右，Ct值较小；A7、A8、A9是加入0.25μL引物探针的扩增曲线，荧光值在170上下，Ct值偏大；A10 为阴性对照。根据荧光信号强，Ct值小的原则第一组看似应该为最佳浓度，但第一组以及第二组对应的阈值都非常高，通常经验阈值取到30即可，过高的阈值会影响检测结果的准确度，而第三组浓度非常适于30的阈值，且对应的Ct点恰好在二维曲线的峰值点上，故25μL体系中，最终确定最佳引物(10μm/L)探针(5μm/L)浓度为各加入0.25μL，即100×50nm/L。

退火温度的选择

理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时要足够高，以减少非特异性结合。在设置退火温度时如下进行：以低于设计引物时估算的Tm5℃作为起始的退火温度，以2℃为增量，逐步提高退火温度。初步设定5组温度：52℃，54℃，56℃，58℃，60℃。五组退火温度下均可检测出目的片段，证明该引物和探针性能较好，可适应的温度范围较宽。但荧光信号最强同时Ct值最小的温度为56℃，最终确定最佳退火温度为56℃。

灵敏度的测定

按照已优化的反应体系和反应程序检测梯度模板，图3.为中A1-A6为1e¹copies/μl模板扩增曲线，五阳性一阴性；A7-A15为1e⁰copies/μl模板扩增曲线，八阳性一阴性，认为最低检测限可达到个数级，1e⁰copies/μl稀释度的DNA。

重复性检测

图4为1e⁶～1e²copies/μl五个浓度梯度的DNA模板荧光定量PCR，每个梯度均作了2到3个平行实验，图中各梯度模板所产生的扩增曲线都产生了即为一致的Ct值，重复性非常好。

特异性检验

用所建立的方法检测与裂谷热临床表现接近的登革热的病原登革病毒，结果为阴性。表明本次所设计的引物探针特异性很高。

标准曲线的建立

体系的优劣可通过扩增效率e来反映，e值越趋近于1，说明扩增效率越接近100％，反应体系越佳；e＜1，说明体系扩增效率较低，体系需要优化；e＞1，说明体系中含有抑制物，需要降低甚至排除抑制物的干扰。该领域内公认的扩增效率适宜范围在0.8-1.2之间。采用1e⁸～1e⁴copies/μl模板进行扩增，所得标准曲线为图5，扩增函数

Y＝-0.297X+13.102，扩增效率e＝10-k-1＝0.98＝98％。(k＝-0.297)

本发明的目的就是设计一对新的引物探针，结合运用SmartCyclerII建立一种新的荧光定量PCR体系检测裂谷热病毒。通过序列比对的方式挑选出裂谷热病毒基因组中高度保守的序列，在此序列上设计一对引物及一条Taqman探针，建立实时荧光定量PCR反应体系，并进行优化，检测该方法的灵敏度和特异性。本发明检测方法非常适用于裂谷热病毒，与登革热病毒无交叉反应。