利用微生物碳酸酐酶催化制备碳酸钙的方法

摘要

本发明提供了一种利用微生物碳酸酐酶催化制备碳酸钙的方法，在含有钙离子和碳酸氢根离子溶液的液体体系或含有钙离子溶液且利用碳酸氢铵溶液释放CO2的气体扩散体系中，添加从微生物培养物中提取制备的碳酸酐酶，在室温下进行振荡反应，初始pH控制在5～10，将产生的沉淀取出，过滤、洗涤、烘干，得到碳酸钙。本发明不仅充分利用了微生物资源，而且利用了酶催化反应的专一性、高效性特点，加速沉积制备碳酸钙，具有资源丰富、工艺简单、环境清洁、成本低廉、高效快速等优点。所沉积制备的碳酸钙纯度高，为方解石晶型碳酸钙，不仅可以作为工业上的填料，还可用于建筑工程和建筑物以及石质景观和石刻文物裂缝的修补。

说明书

技术领域

本发明涉及一种碳酸钙的制备方法，特别是一种利用微生物碳酸酐酶催化制备碳酸钙的方法。

背景技术

碳酸钙是一种重要的无机矿物，是地球中最丰富的矿产资源。碳酸钙不仅广泛应用于橡胶、塑料、涂料行业，还可应用于油墨、造纸、电缆、医药、日用化工等行业，并且在除硫和污水处理等环保领域也得到广泛应用。此外，有研究表明，碳酸钙在石质景观和石刻文物的保护与修复以及重大建筑工程和重要历史建筑物裂缝的修补方面能发挥重要作用。

目前，碳酸钙的制备主要有两种方法，即化学加工法和机械方法。化学加工法主要生产轻质碳酸钙，包括碳化法、纯碱氯化钙法、苛化碱法、联钙法和苏尔维(Solvay)法等，这些方法的主要缺点是能耗大，容易引起环境污染，造成生态环境破坏。机械方法主要生产重质碳酸钙，生产工艺有干法和湿法两种，主要缺点是能耗大、粉尘多、质量低。

有研究和专利表明，利用微生物沉积制备碳酸钙也是一种有效的方法，如钱春香等在中国专利(申请号200510094744.5)中提出利用巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)产生脲酶，分解培养基中的尿素致使溶液中pH升高、CO₃^2-浓度增加，从而诱导碳酸钙的沉积。Stocks-Fischer等利用巴氏芽孢杆菌在沙中诱导出碳酸钙的沉积。Ferris等在不同温度的人工地下水中利用巴氏芽孢杆菌的尿素水解作用诱导了碳酸钙的沉积。利用微生物沉积制备碳酸钙的方法，具有资源丰富、工艺简单、环境清洁、成本低廉等优点。

发明内容

本发明提供一种利用微生物碳酸酐酶的催化作用加速沉积制备碳酸钙的方法。

本发明利用微生物产生的碳酸酐酶的催化作用沉积制备碳酸钙，不仅具有前述微生物制备碳酸钙方法的诸多优点，而且由于碳酸酐酶能催化CO₂和HCO₃^-的相转化反应，从而能加速碳酸钙的沉积。当HCO₃^-是可溶性无机碳(DIC)的来源时，整个反应如式(1)～式(2)所示：

HCO₃^-+H⁺→H₂O+CO₂(1)

Ca²⁺+2HCO₃^-→CaCO₃+H⁺+HCO₃^-→CaCO₃↓+H₂O+CO₂(2)

当CO₂是的来源时，整个反应如式(3)～式(4)所示：

CO₂+H₂O→HCO₃^-+H⁺(3)

Ca²⁺+HCO₃^-→CaCO₃↓+H⁺(4)

本发明利用微生物产生的碳酸酐酶，分别通过两种含有钙离子溶液的反应体系来实现加速沉积制备碳酸钙的目的。

微生物碳酸酐酶的制备方法如下：(1)胞外碳酸酐酶采用如下制备方法：在添加10μM硫酸锌的培养基中接种微生物，30℃下振荡培养18～24小时，培养液冷冻离心，收集上清液，菌体冷藏备用。上清液用饱和硫酸铵盐析后离心取蛋白沉淀，将蛋白沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中过G100凝胶柱，收集酶活性高的部分，透析，再过DEAE-纤维素离子交换柱，收集酶活性高的部分，透析，获得胞外碳酸酐酶溶液。(2)胞内碳酸酐酶采用如下制备方法：取前述的菌体，加入磷酸盐缓冲液，在冰浴条件下研磨后冷冻离心，取上清液，随后步骤同前面所述的胞外碳酸酐酶的制备方法，从而获得胞内碳酸酐酶溶液。(3)混合碳酸酐酶采用如下制备方法：在添加10μM硫酸锌的培养基中接种微生物，30℃下振荡培养18～24小时，培养液在0～4℃用闪式提取器或球磨机进行菌体破碎后冷冻离心，取上清液，将上清液用饱和硫酸铵盐析，随后步骤同前面所述的胞外碳酸酐酶的制备方法。

反应体系(1)是含有钙离子和碳酸氢根离子溶液的液体体系，向该液体体系中加入微生物碳酸酐酶，酶浓度大于1.5U/ml，初始pH控制在5～10，在室温下振荡反应，将产生的沉淀取出，过滤、洗涤、烘干，得到碳酸钙。反应体系(2)是含有钙离子溶液且利用碳酸氢铵溶液释放CO₂的气体扩散体系，即采用密闭反应装置，该装置分为上下两层，中间有可透气的隔板为界，下层装有碳酸氢铵溶液；上层放置装有钙离子溶液的容器，向钙离子溶液中加入微生物碳酸酐酶，酶浓度大于1.5U/ml。整个密闭反应装置放置于振荡器上振荡反应，将产生的沉淀取出，过滤、洗涤、烘干，得到碳酸钙。

与现有技术相比，本发明不仅充分利用了微生物资源，而且利用了酶催化反应的专一性、高效性特点，加速沉积制备碳酸钙，具有资源丰富、工艺简单、环境清洁、成本低廉、高效快速等优点。所沉积制备的碳酸钙纯度高，为方解石晶型碳酸钙，不仅可以作为工业上的填料，还可用于建筑工程和建筑物以及石质景观和石刻文物裂缝的修补。

附图说明

图1是在含有氯化钙和碳酸氢钠溶液的液体体系中微生物胞外碳酸酐酶催化制备碳酸钙的X射线衍射分析图谱。

图2是在含有氯化钙和碳酸氢钠溶液的液体体系中微生物胞外碳酸酐酶催化制备碳酸钙在扫描电子显微镜下的颗粒形貌。其中，(a)碳酸钙颗粒总体分布；(b)碳酸钙颗粒微观形貌。

图3是在含有氯化钙和碳酸氢钠溶液的液体体系中微生物胞内碳酸酐酶催化制备碳酸钙的X射线衍射分析图谱

图4是在含有氯化钙和碳酸氢钠溶液的液体体系中微生物胞内碳酸酐酶催化制备碳酸钙在扫描电子显微镜下的颗粒形貌。其中，(a)碳酸钙颗粒总体分布；(b)碳酸钙颗粒微观形貌。

图5是在气体扩散体系中微生物胞外碳酸酐酶催化制备碳酸钙的X射线衍射分析图谱。

图6是在气体扩散体系中微生物胞外碳酸酐酶沉积碳酸钙在扫描电子显微镜下的颗粒形貌。其中，(a)碳酸钙颗粒总体分布；(b)碳酸钙颗粒微观形貌。

图7是在气体扩散体系中微生物胞内碳酸酐酶催化制备碳酸钙的X射线衍射分析图谱。

图8是在气体扩散体系中微生物胞内碳酸酐酶催化制备碳酸钙在扫描电子显微镜下的颗粒形貌。其中，(a)碳酸钙颗粒总体分布；(b)碳酸钙颗粒微观形貌。

图9是在含有氯化钙和碳酸氢钠溶液的液体体系中混合微生物碳酸酐酶催化制备碳酸钙在扫描电子显微镜下的颗粒形貌。其中，(a)碳酸钙颗粒总体分布；(b)碳酸钙颗粒微观形貌。

图10是在气体扩散体系中混合微生物碳酸酐酶催化制备碳酸钙在扫描电子显微镜下的颗粒形貌。其中，(a)碳酸钙颗粒总体分布；(b)碳酸钙颗粒微观形貌。

具体实施方式

实施例1

微生物胞外碳酸酐酶的制备及其在含有氯化钙和碳酸氢钠溶液的液体体系中催化制备碳酸钙。在添加10μM硫酸锌的细菌培养基中接种蜡样芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)，在30℃、120r/min下培养24小时，培养液5000r/min冷冻离心15分钟后收集上清液，菌体冷藏备用，上清液用70％饱和度的硫酸铵盐析12小时，离心取蛋白沉淀，蛋白沉淀溶解于0.2mol/L pH8.0的磷酸盐缓冲液中，通过G100凝胶柱，用0.2mol/L pH8.0的磷酸盐缓冲液洗脱，收集酶活性高的部分，置于透析袋透析24小时后将透析液通过DEAE-纤维素离子交换柱，先用0.2mol/L pH8.0的磷酸盐缓冲液平衡，再用0.2mol/L pH6.0的磷酸盐缓冲液洗脱，收集酶活性高的部分，置于透析袋透析24小时后获得胞外碳酸酐酶溶液，检测其酶活性为8.0U/mL。配制碳酸氢钠和氯化钙溶液置于三角瓶中，碳酸氢钠和氯化钙的浓度均为25.2mmol/L，加入制备的胞外碳酸酐酶溶液，使酶浓度达到4.0U/mL，初始pH控制在6.5，在20℃下振荡反应24小时后将产生的沉淀取出，过滤、洗涤、烘干，得到碳酸钙。

实施例2

微生物胞内碳酸酐酶的制备及其在含有氯化钙和碳酸氢钠溶液的液体体系中催化制备碳酸钙。将实施例1得到的菌体，加入0.2mol/L pH8.0的磷酸盐缓冲液，使菌体浓度为10％，在冰浴条件下研磨30分钟，5000rpm下冷冻离心15分钟，取上清液，将上清液用70％饱和度的硫酸铵盐析12小时，随后步骤同实施例1中所述的胞外碳酸酐酶的制备方法，获得胞内碳酸酐酶溶液，检测其酶活性为8.2U/mL。配制碳酸氢钠和氯化钙溶液置于三角瓶中，碳酸氢钠和氯化钙的浓度均为25.2mmol/L，加入制备的胞内碳酸酐酶溶液，使酶浓度达到2.0U/mL，初始pH控制在6.5，在20℃下振荡反应24小时后将产生的沉淀取出，过滤、洗涤、烘干，得到碳酸钙。

实施例3

微生物胞外碳酸酐酶在气体扩散体系中催化制备碳酸钙。胞外碳酸酐酶的制备方法同实施例1，检测其酶活性为8.0U/mL。在密闭的玻璃干燥器中，上层放置50mL小烧杯，里面装有25.0mmol/L氯化钙溶液，其中添加胞外碳酸酐酶，酶浓度为1.8U/mL，初始pH控制在6.5；中间有可透气的隔板为界；下层装有400mL 0.1mol/L的碳酸氢铵溶液。将整个干燥器置于20℃、100r/min下振荡反应24小时，将产生的沉淀取出，过滤、洗涤、烘干，得到碳酸钙。

实施例4

微生物胞内碳酸酐酶在气体扩散体系中催化制备碳酸钙。胞内碳酸酐酶的制备方法同实施例2，检测其酶活性为8.2U/mL。在密闭的玻璃干燥器中，上层放置50mL小烧杯，里面装有25.0mmol/L氯化钙溶液，其中添加胞内碳酸酐酶，酶浓度为2.2U/mL，初始pH控制在6.5；中间有可透气的隔板为界；下层装有400mL 0.1mol/L的碳酸氢铵溶液。将整个干燥器置于20℃、100r/min下振荡反应24小时，将产生的沉淀取出，过滤、洗涤、烘干，得到碳酸钙。

实施例5

混合微生物碳酸酐酶的制备及其在含有氯化钙和碳酸氢钠溶液的液体体系中催化制备碳酸钙。将实施例1中得到的含有菌体的培养液在闪式提取器中进行菌体破碎，5000rpm下冷冻离心15分钟，取上清液，后续步骤同实施例1中所述的胞外碳酸酐酶的制备方法，获得混合碳酸酐酶溶液，检测其酶活性为8.5U/mL。配制碳酸氢钠和氯化钙溶液置于三角瓶中，碳酸氢钠和氯化钙的浓度均为25.2mmol/L，加入制备的混合微生物碳酸酐酶溶液，使酶浓度达到3.0U/mL，初始pH控制在6.5，20℃下振荡反应24小时后将产生的沉淀取出，过滤、洗涤、烘干，得到碳酸钙。

实施例6

混合微生物碳酸酐酶在气体扩散体系中催化制备碳酸钙。混合微生物碳酸酐酶的制备方法同实施例5，检测其酶活性为8.5U/mL。在密闭的玻璃干燥器中，上层放置50mL小烧杯，里面装有25mmol/L氯化钙溶液，其中添加混合微生物碳酸酐酶，酶浓度为2.0U/mL，初始pH控制在6.5；中间有可透气的隔板为界；下层装有400mL 0.1mol/L的碳酸氢铵溶液。整个干燥器置于20℃、100r/min下振荡反应24小时，将产生的沉淀取出，过滤、洗涤、烘干，得到碳酸钙。