一种调肝补肾、化瘀祛斑的药物组合物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种可以调肝补肾，化瘀祛斑的药物组合物及其制备方法、质量检测方法和用途。本发明药物组合物原料药组成为：柴胡、丹参、熟地、白芷、牡丹皮和甘草，在制备过程中先将牡丹皮蒸馏得结晶，将其他原料药水煎煮，浓缩得浸膏，与结晶混合制成临床可接受的各种剂型。本发明药物组合物的质量检测方法包括鉴别和丹参素、丹皮酚含量测定方法中的一种或几种。药效实验表明，本发明药物组合物具有养荣祛斑的作用，可以有效抑制B16细胞增殖，抑制B-16黑色素瘤细胞株的酪氨酸酶活性，抑制黑色素形成，抑制紫外线照射致皮肤损伤模型小鼠血清过氧化脂质形成，达到治疗黄褐斑的目的。

说明书

发明领域

本发明涉及一种药物组合物及其制备方法，特别涉及一种可以调肝补肾，化瘀祛斑的药物组合物及其制备方法、质量检测方法和用途。

背景技术

黄褐斑，从青春期到绝经期的妇女均有发生，特别是由于工作压力，生活紧张，更易导致发病。该病已影响到广大妇女的心身健康，因此对该病的治疗越一越引起重视。

黄褐斑的病因及发病机制尚不明确。其发病因素较多，发病过程较为复杂，临床大多表现为黑色素过量表达及代谢障碍所导致的面部色素过度沉着。一般认为影响黑色素合成和代谢过程的细胞内外因素均可能诱发本病，目前研究较多的包括体内氧化抗氧平衡失调、内分泌失调、皮损区微生态失衡、微量元素异常、血液流变学性质异常、日照及遗传。

黄褐斑的治疗方式主要包括：药物疗法、生物疗法、化学疗法、物理疗法等。目前仍无特殊有效治疗药物，可根据不同病因给予分别处理，治疗途径大多是阻止黑色素细胞的增生，抑制黑色素小体的形成和促使其分解。以对症治疗为主，虽有一定的疗效，但毒副作用亦明显，如产生外源性褐黄病，皮肤萎缩，永久性脱色造成的“点彩样”，有些还可致肾毒性及神经、精神症状。

局部应用氢醌(Hydroquinone)治疗黄褐斑最常用，疗效也较肯定，常用浓度2％-4％。氢醌可能通过抑制酪氨酸酶活性、阻断黑色素生成，也可能抑制DNA和RNA合成，降解色素颗粒，破坏色素细胞结构，以达到治疗效果。氢醌长时间外用可出现色素过度减退及皮炎后色素沉着。同类的干扰色素沉着的药物还包括酚化合物、维甲酸、壬二酸及氢醌复方制剂等。此外，化学剥脱术和激光治疗均有应用。

目前动物实验或临床观察报道对黄褐斑有效的中药有排毒养颜胶囊等数种，近期临床报道逐渐增多，但缺乏客观疗效标准和对其进行深入地药效学方面的研究，对黄褐斑的疗效验称满意，所以鲜有运用。内服药物很少，而且疗效极不确切。外用涂抹剂多为保健品和护肤品，更不能获得满意的效果。发挥中医药学对人体整体调节的优势，研发出中药祛斑新药已为临床必需，而且可行。

发明内容

本发明目的在于公开一种调肝补肾，化瘀祛斑的药物组合物，本发明的目的还在于公开该药物组合物的制备方法，本发明的目的还在于公开该药物组合物的质量检测方法，本发明的目的还在于公开该药物组合物的用途。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明药物组合物的原料药组成为：

柴胡300-400重量份    丹参300-800重量份      熟地300-800重量份

白芷300-400重量份    牡丹皮300-400重量份    甘草50-150重量份。

本发明药物组合物的原料药组成优选为：

柴胡333.3重量份    丹参500重量份        熟地500重量份

白芷333.3重量份    牡丹皮333.3重量份    甘草100重量份。

本发明药物组合物的原料药组成优选为：

柴胡310重量份    丹参750重量份      熟地350重量份

白芷390重量份    牡丹皮310重量份    甘草130重量份。

本发明药物组合物的原料药组成优选为：

柴胡390重量份    丹参350重量份      熟地750重量份

白芷310重量份    牡丹皮390重量份    甘草70重量份。

取上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺制成临床药用剂型：颗粒剂、丸剂、散剂、胶囊剂、片剂、缓释剂、口服液体制剂或冻干粉针剂。

本发明药物组合物的制备方法包括如下步骤：

取原料药，牡丹皮用10-20倍量的水蒸馏，收集牡丹皮5-15倍量的蒸馏液，于0～10℃下冷藏6-12小时，滤过，得丹皮酚结晶I，滤液加入牡丹皮重量3-8％的氯化钠，重蒸馏，收集牡丹皮2-4倍量的蒸馏液，于0～10℃下冷藏6-12小时，滤过，得丹皮酚结晶II，合并丹皮酚结晶I和II，于30-50℃低温干燥，即得丹皮酚，备用，滤液A另器收集，药渣与其余柴胡、丹参、熟地、白芷和甘草五味原料药，加水煎煮1-3次，每次加水5-12重量倍，每次煎煮1-3小时，滤过，合并滤液得滤液B，混合滤液A和B，浓缩至50～70℃下相对密度为1.10～1.35的稠膏，干燥，粉碎，过60目筛，得浸膏粉，备用；取上述丹皮酚研细，与占浸膏粉重量1-1.5％的硬脂酸镁混合均匀，加入上述浸膏粉中，混匀，加入常规辅料，按照常规工艺制成临床药用剂型：颗粒剂、丸剂、散剂、胶囊剂、片剂、缓释剂、口服液体制剂或冻干粉针剂。

本发明药物组合物的制备方法优选包括如下步骤：

取原料药，牡丹皮用15倍量的水蒸馏，收集牡丹皮10倍量的蒸馏液，于0～10℃下冷藏8小时，滤过，得丹皮酚结晶I，滤液加入牡丹皮重量5％的氯化钠，重蒸馏，收集牡丹皮3倍量的蒸馏液，于0～10℃下冷藏8小时，滤过，得丹皮酚结晶II，合并丹皮酚结晶I和II，于40℃低温干燥，即得丹皮酚，备用，滤液A另器收集，药渣与其余柴胡、丹参、熟地、白芷和甘草五味原料药，加水煎煮二次，第一次加水10重量倍，第2次加水8重量倍，每次煎煮2小时，滤过，合并滤液得滤液B，混合滤液A和B，浓缩至60～65℃下相对密度为1.20～1.25的稠膏，干燥，粉碎，过60目筛，得浸膏粉，备用；取上述丹皮酚研细，与占浸膏粉重量0.5％的硬脂酸镁混合均匀，加入上述浸膏粉中，混匀，加入常规辅料，按照常规工艺制成临床药用剂型：颗粒剂、丸剂、散剂、胶囊剂、片剂、缓释剂、口服液体制剂或冻干粉针剂。

本发明药物组合物的质量检测方法包括如下鉴别和含量测定方法中的一种或几种：

鉴别：

A.取本发明药物组合物日用制剂量的1/12，加水20-30体积份使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2-4次，每次用10-20体积份，合并正丁醇提取液，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇0.5-1.5体积份使溶解，作为供试品溶液；

另取柴胡对照药材1重量份，加甲醇10-30体积份，加热回流20-40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10-30体积份，加热回流20-40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10-30体积份使溶解，加热回流0.5-1.5小时，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2-4次，每次用10-20体积份，合并正丁醇提取液，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇0.5-1.5体积份使溶解，制备对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.003-0.008体积份，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水＝10-15∶5-10∶1-3在5-15℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.5-1.5％对二甲氨基苯甲醛硫酸乙醇溶液，取0.5-1.5％对二甲氨基苯甲醛硫酸溶液1mL，用乙醇稀释至10mL，取该溶液喷硅胶G薄层板，在60-80℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；置紫外灯365nm下检视，显相同黄色的荧光斑点；

B.取本发明药物组合物日用制剂量的1/12，加水20-40体积份使溶解，滤过，滤液用稀盐酸调PH值至1-2，置分液漏斗中，用醋酸乙酯振摇提取2-4次，每次10-30体积份，合并醋酸乙酯液，减压回收醋酸乙酯至干，残渣加甲醇1-3体积份使溶解，作为供试品溶液；

另取丹参对照药材0.5重量份，加甲醇10-30体积份，超声处理20-40分钟，滤过，滤液浓缩至1-3体积份，作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各0.003-0.008体积份，分别点于同一用0.5-1.5％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水＝10-20∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶1-3为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点；

C.取本发明药物组合物日用制剂量的1/6，加乙醇10-30体积份，密塞，振摇5-15分钟，滤过，滤液浓缩至0.5-1.5体积份，作为供试品溶液；

另取丹皮酚对照品，加丙酮制成每1体积份含0.003-0.008重量份的溶液，作为对照品溶液；

照薄层色谱法(附录VI B试验)，吸取上述两种溶液各0.008-0.012体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯＝2-4∶0.5-1.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性3-8％三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝褐色斑点；

D.取本发明药物组合物日用制剂量的1/12，加水20-30体积份使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2-4次，每次用10-20体积份，合并正丁醇提取液，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇0.5-1.5体积份使溶解，作为供试品溶液；

另取白芷对照药材0.5重量份，加甲醇5-15体积份，超声处理20-40分钟，滤过，滤液浓缩至1-3体积份，作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.003-0.008体积份，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以30-60℃石油醚-醋酸乙酯＝0.5-1.5∶0.5-1.5为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

E.取本发明药物组合物日用制剂量的1/6，加水20-40体积份使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2-4次，每次10-30体积份，合并正丁醇液，用水10-30体积份洗涤1-3次，弃去水层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇0.5-1.5体积份使溶解，作为供试品溶液；

另取甘草对照药材0.5重量份，加甲醇3-5体积份，超声处理20-40分钟，取上清液作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.003-0.008体积份，分别点于同一用0.5-1.5％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水＝10-20∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶1-3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5-15％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

含量测定：照高效液相色谱法(附录VI D)测定

A.丹参素：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.5％冰醋酸＝10-30∶60-100为流动相；检测波长为280nm；理论板数按丹参素峰计算应不低于2000；

对照品溶液制备：取丹参素钠对照品，精密称定，加甲醇制成每1体积份含0.00004-0.00008重量份的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本发明药物组合物日用制剂量的1/12，置100体积份三角瓶中，精密加甲醇40-60体积份，超声处理20-40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5-15体积份，置50体积份圆底烧瓶中，回收溶剂至干，残渣加流动相溶解并转入5-15体积份量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液0.003-0.008体积份和0.005-0.015体积份、供试品溶液0.005-0.015体积份，注入液相色谱仪，测定，即得；

本发明药物组合物每日用制剂量中含丹参以丹参素(C₉H₁₀O₅)计，不得少于19.2mg；

B.丹皮酚：

色谱色条与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-冰醋酸＝40-80∶30-50∶0.5-1.5为流动相；检测波长为27nm；理论板数按丹皮酚峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品，精密称定，加甲醇制成每1体积份含0.000003-0.000008重量份的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本发明药物组合物日用制剂量的1/24，置100体积份三角瓶中，精密加甲醇40-60体积份，超生处理20-40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重，摇匀，滤过，精密量取续滤液0.5-1.5体积份，置10体积份量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.005-0.015体积份，注入色谱仪，测定，即得；

本发明药物组合物每日用制剂量中含牡丹皮以丹皮酚(C₉H₁₀O₃)计，不得少于31.2mg。

本发明药物组合的的质量检测方法优选包括如下鉴别和含量测定方法中的一种或几种：

鉴别：

A.取本发明药物组合物日用制剂量的1/12，加水25体积份使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次用15体积份，合并正丁醇提取液，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1体积份使溶解，作为供试品溶液；

另取柴胡对照药材1重量份，加甲醇20体积份，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20体积份，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20体积份使溶解，加热回流1小时，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次用15体积份，合并正丁醇提取液，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1体积份使溶解，制备对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.005体积份，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水＝13∶7∶2在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％对二甲氨基苯甲醛硫酸乙醇溶液，取0.5-1.5％对二甲氨基苯甲醛硫酸溶液1mL，用乙醇稀释至10mL，取该溶液喷硅胶G薄层板，在70℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；置紫外灯365nm下检视，显相同黄色的荧光斑点；

B.取本发明药物组合物日用制剂量的1/12，加水30体积份使溶解，滤过，滤液用稀盐酸调PH值至1-2，置分液漏斗中，用醋酸乙酯振摇提取3次，每次20体积份，合并醋酸乙酯液，减压回收醋酸乙酯至干，残渣加甲醇2体积份使溶解，作为供试品溶液；

另取丹参对照药材0.5重量份，加甲醇20体积份，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至2体积份，作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.005体积份，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水＝15∶1∶1∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点；

C.取本发明药物组合物日用制剂量的1/6，加乙醇20体积份，密塞，振摇10分钟，滤过，滤液浓缩至1体积份，作为供试品溶液；

另取丹皮酚对照品，加丙酮制成每1体积份含0.005重量份的溶液，作为对照品溶液；

照薄层色谱法(附录VI B试验)，吸取上述两种溶液各0.010体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯＝3∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝褐色斑点；

D.取本发明药物组合物日用制剂量的1/12，加水25体积份使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次用15体积份，合并正丁醇提取液，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1体积份使溶解，作为供试品溶液；

另取白芷对照药材0.5重量份，加甲醇10体积份，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至2体积份，作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.005体积份，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以30-60℃石油醚-醋酸乙酯＝1∶1.1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

E.取本发明药物组合物日用制剂量的1/6，加水30体积份使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20体积份，合并正丁醇液，用水20体积份洗涤2次，弃去水层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1体积份使溶解，作为供试品溶液；

另取甘草对照药材0.5重量份，加甲醇4体积份，超声处理30分钟，取上清液作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.005体积份，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水＝15∶1∶1∶2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

含量测定：照高效液相色谱法(附录VI D)测定

A.丹参素：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.5％冰醋酸＝20∶80为流动相；检测波长为280nm；理论板数按丹参素峰计算应不低于2000；

对照品溶液制备：取丹参素钠对照品，精密称定，加甲醇制成每1体积份含0.00006重量份的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本发明药物组合物日用制剂量的1/12，置100体积份三角瓶中，精密加甲醇50体积份，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10体积份，置50体积份圆底烧瓶中，回收溶剂至干，残渣加流动相溶解并转入10体积份量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液0.005体积份和0.010体积份、供试品溶液0.010体积份，注入液相色谱仪，测定，即得；

本发明药物组合物每日用制剂量中含丹参以丹参素(C₉H₁₀O₅)计，不得少于19.2mg；

B.丹皮酚：

色谱色条与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-冰醋酸＝60∶40∶1为流动相；检测波长为27nm；理论板数按丹皮酚峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品，精密称定，加甲醇制成每1体积份含0.000005重量份的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本发明药物组合物日用制剂量的1/24，置100体积份三角瓶中，精密加甲醇50体积份，超生处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重，摇匀，滤过，精密量取续滤液1体积份，置10体积份量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.010体积份，注入色谱仪，测定，即得；

本发明药物组合物每日用制剂量中含牡丹皮以丹皮酚(C₉H₁₀O₃)计，不得少于31.2mg。

本发明所述的重量份与体积份的比例为克/毫升。

本发明药物组合物的质量检测方法可以应用于组合物的各种剂型，如片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、滴丸、软胶囊剂、缓释剂、口服液体制剂或冻干粉针剂等临床可接受的剂型，由于不同剂型的制剂每日用制剂量中所含的相当生药量是相同的，因此各个剂型在进行含量测定时，所选用样品量可统一折算为每日用制剂量，本含量测定方法所述的每日用制剂量是指每日使用的总片数、总粒数或总丸数等。

附图说明

图1：本发明药物组合物体外抑制B-16增殖的影响；

图2：本发明药物组合物对酪氨酸酶活性影响；A、本发明药物组合物；B、排毒养颜胶囊

图3：本发明药物组合物对黑色素生成的影响；A、本发明药物组合物；B、排毒养颜胶囊

图4：激素紊乱致小鼠黄褐斑模型皮肤黑色素免疫组织化学染色，SP法，A：正常对照组，偶见的皮肤表面和附件上皮细胞胞浆中呈现棕色反应

B：模型对照组，易见散在的皮肤表面和附件上皮细胞胞浆中呈现棕色反应

C：本发明药物组合物组，少见的皮肤表面和附件上皮细胞胞浆中呈现棕色反应；

图5：丹参素含量测定-标准曲线的HPLC色谱图；

图6：丹参素含量测定-对照品、供试品和阴性对照品的HPLC色谱图；

图7：丹参素含量测定-样品稳定性考察的HPLC色谱图；

图8：丹参素含量测定-方法精密度考察的HPLC色谱图；

图9：丹参素含量测定-方法重现性考察的HPLC色谱图；

图10：丹参素含量测定-样品测定的HPLC色谱图；

图11：丹皮酚含量测定-标准曲线的HPLC色谱图；

图12：丹皮酚含量测定-对照品、供试品和阴性对照品的HPLC色谱图；

图13：丹皮酚含量测定-样品稳定性考察的HPLC色谱图；

图14：丹皮酚含量测定-方法精密度考察的HPLC色谱图；

图15：丹皮酚含量测定-方法重现性考察的HPLC色谱图；

图16：丹皮酚含量测定-样品测定的HPLC色谱图。

本发明药物组合物属调肝补肾，化瘀祛斑方药，主治肝郁肾虚，气血淤滞所致妇女黄褐斑，具有养荣祛斑的作用。症见面部暗斑，常可伴有头晕神疲，胸闷多烦，腰膝酸软，月经不调等，脉多沉弦，舌黯或有瘀斑。药效实验表明，本发明药物组合物可以显著降低雌孕激素所致小鼠皮肤免疫组织化学染色黑色素阳性目标的平均面积、目标与统计面积之比(面密度)，对小鼠皮肤黑色素的形成具有抑制作用；可以显著减轻紫外线致小鼠皮肤的红斑、水肿、明显减轻紫外线照射小鼠皮肤表面的变性、坏死，以及炎细胞浸润、充血、水肿；对粉刺丙酸杆菌、藤黄微球菌均有明显抑制和杀灭作用；对紫外线照射致皮肤损伤模型小鼠以及四氧嘧啶致小鼠高过氧化脂质动物模型的血清和肝脏过氧化脂质形成均有一定抑制作用；本发明药物组合物还可以抑制和杀灭粉刺丙酸杆菌、藤黄微球菌，对肾上腺素和冰水致大鼠血瘀模型血液流变性有一定改善作用。从本发明药物组合物的急性毒性所试剂量以及绝对值药后毒性表现判断，本发明药物组合物属无明显毒性药物。

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1提取工艺技术条件的研究

1、丹皮酚提取条件的研究

(1)蒸馏液体积对丹皮酚提取率的影响

收集蒸馏液的体积对丹皮酚提取率(转移率)影响很大，应予筛选。取牡丹皮(丹皮酚含量为2.34％)50g，加水1000ml，加热蒸馏，收集蒸馏液，每份50ml，置100ml量瓶中，加95％乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取适量，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。照分光光度法(附录VA)，在274nm的波长处侧定吸收度，按丹皮酚的吸收系数(E_1cm^1％)为862计算，详见中国药典2000版一部137页牡丹皮项下的含量测定方法，即得每份蒸馏液中丹皮酚的浓度和总量，结果见表1。

表1蒸馏液体积对丹皮酚提取效率的影响

*提取率＝(累计总量÷药材中丹皮酚的总量)×100％

药材中丹皮酚的总量＝50g×2.34％＝1.17g

结论：收集蒸馏液的体积以牡丹皮10倍量为宜，该步操作的提取率约为88.8％。

(2)氯化钠加入量对重蒸馏液中丹皮酚提取率的影响

牡丹皮蒸馏液冷藏，析出丹皮酚结晶，滤过，得丹皮酚。滤液(母液)中仍含有一定量的丹皮酚，应需再次重蒸馏。加入适量的氯化钠(相当于药材量的5％)可提高丹皮酚的提取率，故对氯化钠加入量进行筛选，研究如下：

取丹皮150g，加水2250ml，加热蒸馏，收集蒸馏液1500ml，置冰箱冷藏(约5℃)，过夜，滤过，低温干燥，得丹皮酚2.35g。滤液分成三等份，每份500ml(丹皮酚含量为0.445mg/ml)，分别加入氯化钠(相当于药材)0(0％)、2.5g(5％)、5.0g(10％)，重蒸馏，收集蒸馏液，每份50ml。分别取20ml置冰箱冷藏，过夜，观察有无丹皮酚结晶析出；另取25ml蒸馏液，置50ml量瓶中，加95％乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取适量，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。照分光光度法(附录VA)，在274nm的波长处测定吸收度，按丹皮酚的吸收系数(E_1cm^1％)为862计算，即得每份重蒸馏液中丹皮酚的浓度和总量，结果见表2。

表2氯化钠对重蒸馏液中丹皮酚提取效率的影响

#冷藏析晶：+++示结晶多，++较多，+少，-无

*提取率＝(累计总量÷滤液中丹皮酚的总量)×100％

滤液中丹皮酚的总量＝500ml×0.445mg/ml＝222.5mg

(3)结论

由表2可见：(a)重蒸馏时需加入相当于牡丹皮重量5％的氯化钠，丹皮酚蒸出的速度最快，即重蒸馏液中丹皮酚的浓度最高，故氯化钠用量以牡丹皮重量的5％为最佳。(b)取每份重蒸馏液20ml，置冰箱冷藏，过夜，结果显示1-3份(累计150ml)有丹皮酚结晶析出，4-7份无丹皮酚结晶析出，故收集重蒸馏液150ml，即牡丹皮3倍量为宜。该步操怍的提取率为66.2％。

根据上述研究结果，确定丹皮酚提取工艺条件为：牡丹皮用15倍量的水蒸馏，收集牡丹皮10倍量的蒸馏液，于0～10℃下冷藏8小时，滤过，得丹皮酚结晶I，滤液加入牡丹皮重量5％的氯化钠，重蒸馏，收集牡丹皮3倍量的蒸馏液，于0～10℃下冷藏8小时，滤过，得丹皮酚结晶II，合并丹皮酚结晶I和II，于40℃低温干燥，即得丹皮酚。

2、水煎煮条件的研究

(1)吸水率试验

按处方比利称取柴胡、丹参、熟地黄、白芷、甘草加水十倍，浸泡过夜，使药材全部浸透，滤除未被吸收的水液，求得吸水率约为210％。

(2)煎煮条件筛选

加水量、煎煮时间、煎煮次数为影响提取的主要因素，故需对其进行筛选。采用四因素三水平进行正交试验研究，筛选最佳工艺条件。

以丹参素的提取率为评价指标，采用正交试验对加水量(A)、煎煮时间(B)、煎煮次数(C)进行筛选研究。分别称取柴胡20g、丹参30g、熟地黄30g、白芷20g、牡丹皮20g、甘草6g，共9份，按L₉，(3)正交试验表3和表4的设计方案，加水煎煮，滤过，合并滤液，混匀，测量体积，取药液适量，按供试品溶液的制备方法处理，得1-9号供试品溶液。测定样品中丹参素的浓度，计算出水煎液中丹参素的总量。

a.材料与仪器

Waters液相色谱系统：包括Waters 1525泵；Waters 2487双波长紫外检测器；Waters柱温箱；Breeze液相色谱工作站。

丹参素钠：含量测定用对照品，购自中国药品生物制品检定所，批号：855-200102；甲醇为色谱纯，水为重蒸水经0.45μm滤膜过滤。其余试剂均为分析纯。

b.方法与结果

色谱条件流动相：甲醇-0.5％冰醋酸(20∶80)；色谱柱：LunaC₁₈(2)4.6×150mm，5μm；检测波长：280nm；流速：0.6ml/min；柱温：30℃。

对照品溶液的制备精密称取丹参素钠对照品适量，用流动相配制成每1ml含0.0772mg(折合丹参素0.06755mg/ml)的溶液，即得。

供试品溶液的制备精密吸取水煎液20ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣用甲醇转移至25ml量瓶中，滤过，取续滤液10ml蒸干，残渣用流动相溶解并转移至10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，测定峰面积，计算，即得。

结果：见表3、表4和表5，以水煎液中丹参素的总量(mg)为评价指标。由表4中的极差R值大小显示，各因素作用主次为B＞C＞A，以A₃B₃C₃为佳。由方差分析结果可知，A因素无显著性差异，B和C因素有极显著性差异，以A₁B₃C₃为佳，考虑到生产实际情况，从节约水源和能耗，缩短生产周期，降低生产成本的角度出发，确定实际生产工艺为A₁B₂C₃

(3)验证试验

称取同一批药材分别按A₁B₃C₃与A₁B₂C₃进行试验，重复3次，结果见表6。由表6可见第二方案A₁B₂C₃丹参素提取总量仅减少约5％，但煎煮次数减少1次，从生产实际出发，此应为最佳方案。即煎煮2次，第1次加水10倍，第2次加水8倍，每次2小时。

表3水煎煮正交试验表头设计

表4正交试验设计表及结果

表5正交试验方差分析表

F_0.01(2，4)＝18.0

表6验证试验结果

实验例2-7均采用如下的受试药物、阳性药物、动物、试剂和仪器

1、受试药物与阳性药物

本发明药物组合物：实施例1制备得到的胶囊剂内容物，棕黄色药粉，无特殊气味，1g药粉相当于原生药4.26g。由四川省中药研究所易进海研究员提供，批号030604。

六味地黄丸：国药准字Z41022128。规格：每丸相当于原药材3g，每瓶200丸。河南省宛西制药股份有限公司生产。批号030605。

维生素C片：国药准字H50020036。规格：0.1g×100片，西南药业股份有限公司出品，批号030207。

己烯雌酚片：津卫药准字(1981)第001135号。规格：0.5mg×100片，天津力生制药股份有限公司生产，批号0208015。

醋酸甲羟孕酮片：浙卫药准字(1996)第121701号。规格：2mg×100片，浙江仙琚制药股份有限公司，批号：021217。

排毒养颜胶囊：国药准字Z53020685。规格：0.4g/粒，每板10粒，6板/盒。云南盘龙云海药业有限公司生产，批号030546。

四氧嘧啶：ALLDXAN5.6DIOXYURACTI。规格：25g/瓶。SIGMA公司提供，lot：12K1460。

丹参滴丸：(95)卫药准字Z-01号。规格：25mg×100粒.天津天士力制药股份有限公司生产，批号20020807。

盐酸肾上腺素注射液：国药准字H50020015。规格：1ml∶1mg，1mg/支×10支/盒。西南药业股份有限公司生产，批号030401。

2、动物及细胞株

小鼠B-16黑素瘤细胞株，由华神集团提供；

Km(昆明种)小鼠，一级合格，川实动质第2002-33号，由四川省中药研究所实验动物中心提供；

SD大鼠，一级合格，川实动质第2002-32号，由四川省中药研究所实验动物中心提供。

粉刺丙酸杆菌CMCC65102、藤黄微球菌CMCC28001来自四川省防疫站保存质控菌株。

3、仪器与试剂

酶标仪(Bio-Rad，Model3550)；离心机(北京医用离心机厂)，LDZ5-2)；倒置显微镜(Nikon DEAPHOT Fx-35DX)；二氧化碳细胞培养箱(BNA-311，ESPEC)；日本岛津UV-730自动生化测定仪；日本岛津EB-3200D精密电子天平(精密度0.01g)；上海精天电子仪器有限公司JA1003A型电子天平(精度1mg)；上海手术器械厂80-2离心沉淀器；芬兰雷勃Finnpipette连续可调定量移液器10-100、20-200、100-1000μl和1-5ml可调移液器；石英紫外线杀菌灯，扬州通达卫生器械有限公司；DY89-1型电动匀浆机，宁波新高科仪器研究所；北京世帝科学仪器公司R80血液流变仪；四川省中药研究所四川大学XYTX-2000药品非临床安全性评价全自动病理图象定量分析系统。

SOD试剂：南京建成生物工程研究所提供，批号20031225。

MDA试剂：南京建成生物工程研究所提供，批号20031226。

硫化钠：500g/瓶，化学纯，成者化学试剂厂，批号980923。

生理盐水：0.9％氯化钠注射液，500ml：4.5g。国药准字H51021158，四川科伦大药厂有限责任公司，批号20030921-18。

甲醛溶液：200ml/瓶，分析纯，成都市金山化工试剂厂，批号030820。

四氧嘧啶：ALLDXAN 5.6-DIOXYURACTI.规格：1ml∶1mg，1ml/支×10支/盒。西南药业股份有限公司生产，批号030401。

肝素钠粉：1g/瓶，效价≥150μ/mg，水份＜4％。上海伯奥生物科技有限公司，批号03070。

RPMI-1640(GIBCO公司)

胎牛血清(HyClone公司)

小牛血清(HyClone公司)；

L多巴(美国Slpa公司产品，批号D9628)；

胰蛋白酶(上海华美生物公司产品，批号取2186)；

MTT，SDS，ConA，琼脂均为Sigma公司。

另有谷氨酰胺，青霉素，庆大霉素，Tris Base及其它国产分析纯试剂。

实验例2本发明药物组合物对B16黑色素细胞株细胞增殖、酷氨酸梅活性及黑色素合成的影响

1、培养液配制

(1)RPMI-1640培养液(1000ml)：将RPMI-1640干粉溶于300ml三蒸水中，用水洗包装袋2次，倒入合并、搅拌，加三蒸水至近1000ml处：加NaHCO₃2g，补充谷氨酰胺至终浓度为3mmol/L，加入酚红(终浓度为5.3mg/L)；加入抗生素a青霉素(100U/ml)b庆大霉素(50U/ml)；定容至1000ml；以NaOH或HCL调节PH至7.2。过滤除菌，4℃保存。吸取配制好的RPMI-1640培养液2ml入25ml的玻璃细胞培养瓶中，在37℃、5％CO₂和完全湿度条件下培养过夜，倒置显微镜下观察有否染菌。未染菌的培养液方可进行实验。

(2)10％小牛血清的RMPI-1640培养液(100ml)：取配好的RPMI-1640培养液90ml，加入10ml小牛血清，以NaOH或HCI调节PH至7.2。过滤除菌，4℃保存。吸取配制好的含10％小牛血清的RPMI-1640培养液2ml入25ml的玻璃细胞培养瓶中，在37℃、5％CO₂和完全湿度条件下培养过夜，倒置显微镜下观察有否染菌。未染菌的培养液方可进行实验。

(3)10％胎牛血清的RMPI-1640培养液(100ml)：取配好的RPMI-1640培养液80ml，加入10ml胎牛血清和10mlHeper’s(终浓渡为5mM)；加入2-巯基乙醇(2-Me)至终浓度为50μmol/L以NaOH或HCI调节PH至7.2。过滤除菌，4℃保存。吸取配制好的含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液2ml入25ml的玻璃细胞培养瓶中，在37℃、5％CO₂和完全湿度条件下培养过夜，倒置显微镜下观察是否染菌。未染菌的培养液方可进行实验。

2、消化液配制

(1)母液配制：用无钙镁Hanks液配制0.25％的胰蛋白酶溶液。过滤除菌，4℃保存。用PBS配制1％的EDTA，10磅高压灭菌15分钟，4℃保存。

(2)应用液配制：取0.4ml 1％的EDTA，4ml 0.25胰蛋白酶，加入无菌PBS到2ml，4℃保存。

3、无机盐缓冲液配制

(1)PBS溶液(1000ml)：8gNaCI(137mmol/L)，0.2gKCI(2.7mmol/L)，1.15gNa₂HPO₄·7H₂O(4.3mmol/L)，0.2gKH₂PO₄(1.4mmol/L)溶于1L双蒸水中，调节PH到7.2。高压灭菌，4℃保存备用。

(2)0.83％Tris-NH₄Cl溶液(500ml)：3.0275gTris(0.05mol/L)溶于250ml双蒸水中。两种溶液混合，加双蒸水中；4.15gnNH₄Cl(0.83％)溶于250ml双蒸水中。两种溶液混合，加双蒸水中定容至500ml。高压灭菌，4℃保存备用。

4、对B16细胞增殖抑制作用的观察：

取对数生长期的B16细胞，0.25％胰蛋白酶消化，RMPI-1640培养液收集消化后细胞，4000r/m离心3-5min。弃去上层清液。以10％小牛血清的RMPI-1640培养液吹散细胞，将其稀释为5×104个/ml。取0.1ml细胞悬液加入96孔细胞培养板，放在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养。

将本发明药物组合物用生理盐水配置成200mg/ml的母液，121℃灭菌20min。将200mg/ml的本发明药物组合物母液以终浓度：0、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000μg/ml(共23个梯度)加入贴壁生长4h的细胞培养体系中，每孔终体积为200μg，每个浓度设4个复孔，取平均值。在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养72小时。于细胞培养结束前5小时每孔弃去培养上清100μl，加入浓渡为5mg/ml的MTT10μl(用生理盐水配制，过滤除菌)。培养结束后，每孔加10％SDS(用0.01M的HCI配置)100μl振荡混匀，37℃下4小时，用酶标仪在570nm处读取0D值。作出B16细胞受本发明药物组合物抑制与本发明药物组合物浓度之间的曲线，判断本发明药物组合物的有效抑制浓渡。

5、本发明药物组合物对酪氨酸酶活性的影响

取对数生长期的B16细胞，0.25％胰蛋白酶消化，RMPI-1640培养液收集消化后细胞，4000r/m离心3-5min。弃去上层清液。以10％小牛血清的RMPI-1640培养液吹散细胞，将其稀释为8×104个/ml。取0.1ml细胞悬液加入96孔细胞培养板。放在37℃、5％CO₂饱和水汽二氧化碳培养箱中培养。

将200ml/ml的本发明药物组合物和排毒养颜胶囊母液分别以终浓度：0、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450μg/ml(共12个梯度)加入贴壁生长4h的细胞培养体系中，每孔终体积为200μg，每个浓度设4个复孔。在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养48小时。弃去上层清液，用PH7.4的PBS洗涤细胞2次，每孔加入50μl、1％TritonX-100。将96孔细胞培养板迅速放入-30℃冰箱，30min后取出，室温下自然解冻从而破坏细胞。37℃预温后加入1％L-多巴溶液(10μl/孔)，37℃反应2h，测定490nm吸收度值，以培养其液为阴性对照孔。

6、本发明药物组合物对黑色素生成的影响

取对数生长期的B16细胞，0.25％胰蛋白酶消化，RMPI-1640培养液收集消化后细胞，4000r/m离心3-5min。弃去上层清液。以10％小牛血清的RMPI-1640培养液吹散细胞，将其稀释为1×105个/ml。取1ml细胞悬液加入24孔细胞培养板。在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养。

将200mg/ml的本发明药物组合物和排毒养颜胶囊母液分别用RMPI-1640培养液稀释成2000μg/ml、200μg/ml工作液，以终浓度0-300μg/ml(共5个梯度，分别为：0、50、100、200、300μg/ml)加入贴壁生长4小时的细胞培养体系中，每孔终体积为200μg，每个浓度设4个复孔，在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养96小时。0.25％胰蛋白酶消化细胞，每孔取1×105个细胞离心弃去上层清液，加入1ml 1mol/L的NaOH，震荡5分钟。置酶标仪测A值，波长为490nm。

7、试验结果

(1)对B16细胞培殖抑制作用的观察

由图1和表7可见，用MTT法测定本发明药物组合物对B-16黑色素瘤细胞增殖的影响，与空白对照相比有明显的抑制作用。在极低浓渡时，本发明药物组合物可刺激B16细胞的增殖；但当其浓度大于50μg/ml时，随浓度增高，则呈现出抑制作用，最佳抑制浓度为400μg/ml-500μg/ml之间；当本发明药物组合物浓渡大于500μg/ml时，对B-16黑色素瘤细胞增殖的抑制作用不会再随着浓度增大而增加，其抑制效果达到最大。

表7本发明药物组合物体外抑制B-16增殖的影响(n-4，x±S)

(2)本发明药物组合物对酪氨酸酶活性的影响

由表8和附图2-附图3所示，小鼠B-16黑色素瘤细胞在经本发明药物组合物作用48小时后，低浓度本发明药物组合物(＜100μg/ml)对酪氨酸酶活性有一定促进作用，但随浓度增高，则对酪氨酸酶活性有明显的抑制作用。本发明药物组合物浓度在150-450μg/ml的范围内，能有效抑制B-16黑色素瘤细胞株的酪氨酸酶活性，且这种作用强于同浓度排毒养颜胶囊的效果。

表8本发明药物组合物对酪氨酸酶活性影响(n-4，x±s)

(3)本发明药物组合物对黑色素生成的影响

由表9和附图3可见，本发明药物组合物对小鼠B-16黑色素瘤细胞作用4d后，测定黑色素含量，在50μg/ml以下，随药物浓度增加，黑色素含量不断增加；大于50μg/ml浓度时，随浓渡增高，本发明药物组合物可明显抑制黑色素的生成，当本发明药物组合物浓度为100μg/ml时，其对黑色素生成的抑制达到最大；在100-300μg/ml之间，对黑色素的抑制趋于平稳说明在较高浓度时，本发明药物组合物对黑色素合成有明显抑制作用

表9本发明药物组合物对黑色素生成的影响(n-4，x±s)

实验例3本发明药物组合物对激素紊乱至小鼠皮肤黄褐斑形成的影响

1、造型方法：

每日给小鼠腹腔注射(ip)乙烯雌酚片和醋酸甲羟孕酮片混合溶液0.1ml/10g(乙烯雌酚浓度4mg/dl，醋酸甲羟孕酮浓度20mg/dl)，即：乙烯雌酚0.4mg/kg+醋酸甲羟孕酮2mg/kg)。每日1次，连续30天。

分组与给药：昆明种雌性小鼠78只，体重25-30g，按体重随机分成7组，每组11-12只。设正常对照(阴性对照)、模型对照、受试药物3个剂量组和阳性药物对照组2个(六味地黄丸和维生素C)。除正常对照组外(ip相应体积的蒸馏水)，其余动物均每日给小鼠腹腔注射(ip)己烯雌酚片和醋酸甲羟孕酮片混合溶液造型。在造型的第1日开始，受试药物3个剂量组(2.5、5、10g原生药/kg，药液浓度分别为25、50、100g原生药/dl，分别相当于临床每日推荐剂量的6、12、24倍)、阳性对照组2个(六味地黄丸3g/kg，药液浓度30g/dl)和维生素C(0.9g/kg，药液浓度为9g/dl)，开始灌胃给药灌胃容积为0.1ml/10g。正常对照组和模型对照组灌服相应体积的蒸馏水。每天灌胃1次，连续给药30天。

观察指标：末次给药后1hr颈椎脱臼处死小鼠，各组随机选取5只小鼠剥取背部皮肤于一块，10％福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋切片，免疫组织化学技术SP法(过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒)标记皮肤黑色素。每张病理切片观察5个不同的视野，找到阳性目标(皮肤表面和附件上皮细胞胞浆中呈现标色反应)后，用四川省中药研究所四川大学联合研制的XYTX-2000药品非临床安全性评价全自动病理图象定量分析系统对目标图像进行定量分析，得出每张切片5个视野及每组5只动物黑色素阳性目标的平均面积、目标与统计面积之比(面密度)。用t检验方法对各组之间的数值进行统计学处理，检验水准α-0.05。

2、结果

由表10可见，本发明药物组合物组动物血清MDA产生减少，表明对黄褐斑模型小鼠血清过氧化脂质形成有一定抑制作用。由表11和附图4可见，本发明药物组合物所试剂量范围内对雌孕激素所致小鼠黄褐斑实验中，皮肤免疫组织化学染色黑色素阳性目标的平均面积、目标与统计面积之比(面密度)均低于模型组，统计差异非常显著(p＜0.05-0.01)，提示本发明药物组合物对小鼠黄褐斑实验动物皮肤黑色素的形成具有抑制作用。

表10本发明药物组合物对小鼠黄褐斑实验动物血清SOD、MDA的影响(x±s)

与模型对照组比较(t检验或t’检验)*P＞0.05；**P＜0.05；***P＜0.01

表11本发明药物组合物对小鼠黄褐斑实验动物皮肤黑色素形成的影响(x±s)

与模型对照组比较(t检验或t’检验)*P＞0.05；**P＜0.05；***P＜0.01

实验例4本发明药物组合物对紫外线照射致小鼠皮肤损伤的影响

1、方法

昆明种雌性小鼠80只，体重18-22g，按体重随机分成7组，每组11-12只。设正常对照(阴性对照)、模型对照组，受试药物3个剂量组(2.5、5、10g原生药/kg，浓度分别为25、50、100g原生药/dl，分别相当于临床每日推荐剂量的6、12、24倍)。2个阳性对照组(排毒养颜胶囊0.8g/kg，维生素C 0.9g/kg)。药物组每日灌胃给药1次，连续5天。灌胃容积为0.1mg/10g。正常对照组和模型对照组灌服相应体积的蒸馏水。

灌胃给药第2天用8％的Na₂S给小鼠背部脱毛，给药第3天灌胃给药40分钟后，将小鼠置紫外灯下(30W，与动物背部距离25cm)照射2小时。分别于照射后2hr、24hr、48hr将动物取出肉眼观察照射部位红斑、水肿情况(肉眼观察评分标准见表12)。实验第5天末次给药后1hr眼球摘除取血分离血清检测SOD、MDA。颈椎脱臼处死小鼠，取照射部位皮肤于10％甲醛溶溶液中，HE染色，做组织病理切片观察(组织病理学评分标准见表13)。结果红斑、水肿情况以及病理组织学评分等半定量资料用秩和检验，SOD、MDA用t检验比较各组间有无显著性差异，检验水准α＝0.05。

表12皮肤紫外线损伤肉眼评分表

表13皮肤紫外线损伤组织病理学评分表

2、试验结果

由表14可见，与模型对照组比较，本发明药物组合物组SOD活性有所升高，MDA有一定程度产生减少，但统计差异不显著(p＞0.05)，表明本发明药物组合物对紫外线照射致皮肤损伤模型小鼠血清过氧化脂质形成有一定抑制作用趋势。

由表15可见，肉眼观察，本发明药物组合物可以减轻紫外线致小鼠皮肤的红斑、水肿，皮肤紫外线损伤肉眼评分值显著低于模型对照组(p＜0.05)。

由表16可见，紫外照射线可致小鼠皮肤组织病理发生明显改变，主要表现为皮肤表面上皮的变性、坏死，炎细胞浸润，可伴明显充血水肿。本发明药物组合物对上述病变均有明显改善作用，小鼠皮肤损伤组织病理学评分值显著低于对照组(p＜0.05-0.01)。

表14本发明药物组合物对紫外线致小鼠皮肤损伤血清SOD、MDA的影响(x±s)

与模型对照组比较(t检验或t’检验)*P＞0.05；**P＜0.05；***P＜0.01

表15本发明药物组合物对紫外线致小鼠皮肤损伤肉眼评分值(x±s)

与模型对照组比较(t检验或t’检验)*P＞0.05；**P＜0.05；***P＜0.01

表16本发明药物组合物对紫外线致小鼠皮肤损伤组织病理学评分值(x±s)

与模型对照组比较(t检验或t’检验)*P＞0.05；水*P＜0.05；***P＜0.01

实验例5本发明药物组合物对痤疮丙酸杆菌、微球菌的抑制作用实验

1、药物配制

本发明药物组合物：用电子天平以加重法精确称取原药粉2.00g，加无菌蒸馏水29.3ml溶解，浓度为64mg/ml，100℃煮沸5分钟杀死杂菌。实验时取0.5ml用无菌肉汤(粉刺丙酸杆菌用厌氧肉汤)作对倍稀释，使浓度系列为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25mg/ml。

青霉素G：哈尔滨制药总厂生产，批号B0202004，每瓶80万单位，加8.0ml蒸馏水溶解，浓度为10万单位/ml，取0.3ml加27ml蒸馏水稀释，浓度为1万单位/ml，取0.3ml加2.7ml蒸馏水稀释，浓度为1000单位/ml，取0.3ml加2.7ml蒸馏水稀释，浓度为100单位/ml，取1.0ml加6.8ml肉汤稀释，浓度为12.8单位/ml，然后取0.5ml用无菌肉汤作对倍稀释，浓度系列为6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025单位/ml。作为粉刺丙酸杆菌和藤黄微球菌抗菌活性测定时的阳性药对照。

多粘菌素B：Amresco公司产品，华美生物工程公司分装，活性＞6000u/mg(以6000u/mg计)，精确称取多粘菌素B50mg，加5.0ml蒸馏水溶解，浓度为60000u/ml，取0.3ml加2.7ml蒸馏水稀释，浓度为6000u/ml，取0.3ml加2.7ml蒸馏水稀释，浓度为600u/ml，取0.3ml加2.5ml肉汤稀释，浓度为64u/ml，然后取0.5ml用无菌肉汤对倍稀释，浓度系列为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125u/ml

2、试验菌液的制备

试验菌按营养需求接种干普通琼脂平板或厌氧平板，37℃培养18～24小时(粉刺丙酸菌培养48小时)，刮取少量菌苔乳化于肉汤(粉刺丙酸杆菌用厌氧肉汤)，比浊校正其浓度，再做10万倍稀释(粉刺丙酸杆菌做1万倍稀释)，使终浓度相当于104～105cfu/ml肉汤。

3、试验方法

MIC测定：采用试管液体二倍稀释法，试验菌液每管加量0.5ml，混匀后放37℃培养，次日观察结果(粉刺丙酸杆菌培养48小时后观察结果)。加菌后，试验药及阳性对照药均相当于再稀释1倍。与菌液肉汤对照比较，抑制细菌生长的最低浓度即为MIC。

MBC测定：采用平板活菌计数法。即先测出MIC，再依次将末见细菌生长各管培养物分别吸取0.1ml按营养需求接种于平板，37℃再培养18～24小时，平板上菌落数＜5个的最低药物浓度即为最小杀菌浓度。

对照实验：同时做菌液肉汤对照和试验药空白对照。

4、实验结果

表17本发明药物组合物对痤疮丙酸杆菌、微球菌的抑制作用

由表17可见，本发明药物组合物对粉刺丙酸杆菌、藤黄微球菌均有明显均有抑制和杀灭作用。

实验例6本发明药物组合物对肾上腺素和冰水致血瘀模型大鼠血液流变学的影响实验

1、方法

取SD雌性大鼠64只，体重240～300g，按体重随饥分成6组，每组10-11只。设正常对照(阴性对照)、模型对照组、受试药物3个剂量组(2、4、8g原生药/kg，分别相当于临床每日推荐剂量的4.8、9.6、19.2倍)、阳性药丹参滴丸对照组(剂量为0.375g/kg)。采用等容积不等浓度药液灌胃给药(对照组给蒸馏水)，本发明药物组合物三个剂量浓度均分别为浓度分别为20、40、80g(原生药)/dl，丹参滴丸浓度为3.75g/dl，容积为1ml/100g体重。每日灌胃1次，连续10天。正常对照组和模型对照组灌服等量的蒸馏水。

除正常对照组外，末次给药后1hr模型对照组和各受试药物组皮下注射肾上腺素(0.1g/dl)0.08ml/100g共2次(问隔4h)，在第一次注射肾上腺素后2hr将大鼠浸泡入冰水内5分钟。处置后禁食不禁水，20hr后股动脉取血(肝素钠抗凝)，使血液自然流入加有少量肝素钠的20ml烧杯内，轻轻振摇使之抗凝。使用LG-R-80型血液粘度仪测定全血粘度(切变率200、切变率：100、切变率20、切变率10)和血浆粘度、结果用t检验比较各组间差异显著性，检验水准a＝0.05。

2、结果：

由表18可见，本发明药物组合物全血200(1/s)切变率、血浆粘度低于模型对照组(P＜0.05～0.01)，表明本发明药物组合物对肾上腺素和冰水致人鼠血瘀模型血液流变性有一定改善作用。

表18本发明药物组合物对大鼠血液粘度值的影响(X±S)

与模型对照组比较(t检验或t′检验)：*P＞0.05；**P＜0.05；***P＜0.01

实验例7本发明药物组合物对小鼠血清及肝组织过氧化脂质形成的影响

1、方法：

取昆明种小鼠63只，雄性，体重18～22g，按体重随机分成6组，每组10-11只。设阴性对照(溶剂对照)、模型对照组、受试药物3个剂量组(2.5、5、10g原生药/kg，浓度分别为25、50、100g原生药/dl，分别相当于临床每日推荐剂量的5、10、20倍)、阳性药维生素C对照组(浓度9g/dl)，剂量为0.9g/kg)。

采用等容积灌胃给药，容积为0.1ml/10g。每日1次，连续10天，正常对照组和模型对照组给相应体积的蒸馏水。

给药第6天，小鼠禁食16小时后，给药组和模型对照组按75mg/kg剂量尾静脉注射一次注射四氧嘧啶盐水溶液，正常对照组尾静脉注射相应体积的生理盐水。末次给药1hr后小鼠眼球摘除取血，离心留取血清检测血清SOD、MDA。颈椎脱臼处死小鼠，取肝脏0.5g，4.5ml冷生理盐水匀浆，离心取上清检测肝组织SOD、MDA。用t检验比较组间SOD、MDA有无显著性差异，检验水准α＝0.05。

2、结果

由表19可见，本发明药物组合物所试剂量范围内对四氧嘧啶致小鼠过氧化脂质实验中，可以显著减少血清及肝组织过氧化脂质的形成。

表19本发明药物组合物对四氧嘧啶致小鼠过氧化脂质的影响(X±S)

与模型对照组比较(t检验或t′检验)：*P＞0.05；**P＜0.05；***P＜0.01

实验例8本发明药物组合物毒性实验

1、受试药物

本发明药物组合物：本发明实施例1所述的药物组合物胶囊内容物，棕黄色粉末，1g药粉相当于原生药4.26g。按女性成人体重60kg计算，本发明药物组合物每日推荐口服剂量相当于0.42g(原生药)/kg体重。由四川省中药研究所药化室易进海研究员提供，批号20030604。

实验时取其内容物28.17g，研磨后加蒸馏水配成60ml混悬药液，即得其最大浓度200％混悬药液(100ml混悬药液约相当于原生药200g原生药，其粘滞度以通过16号胃针为限)供试验用。

2、实验动物

昆明种雌性，小鼠20只，一级合格(合格证号：川实动质第2002-33号)，体重18-22g，由四川省中药研究所实验动物中心提供。

3、实验方法

小鼠禁食12hr，不禁水，以动物能够接受的胶囊内容物最大浓度200％混悬药液(100ml混悬药液约相当于原生药200g原生药，其粘滞度以通过16号胃针为限)和最大容积(0.4ml/10g B.W.)的剂量1日内2次(间隔6hr)灌胃动物，连续观察7天，记录动物毒性反应，7d后复测体重，以不产生死亡的最大剂量为一次口服给药的最大给药量，并推算出该剂量相当于临床每日推荐用药量的倍数。

4、试验结果

本发明药物组合物最大浓度200％混悬药液(100ml混悬药液约相当于原生药200g原生药，其粘滞度以通过16号胃针为限)和最大体积(0.4ml/10g B.W.)1日内2次灌胃小鼠(间隔6hr)。每次给药后数分钟后动物出现自发活动明显减少，个别动物可见对外界反应冷漠、眼睑下垂、稀便等表现(表20)，约3-6hr后上述症状逐渐减轻和消失。以后连续观察7天，动物的外观、行为活动、精神状态、大小便及其颜色、被毛、肤色、呼吸、鼻、眼、口腔分泌物均未见异常，试验前后小鼠体重呈正常增长状态(表21)。试验结束时肉眼解剖未见明显病理改变。故本发明药物组合物一日灌胃小鼠的最大给药量为160g(原生药)/kg，该剂量约相当于临床每日推荐量的381倍。

5、试验结论

本发明药物组合物给雌性小鼠1日内2次灌胃最大给药量160g(原生药)/kg，该剂量给相当于临床每日推荐量的381倍。

给药后3-6hr内可见动物自发活动明显减少，个别动物可见对外界反应冷漠、眼睑下垂、稀便等表现，推测与灌胃容积过大所致。以后连续观察7天，动物的外观、行为活动、精神状态、大小便及其颜色、被毛、肤色、呼吸、鼻、眼、口腔分泌物等均未见异常，试验结束时肉眼解剖未见明显病理改变。从本发明药物组合物的急性毒性所试剂量以及绝对值药后毒性表现判断，本发明药物组合物属无明显毒性药物。

表20本发明药物组合物小鼠急性毒性试验症状谱

表21本发明药物组合物小鼠急性毒性试验前后体重变化(X±S)

实验例9丹参素含量测定方法实验

1、仪器与试药：高效液相色谱仪，包括Warers1525泵，2487双通道紫外检测器，Warers柱温箱，Breeze液相色谱工作站，Brasson超声清洗仪。丹参素钠对照品，购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号855-200102。甲醇为美国Tedia色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2、色谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna C₁₈(2)，4.6mm×150mm，5μm；柱温：30℃；流动相：甲醇-0.5％冰醋酸(20∶80)；检测波长：180nm；流速：0.6ml/min。

3、样品溶液的制备

对照品溶液的制备：精密称取丹参素钠对照品9.04mg，加流动相配制成每ml含0.0904mg(折合丹参素0.0791mg)的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本发明实施例1制备的本发明药物组合物胶囊剂内容物，研细，精密称取0.5g，置10ml三角瓶中，精密加甲醇50ml，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置50ml圆底烧瓶中，回收溶剂至干，残渣加流动相溶解并转入10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得。

阴性对照品溶液的制备：按供试品溶液的制备方法，制得阴性对照品溶液(缺丹参)。

4、线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液(0.0791mg/ml)2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ul，注入液相色谱仪中，测定峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，建立工作曲线，结果见表22和附图5。

表22丹参素的标准曲线

计算回归方程：Y＝1026500.6X-26498.7

表明丹参素在0.1582-0.791μg范围内具有良好的线性关系。

5、阴性对照品干扰的考察

分别吸取对照品溶液5μl、供试品溶液和阴性对照品溶液各10μl。注入液，相色谱仪，结果见附图6。结论：供试品溶液中丹参素达到基线分离，阴性对照品溶液无干扰，基线稳定，方法可行。

6、稳定性试验

精密吸取供试品溶液10μl，每隔一定时间进样一次，共6次，测定丹参素的峰面积，RSD为0.80％，表明供试品8小时内测定结果稳定，结果见表23和附图7。

表23稳定性试验

7、精密度试验

精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定丹参素的峰面积，重复5次，结果见表24和附图8。

表24精密度实验

8、重现性试验

照含量测定项下操作，对同一批样品(批号：01)进行多次测定，计算相对标准偏差，结果见表25和附图9。

表25重现性试验

9、加样回收率试验

取已知丹参素含量的本发明药物组合物(批号：01，3.78mg/g)约0.25g，精密称定，准确加入一定量的丹参素钠对照品溶液(折合丹参素0.762mg/ml)测定含量，按下式计算回收率，结果见表26。

表26加样回收率试验

10、本发明药物组合物中丹参素的含量测定

照质量标准正文丹参素的含量测定方法操作，测定了6批本发明药物组合物中丹参素的含量，结果见表27和附图10。

表27本发明药物组合物丹参素的含量测定

根据上述6批样品12个数据的测定结果，以平均含量2.01(mg/粒)下浮20％作为本品含量的下限，即2.01×80％＝1.61(mg/粒)故暂订本品每粒含丹参以丹参素(C₉H₁₀O₅)计，不得少于1.6mg。

实验例10丹皮酚含量测定方法实验

1、仪器与试药：Waters液相色谱系统(包括1525泵，2487双波长紫外检测器Waters柱温箱，Breeze液相色谱工作站)；丹皮酚对照品购自中国药品生物制品检定所，批号0708-9704，含量测定用；甲醇为美国Tedia色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2、色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C₁₈(2)，4.6mm×150mm，5μm：柱温：35℃；流动相：甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)检测波长：274nm；流速：0.6ml/min。

3、样品溶液的制备

对照品溶液的制备：精密称取丹皮酚对照品5.93mg，加甲酵制成浓度为0.01186mg/ml的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本发明实施例1制备得到的本发明药物组合物胶囊剂内容物，研细，精密称取0.25g，置100ml三角瓶中，精密加甲醇50ml，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

阴性对照品溶液的制备：按供试品溶液的制备方法，制得阴性对照品溶液(缺牡丹皮)。

4、线性关系考察

精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10μl，注入液相色谱仪中，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，建立工作曲线，结果见表28和附图11。

表28丹皮酚的标准曲线

a＝8517255.5.b＝-3447.9r＝0.9998

计算回归方程：Y＝8517255.5X-3447.9

表明丹皮酚在0.02372-0.1186μg范围内具有良好的线性关系

5、阴性对照品干扰的考察

分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，结果见附图12。结论：供试品溶液中丹皮酚达到基线分离，阴性对照品溶液无干扰，基线稳定，方法可行。

6、稳定性试验

精密吸取供试品溶液10μl，每隔一定时间进样一次，共6次，测定丹皮酚的峰面积，RSD为1.64％，表明供试品溶液24小时内测定结果稳定，结果见表29和附图13。

表29稳定性试验

7、精密度试验

精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定丹皮酚的峰面积，重复5次，结果见表30和附图14。

表30精密度试验

8、重现性试验

照含量测定项下操作，对同一批样品(批号：01)进行多次测定，计算相对标准偏差，结果见表31和附图15。

表31重现性试验

9、加样回收率试验

取已知丹皮酚含量的本发明药物组合物(批号：01，9.31mg/g)内容物约125mg，精密称定，准确加入一定量的丹皮酚对照品溶液(1.22mg/ml)，测定含量，按下式计算回收率，结果见表32。

表32加样回收率试验

10、本发明药物组合物中丹皮酚的含量测定

照质量标准正文丹皮酚的含量测定方法操作，测定了6批本发明药物组合物中丹皮酚的含量，结果见表33和附图16。

表33本发明药物组合物丹皮酚的含量测定

按照本发明药物组合物的含量测定方法，对六批样品进行了测定，结果见表30。工艺研究显示：牡丹皮药材中丹皮酚到成品本发明药物组合物的转移率约为65％-75％；现行版药典规定牡丹皮中丹皮酚含量不得少于1.2％。根据本发明药物组合物的制剂处方，以牡丹皮中丹皮酚含量的低限及其转移率的下限计算，本品每粒胶囊含丹皮酚应为：1.2％×333.3g×65％÷1000粒＝2.6mg，故暂定本品每粒含牡丹皮以丹皮酚(C₁₉H₁₀O₃)计，不得少于2.6mg。

下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。

具体实施方式

实施例1：本发明药物组合物胶囊剂

柴胡333.3g      丹参500g        熟地500g

白芷333.3g      牡丹皮333.3g    甘草100g。

取原料药，牡丹皮用5000ml的水蒸馏，收集3333ml的蒸馏液，于0～10℃下冷藏8小时，滤过，得丹皮酚结晶I，滤液加入牡丹皮重量5％的氯化钠，重蒸馏，收集1000ml的蒸馏液，于0～10℃下冷藏8小时，滤过，得丹皮酚结晶II，合并丹皮酚结晶I和II，于40℃低温干燥，即得丹皮酚，备用，滤液A另器收集，药渣与其余柴胡、丹参、熟地、白芷和甘草五味原料药，加水煎煮二次，第一次加水10重量倍，第2次加水8重量倍，每次煎煮2小时，滤过，合并滤液得滤液B，混合滤液A和B，浓缩至60～65℃下相对密度为1.20～1.25的稠膏，干燥，粉碎，过60目筛，得浸膏粉，备用；取上述丹皮酚研细，与占浸膏粉重量0.5％的硬脂酸镁混合均匀，加入上述浸膏粉中，混匀，加入常规辅料，按照常规工艺制成胶囊剂1000粒，每粒胶囊0.5g，口服，一次4粒，一日3次。

实施例2：本发明药物组合物片剂

柴胡310g  丹参750g    熟地350g

白芷390g  牡丹皮310g  甘草130g。

取原料药，牡丹皮用4650ml的水蒸馏，收集3100ml的蒸馏液，于0～10℃下冷藏8小时，滤过，得丹皮酚结晶I，滤液加入牡丹皮重量5％的氯化钠，重蒸馏，收集930ml的蒸馏液，于0～10℃下冷藏8小时，滤过，得丹皮酚结晶II，合并丹皮酚结晶I和II，于40℃低温干燥，即得丹皮酚，备用，滤液A另器收集，药渣与其余柴胡、丹参、熟地、白芷和甘草五味原料药，加水煎煮二次，第一次加水10重量倍，第2次加水8重量倍，每次煎煮2小时，滤过，合并滤液得滤液B，混合滤液A和B，浓缩至60～65℃下相对密度为1.20～1.25的稠膏，干燥，粉碎，过60目筛，得浸膏粉，备用；取上述丹皮酚研细，与占浸膏粉重量0.5％的硬脂酸镁混合均匀，加入上述浸膏粉中，混匀，加入常规辅料，按照常规工艺制成片剂。

实施例3：本发明药物组合物颗粒剂

柴胡390g  丹参350g    熟地750g

白芷310g  牡丹皮390g  甘草70g。

取原料药，牡丹皮用5850ml的水蒸馏，收集3900ml的蒸馏液，于0～10℃下冷藏8小时，滤过，得丹皮酚结晶I，滤液加入牡丹皮重量5％的氯化钠，重蒸馏，收集1170ml的蒸馏液，于0～10℃下冷藏8小时，滤过，得丹皮酚结晶II，合并丹皮酚结晶I和II，于40℃低温干燥，即得丹皮酚，备用，滤液A另器收集，药渣与其余柴胡、丹参、熟地、白芷和甘草五味原料药，加水煎煮二次，第一次加水10重量倍，第2次加水8重量倍，每次煎煮2小时，滤过，合并滤液得滤液B，混合滤液A和B，浓缩至60～65℃下相对密度为1.20～1.25的稠膏，干燥，粉碎，过60目筛，得浸膏粉，备用；取上述丹皮酚研细，与占浸膏粉重量0.5％的硬脂酸镁混合均匀，加入上述浸膏粉中，混匀，加入常规辅料，按照常规工艺制成颗粒剂。

实施例4：本发明药物组合物散剂

柴胡333.3g  丹参500g        熟地500g

白芷333.3g  牡丹皮333.3g    甘草100g。

取原料药，加入常规辅料，按照常规工艺制成散剂。

实施例5：本发明药物组合物丸剂

柴胡310g  丹参750g    熟地350g

白芷390g  牡丹皮310g  甘草130g。

取原料药，牡丹皮用5580ml的水蒸馏，收集1860ml的蒸馏液，于2℃下冷藏10小时，滤过，得丹皮酚结晶I，滤液加入牡丹皮重量7％的氯化钠，重蒸馏，收集620ml的蒸馏液，于2℃下冷藏10小时，滤过，得丹皮酚结晶II，合并丹皮酚结晶I和II，于45℃低温干燥，即得丹皮酚，备用，滤液A另器收集，药渣与其余柴胡、丹参、熟地、白芷和甘草五味原料药，加水煎煮1次，加水6重量倍，煎煮3小时，滤过，合并滤液得滤液B，混合滤液A和B，浓缩至65℃下相对密度为1.10～1.20的稠膏，干燥，粉碎，过60目筛，得浸膏粉，备用；取上述丹皮酚研细，与占浸膏粉重量1％的硬脂酸镁混合均匀，加入上述浸膏粉中，混匀，加入常规辅料，按照常规工艺制成丸剂。

实施例6：本发明药物组合物口服液

柴胡390g  丹参350g    熟地750g

白芷310g  牡丹皮390g  甘草70g。

取原料药，牡丹皮用4680ml的水蒸馏，收集4680ml的蒸馏液，于8℃下冷藏8小时，滤过，得丹皮酚结晶I，滤液加入牡丹皮重量4％的氯化钠，重蒸馏，收集1560ml的蒸馏液，于8℃下冷藏10小时，滤过，得丹皮酚结晶II，合并丹皮酚结晶I和II，于35℃低温干燥，即得丹皮酚，备用，滤液A另器收集，药渣与其余柴胡、丹参、熟地、白芷和甘草五味原料药，加水煎煮3次，每次加水10重量倍，每次煎煮1小时，滤过，合并滤液得滤液B，混合滤液A和B，浓缩至55℃下相对密度为1.25～1.35的稠膏，干燥，粉碎，过60目筛，得浸膏粉，备用；取上述丹皮酚研细，与占浸膏粉重量1.5％的硬脂酸镁混合均匀，加入上述浸膏粉中，混匀，加入常规辅料，按照常规工艺制成临床药用剂型：颗粒剂、丸剂、散剂、胶囊剂、片剂、缓释剂、口服液体制剂或冻干粉针剂。

实施例7：本发明药物组合物缓释制剂

柴胡333.3g  丹参500g        熟地500g

白芷333.3g  牡丹皮333.3g    甘草100g。

取原料药，加入常规辅料，按照常规工艺制成缓释制剂。

实施例8：本发明药物组合物冻干粉针剂

柴胡333.3g  丹参500g        熟地500g

白芷333.3g  牡丹皮333.3g    甘草100g。

取原料药，牡丹皮用5000ml的水蒸馏，收集3333ml的蒸馏液，于0～10℃下冷藏8小时，滤过，得丹皮酚结晶I，滤液加入牡丹皮重量5％的氯化钠，重蒸馏，收集1000ml的蒸馏液，于0～10℃下冷藏8小时，滤过，得丹皮酚结晶II，合并丹皮酚结晶I和II，于40℃低温干燥，即得丹皮酚，备用，滤液A另器收集，药渣与其余柴胡、丹参、熟地、白芷和甘草五味原料药，加水煎煮二次，第一次加水10重量倍，第2次加水8重量倍，每次煎煮2小时，滤过，合并滤液得滤液B，混合滤液A和B，浓缩至60～65℃下相对密度为1.20～1.25的稠膏，干燥，粉碎，过60目筛，得浸膏粉，备用；取上述丹皮酚研细，与占浸膏粉重量0.5％的硬脂酸镁混合均匀，加入上述浸膏粉中，混匀，加入常规辅料，按照常规工艺制成冻干粉针剂。

实施例9：实施例1制备的本发明药物组合物胶囊剂的质量检测方法

鉴别：

A.取本发明药物组合物胶囊剂内容物0.5g，加水25ml使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次用15ml，合并正丁醇提取液，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取柴胡对照药材1g，加甲醇20ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，加热回流1小时，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次用15ml，合并正丁醇提取液，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制备对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.005ml，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水＝13∶7∶2在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％对二甲氨基苯甲醛硫酸乙醇溶液，取0.5-1.5％对二甲氨基苯甲醛硫酸溶液1mL，用乙醇稀释至10mL，取该溶液喷硅胶G薄层板，在70℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；置紫外灯365nm下检视，显相同黄色的荧光斑点；

B.取本发明药物组合物胶囊剂内容物0.5g，加水30ml使溶解，滤过，滤液用稀盐酸调PH值至1-2，置分液漏斗中，用醋酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并醋酸乙酯液，减压回收醋酸乙酯至干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；

另取丹参对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至2ml，作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.005ml，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水＝15∶1∶1∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点；

C.取本发明药物组合物胶囊剂内容物1g，加乙醇20ml，密塞，振摇10分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液；

另取丹皮酚对照品，加丙酮制成每1ml含0.005g的溶液，作为对照品溶液；

照薄层色谱法(附录VIB试验)，吸取上述两种溶液各0.010ml，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯＝3∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝褐色斑点；

D.取本发明药物组合物胶囊剂内容物0.5g，加水25ml使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次用15ml，合并正丁醇提取液，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取白芷对照药材0.5g，加甲醇10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至2ml，作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.005ml，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以30-60℃石油醚-醋酸乙酯＝1∶1.1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

E.取本发明药物组合物胶囊剂内容物1g，加水30ml使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水20ml洗涤2次，弃去水层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取甘草对照药材0.5g，加甲醇4ml，超声处理30分钟，取上清液作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各0.005ml，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水＝15∶1∶1∶2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

含量测定：照高效液相色谱法(附录VI D)测定

A.丹参素：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.5％冰醋酸＝20∶80为流动相；检测波长为280nm；理论板数按丹参素峰计算应不低于2000；

对照品溶液制备：取丹参素钠对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.00006g的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本发明药物组合物胶囊剂内容物0.5g，置100ml三角瓶中，精密加甲醇50ml，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置50ml圆底烧瓶中，回收溶剂至干，残渣加流动相溶解并转入10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液0.005ml和0.010ml、供试品溶液0.010ml，注入液相色谱仪，测定，即得；

每粒本发明药物组合物胶囊中含丹参以丹参素(C₉H₁₀O₅)计，不得少于1.6mg；

B.丹皮酚：

色谱色条与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-冰醋酸＝60∶40∶1为流动相；检测波长为27nm；理论板数按丹皮酚峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.000005g的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本发明药物组合物日用制剂量的1/24，置100ml三角瓶中，精密加甲醇50ml，超生处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.010ml，注入色谱仪，测定，即得；

每粒本发明药物组合物胶囊中含牡丹皮以丹皮酚(C₉H₁₀O₃)计，不得少于2.6mg。

实施例10：实施例1制备的本发明药物组合物胶囊剂的质量检测方法

A.取本发明药物组合物胶囊剂内容物0.5g，加水25ml使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次用15ml，合并正丁醇提取液，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取柴胡对照药材1g，加甲醇20ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，加热回流1小时，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次用15ml，合并正丁醇提取液，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制备对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各0.005ml，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水＝13∶7∶2在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％对二甲氨基苯甲醛硫酸乙醇溶液，取0.5-1.5％对二甲氨基苯甲醛硫酸溶液1mL，用乙醇稀释至10mL，取该溶液喷硅胶G薄层板，在70℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；置紫外灯365nm下检视，显相同黄色的荧光斑点；

B.取本发明药物组合物胶囊剂内容物0.5g，加水30ml使溶解，滤过，滤液用稀盐酸调PH值至1-2，置分液漏斗中，用醋酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并醋酸乙酯液，减压回收醋酸乙酯至干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；

另取丹参对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至2ml，作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.005ml，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水＝15∶1∶1∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点；

C.取本发明药物组合物胶囊剂内容物1g，加乙醇20ml，密塞，振摇10分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液；

另取丹皮酚对照品，加丙酮制成每1ml含0.005g的溶液，作为对照品溶液；

照薄层色谱法(附录VI B试验)，吸取上述两种溶液各0.010ml，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯＝3∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝褐色斑点；

D.取本发明药物组合物胶囊剂内容物0.5g，加水25ml使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次用15ml，合并正丁醇提取液，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取白芷对照药材0.5g，加甲醇10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至2ml，作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各0.005ml，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以30-60℃石油醚-醋酸乙酯＝1∶1.1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

E.取本发明药物组合物胶囊剂内容物1g，加水30ml使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水20ml洗涤2次，弃去水层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取甘草对照药材0.5g，加甲醇4ml，超声处理30分钟，取上清液作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.005ml，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水＝15∶1∶1∶2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

实施例11：实施例1制备的本发明药物组合物胶囊剂的质量检测方法

A.丹参素：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.5％冰醋酸＝20∶80为流动相；检测波长为280nm；理论板数按丹参素峰计算应不低于2000；

对照品溶液制备：取丹参素钠对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.00006g的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本发明药物组合物胶囊剂内容物0.5g，置100ml三角瓶中，精密加甲醇50ml，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置50ml圆底烧瓶中，回收溶剂至干，残渣加流动相溶解并转入10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液0.005ml和0.010ml、供试品溶液0.010ml，注入液相色谱仪，测定，即得；

每粒本发明药物组合物胶囊中含丹参以丹参素(C₉H₁₀O₅)计，不得少于1.6mg；

B.丹皮酚：

色谱色条与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-冰醋酸＝60∶40∶1为流动相；检测波长为27nm；理论板数按丹皮酚峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.000005g的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本发明药物组合物日用制剂量的1/24，置100ml三角瓶中，精密加甲醇50ml，超生处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.010ml，注入色谱仪，测定，即得；

每粒本发明药物组合物胶囊中含牡丹皮以丹皮酚(C₉H₁₀O₃)计，不得少于2.6mg。

实施例12：实施例1制备的本发明药物组合物胶囊剂的质量检测方法

鉴别：

A.取本发明药物组合物胶囊剂内容物0.5g，加水25ml使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次用15ml，合并正丁醇提取液，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取柴胡对照药材1g，加甲醇20ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，加热回流1小时，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次用15ml，合并正丁醇提取液，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制备对照药材溶液；

B.取本发明药物组合物胶囊剂内容物1g，加乙醇20ml，密塞，振摇10分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液；

另取丹皮酚对照品，加丙酮制成每1ml含0.005g的溶液，作为对照品溶液；

照薄层色谱法(附录VI B试验)，吸取上述两种溶液各0.010ml，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯＝3∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝褐色斑点；

含量测定：照高效液相色谱法(附录VI D)测定

A.丹参素：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.5％冰醋酸＝20∶80为流动相；检测波长为280nm；理论板数按丹参素峰计算应不低于2000；

对照品溶液制备：取丹参素钠对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.00006g的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本发明药物组合物胶囊剂内容物0.5g，置100ml三角瓶中，精密加甲醇50ml，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置50ml圆底烧瓶中，回收溶剂至干，残渣加流动相溶解并转入10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液0.005ml和0.010ml、供试品溶液0.010ml，注入液相色谱仪，测定，即得；

每粒本发明药物组合物胶囊中含丹参以丹参素(C₉H₁₀O₅)计，不得少于1.6mg。

实施例13：实施例2制备的本发明药物组合物片剂的质量检测方法

鉴别：

A.取本发明药物组合物日用制剂量的1/12，加水30ml使溶解，滤过，滤液用稀盐酸调PH值至1-2，置分液漏斗中，用醋酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并醋酸乙酯液，减压回收醋酸乙酯至干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；

另取丹参对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至2ml，作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.005ml，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水＝15∶1∶1∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点；

B.取本发明药物组合物日用制剂量的1/6，加水30ml使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水20ml洗涤2次，弃去水层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取甘草对照药材0.5g，加甲醇4ml，超声处理30分钟，取上清液作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各0.005ml，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水＝15∶1∶1∶2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

含量测定：照高效液相色谱法(附录VI D)测定

丹皮酚：

色谱色条与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-冰醋酸＝60∶40∶1为流动相；检测波长为27nm；理论板数按丹皮酚峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.000005g的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本发明药物组合物日用制剂量的1/24，置100ml三角瓶中，精密加甲醇50ml，超生处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.010ml，注入色谱仪，测定，即得；

本发明药物组合物每日用制剂量中含牡丹皮以丹皮酚(C₉H₁₀O₃)计，不得少于31.2mg。

实施例14：实施例3制备的本发明药物组合物颗粒剂的质量检测方法

鉴别：

A.取本发明药物组合物日用制剂量的1/6，加水30ml使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水20ml洗涤2次，弃去水层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取甘草对照药材0.5g，加甲醇4ml，超声处理30分钟，取上清液作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各0.005ml，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水＝15∶1∶1∶2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

含量测定：照高效液相色谱法(附录VI D)测定

A.丹参素：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.5％冰醋酸＝20∶80为流动相；检测波长为280nm；理论板数按丹参素峰计算应不低于2000；

对照品溶液制备：取丹参素钠对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.00006g的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本发明药物组合物日用制剂量的1/12，置100ml三角瓶中，精密加甲醇50ml，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置50ml圆底烧瓶中，回收溶剂至干，残渣加流动相溶解并转入10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液0.005ml和0.010ml、供试品溶液0.010ml，注入液相色谱仪，测定，即得；

本发明药物组合物每日用制剂量中含丹参以丹参素(C₉H₁₀O₅)计，不得少于19.2mg；

B.丹皮酚：

色谱色条与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-冰醋酸＝60∶40∶1为流动相；检测波长为27nm；理论板数按丹皮酚峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.000005g的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本发明药物组合物日用制剂量的1/24，置100ml三角瓶中，精密加甲醇50ml，超生处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.010ml，注入色谱仪，测定，即得；

本发明药物组合物每日用制剂量中含牡丹皮以丹皮酚(C₉H₁₀O₃)计，不得少于31.2mg。

实施例15：实施例4制备的本发明药物组合物散剂的质量检测方法

鉴别：

A.取本发明药物组合物日用制剂量的1/12，加水30ml使溶解，滤过，滤液用稀盐酸调PH值至1-2，置分液漏斗中，用醋酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并醋酸乙酯液，减压回收醋酸乙酯至干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；

另取丹参对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至2ml，作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各0.005ml，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水＝15∶1∶1∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点；

B.取本发明药物组合物日用制剂量的1/12，加水25ml使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次用15ml，合并正丁醇提取液，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取白芷对照药材0.5g，加甲醇10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至2ml，作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.005ml，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以30-60℃石油醚-醋酸乙酯＝1∶1.1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

C.取本发明药物组合物日用制剂量的1/6，加水30ml使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水20ml洗涤2次，弃去水层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

另取甘草对照药材0.5g，加甲醇4ml，超声处理30分钟，取上清液作为对照药材溶液；

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各0.005ml，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水＝15∶1∶1∶2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

含量测定：照高效液相色谱法(附录VI D)测定

A.丹参素：

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.5％冰醋酸＝20∶80为流动相；检测波长为280nm；理论板数按丹参素峰计算应不低于2000；

对照品溶液制备：取丹参素钠对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.00006g的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本发明药物组合物日用制剂量的1/12，置100ml三角瓶中，精密加甲醇50ml，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置50ml圆底烧瓶中，回收溶剂至干，残渣加流动相溶解并转入10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液0.005ml和0.010ml、供试品溶液0.010ml，注入液相色谱仪，测定，即得；

本发明药物组合物每日用制剂量中含丹参以丹参素(C₉H₁₀O₅)计，不得少于19.2mg。