生物催化菌株在把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素中的应用

摘要

本发明涉及生物医药和生物技术领域，具体是一种生物催化菌株在把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素中的应用，三种细菌菌株可以通过生物催化把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素，为解决现有右旋磷霉素严重的资源浪费和环境污染等问题提供了技术基础。右旋磷霉素是左旋磷霉素化学合成工艺中形成的副产物，无药效，被作为废物弃掉，污染环境、浪费资源。本发明验证了三种细菌菌株的混合培养物具有通过生物催化把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的能力。这三种细菌菌株分别是弗氏柠檬酸杆菌、假单胞菌以及梭状芽孢杆菌。本发明提出的三种细菌菌株所具有的催化能力，具有使现在被废弃的右旋磷霉素通过生物催化技术变废为宝、获得再利用的可能性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药和生物技术领域，具体是一种生物催化菌株在把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素中的应用。

背景技术

左旋磷霉素[(-)-顺-(1R，2S)-1，2-环氧丙基磷酸，FOM]是一种广谱抗生素。与其它抗生素不同，磷霉素具有独特的化学结构与抗菌机制。磷霉素与其它抗生素之间没有交叉耐药性，目可呈现协同作用。同时，因为磷霉素还具有理化特性稳定、安全低毒、无抗原性等优点，现已广泛用于临床治疗，被称为二十一世纪的新抗生素。

目前，磷霉素生产工艺采用的是化学合成技术，该技术收率低，主要原因是工艺中的环氧化步骤是对称性的化学催化过程，所获得的产物为磷霉素消旋体，即左旋和右旋磷霉素各占一半。其中，左旋磷霉素有疗效，从消旋体中被拆分出来后，进一步精制成为产品；而右旋磷霉素[(+)-顺-(1S，2R)-1，2-环氧丙基磷酸]无疗效，被作为废弃物排放掉，这导致了严重的资源浪费和环境污染等问题。

国内外现有研究结果显示，左旋磷霉素的不对称合成是可以通过生物催化/转化来实现的。一些细菌、放线菌和真菌可以完成由顺丙烯磷酸到左旋磷霉素的不对称环氧化过程，且只合成左旋磷霉素，而不生成右旋磷霉素。这方面的报道见：文献1(Itoh N.，M.Kusaka，T.Hirota et al，.Microbial production of antibioticfosfomycin by a stereoselective epoxidation and its formation mechanism.ApplMicrobiol Biotechnol.1995，43：394-401.)、文献2(Watanabe M.，Sumida N.，Murakami S.et al.A phosphonate-induced gene which promotes Penicillium-mediatedbioconversion of cis-propenylphosphonic acid to fosfomycin.Appl Environ Microbiol.1999.65：1036-1044.)和文献3(石家骥，崔福绵，葛猛.青霉菌立体选择性环氧化顺丙烯磷酸产生磷霉素.微生物学报.2001.41：353-356.)。

通过生物催化菌株将右旋磷霉素转化为左旋磷霉素则是一个新近发现的生物催化现象(中国发明专利：一种把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的方法，专利号：ZL200710012579.3)。该现象的发现为实现右旋磷霉素的再利用提供了一条可能的新途径，但目前对具此催化能力的微生物菌株所知甚少。此前，三种细菌：弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii，ATCC 8090)、假单胞菌(Pseudomonas sp.ATCC 11922)以及梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes，ATCC 3584)的功能报道如下表，尚未见它们具有催化右旋磷霉素转变为左旋磷霉素能力的报道。

表1：三种细菌的已报道功能

发明内容：

本发明的目的在于提供一种生物催化菌株在把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素中的应用，为解决现有技术中右旋磷霉素严重的资源浪费和环境污染等问题提供技术基础。

本发明的技术方案是：

一种生物催化菌株在把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素中的应用，利用弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii，ATCC 8090)、假单胞菌(Pseudomonas sp.ATCC11922)和梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes，ATCC 3584)三种细菌菌株，通过生物催化过程把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素，具体步骤如下：

(1)把三种细菌菌株，即：弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii，ATCC 8090)、假单胞菌(Pseudomonas sp.ATCC 11922)以及梭状芽孢杆菌(Clostridiumsporogenes，ATCC 3584)，分别以完全培养基富集培养，然后离心、收集菌体。

完全培养基组分为：按重量百分数计，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.2％，琼脂2％，余量为水；pH 7.5，121℃湿热灭菌20min。富集培养条件为恒温震荡培养，培养温度28-37℃、摇床转速150-250rpm，培养12-72小时。

(2)将所收集菌体接种于催化培养基，每种菌体的接种量各占催化培养基重量的2％-15％；恒温28-37℃震荡培养48-120小时获得发酵液，发酵液进一步检测其中是否含有左旋磷霉素。

催化培养基组分为：按重量百分数计，右旋磷霉素0.5-3.0％，(NH₄)₂SO₄0.5-1.0％，NaCl 0.2％，KCl 0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.01-0.02％，FeSO₄·7H₂O 0.01-0.03％，KH₂PO₄0.05-0.15％，余量为水；pH 7.5，121℃湿热灭菌20min，恒温震荡培养，培养温度28-37℃、摇床转速150-250rpm，培养时间3-7天。

(3)分别以薄层层析和生物鉴定盘方法定性及定量检测发酵液中是否含有左旋磷霉素(中国发明专利：一种把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的方法，专利号：ZL200710012579.3)。

ATCC系美国典型物保藏中心，又称美国模式典型物收集中心的简称。

本发明的有益效果：

1.通过生物催化菌株将右旋磷霉素转化为左旋磷霉素是一个新近发现的生物催化现象，为实现右旋磷霉素的再利用提供了一条可能的新途径。但目前对具此催化能力的微生物菌株所知甚少。本发明验证了三种细菌菌株的混合培养物具有通过生物催化过程把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的能力。这三种细菌菌株分别是弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii，ATCC 8090)、假单胞菌(Pseudomonassp.ATCC 11922)以及梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes，ATCC 3584)。利用这三种细菌菌株的混合培养物在催化培养基中震荡培养48-120小时实现该转变过程。

2.本发明提出的三种细菌菌株所具有的催化能力，具有使现在被废弃的右旋磷霉素通过生物催化技术变废为宝、获得再利用的可能性。

具体实施方式

三种细菌菌株，即：弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii，ATCC 8090)、假单胞菌(Pseudomonas sp.ATCC11922)和梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes，ATCC 3584)，可以通过生物催化把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素，利用这三种细菌菌株的混合培养物，在催化培养基中震荡培养48-120小时，可以实现该转变过程。

先把三种细菌菌株分别以完全培养基富集培养，然后离心、收集菌体。完全培养基组分为：按重量百分数计，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.2％，琼脂2％，余量为水；pH 7.5，121℃湿热灭菌20min。富集培养条件为恒温震荡培养，培养温度28-37℃、摇床转速150-250rpm，培养12-72小时。

再将所收集菌体分别接种于催化培养基，28-37℃恒温震荡培养48-120小时，发酵液进一步检测其中是否含有左旋磷霉素。催化培养基组分为：按重量百分数计，右旋磷霉素0.5-3.0％，(NH₄)₂SO₄0.5-1.0％，NaCl 0.2％，KCl 0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.01-0.02％，FeSO₄·7H₂O 0.01-0.03％，KH₂PO₄0.05-0.15％，余量为水；pH 7.5，121℃湿热灭菌20min，恒温震荡培养，培养温度28-37℃、摇床转速150-250rpm，培养时间3-7天。

最后分别以薄层层析和生物鉴定盘方法定性和定量检测发酵液中是否含有左旋磷霉素。

实施例：

先把三种细菌菌株，即：弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii，ATCC 8090)、假单胞菌(Pseudomonas sp.ATCC 11922)和梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes，ATCC 3584)，分别以完全培养基富集培养，离心、收集菌体。完全培养基组分为：按重量百分数计，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.2％，琼脂2％，余量为水；pH 7.5，121℃湿热灭菌20min。富集培养条件为恒温震荡培养，培养温度30℃、摇床转速150rpm，培养24小时。

再将所收集菌体接种于催化培养基中，弗氏柠檬酸杆菌、假单胞菌和梭状芽孢杆菌的接种量分别占催化培养基重量的6％、2％、4％，37℃恒温震荡培养96小时，发酵液进一步检测其中是否含有左旋磷霉素。催化培养基组分为：按重量百分数计，右旋磷霉素3.0％，(NH₄)₂SO₄1.0％，NaCl 0.2％，KCl 0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，FeSO₄·7H₂O 0.02％，KH₂PO₄0.10％，余量为水，pH 7.5，121℃湿热灭菌20min。恒温震荡培养，培养温度30℃、摇床转速150rpm，培养时间5天。

最后，以薄层层析定性鉴定发酵液中含有左旋磷霉素，以生物鉴定盘方法定量检测发酵液中左旋磷霉素浓度为67.3μg/ml。

结果表明，通过本发明可以验证三种细菌菌株的混合培养物具有通过生物催化把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的能力，使现在被废弃的右旋磷霉素通过生物催化技术变废为宝、获得再利用成为可能。