一种人血小板源性生长因子A同源二聚体及其生成方法

摘要

本发明公开了一种人血小板源性生长因子A同源二聚体及其高效生产方法，该方法主要包括以下步骤：克隆人源血小板源性生长因子A剪接体2基因；构建真核表达载体并转化其到真核酵母宿主中；通过筛选，得到高水平分泌表达的酵母转化子，酵母表达的PDGF-A存在糖基化和非糖基化的两种形式；利用摇瓶扩大培养，培养液上清经透析后经CM阳离子交换柱与G-75分子筛进行高效纯化，利用CM阳离子交换法通过优化透析液的pH能够有效纯化得到其中一个PDGF-A的单体被糖基化而另一个单体未被糖基化的PDGF-AA二聚体新修饰蛋白，分离纯化的PDGF-AA二聚体新的糖基化修饰蛋白具有高度的均一性。

说明书

技术领域

本发明涉及应用重组DNA技术生产基因工程蛋白药物技术，具体来说涉及到一种高效生产人血小板源性生长因子A同源二聚体，以及该方法得到的人血小板源性生长因子A同源二聚体。

背景技术

成熟的血小板源性生长因子(PDGF)是由2条肽链构成的以二硫键相连接的同源或异源二聚体，是相对分子量约为30kD的糖蛋白。PDGF是由A、B、C、D四个亚基通过二巯键相互聚合形成二聚体。在机体内，PDGF含有五种异构体：PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-DD。PDGF的半衰期很短(小于2min)，在机体血清内含量很低。PDGF主要是通过自分泌或旁分泌作用，与细胞膜上特异的受体相结合，将胞外信号传递到细胞内。

PDGF主要来源于血小板，在人体中发挥着十分重要的生物学功能，目前认为它在损伤修复、胚胎发育中具有重要作用，并可能参与了动脉粥样硬化、血管再狭窄、某些恶性肿瘤的发生。PDGF能诱导创面血管平滑肌细胞的迁移和内皮细胞增殖、迁移并促进微血管的再生，有利于组织的供氧；可以促进成纤维细胞增殖，增加细胞外基质成分，以利于组织的收缩；能促进角质形成细胞的增殖与迁移，有助于创面的再上皮化。PDGF在细胞(包括胶质细胞)的增殖中起着关键作用，PDGF-A对雄性小鼠生殖系统的发育起着决定性的作用，提示PDGF-A对于生殖系统某些疾病的诊断和治疗可能具有重要意义。

人PDGF-A基因位于7号染色体，由7个外显子组成，外显子1编码信号肽序列，外显子2和3编码可被高尔基复合体胞内加工去除的前体序列，外显子4和5编码生长因子结构域，外显子6编码C’-端序列，在蛋白成熟过程中可被加工去除，外显子7基本不编码。PDGF-A存在两种剪接体，含有或不含有外显子6编码序列。人血小板源性生长因子A剪接体2，其信号肽包含二十个氨基酸残基，成熟单体蛋白由110个氨基酸残基组成，理论分子量约为13KDa，在体内经糖基化修饰后，该蛋白的分子量约为34KDa。

在国外住院的糖尿病人中，该病占47％，国内占8％-12％，是糖尿病致残的首要原因。瑞典、马来西亚、印度尼西亚等国的截肢率为48-49.18％，美国约占50％，每年因该病4万余人被截肢。国内也有报道为38.1％-75％，截肢后死亡率也很高。PDGF可以有效治疗糖尿病下肢溃疡。PDGF(BB)为有效成份的处方药已得到美国FDA的批准并于1997年用于临床治疗糖尿病下肢溃疡。利用酿酒酵母为宿主菌，表达人重组PDGF(BB)蛋白，以该重组蛋白为有效成份，强生公司开发出名为Gel的处方药膏，连续涂用该药膏20周，糖尿病下肢溃疡治愈率超过50％，极大地减少了因患该病而截肢的风险，是目前治疗该病最有效的药物之一。我国是糖尿病患者大国，有超过9000万的糖尿病患者，其中并发该病的患者约占糖尿病患者总数的1％，近1/3的并发症患者因得不到有效治疗而不得不选择截肢。PDGF-AA在糖尿病下肢溃疡伤口愈合的早期发挥非常重要的功能，能大大促进对糖尿病下肢溃疡的治疗效果。

PDGF除在治疗糖尿病下肢溃疡表现出显著的疗效外，在其它一些疾病的治疗上也具有十分重要的价值。如，在骨折发生后，PDGF通过促进骨折区域细胞的增殖、分化对骨折的愈合及在许多生理病理过程中起重要的调控作用，对促进临床骨折早期愈合预防骨愈合的延迟有重要临床价值；PDGF的正常表达对于神经系统的发育和成熟起着重要的作用，临床上可望用其来治疗神经系统有发育缺陷的病人；PDGF-A对于生殖系统的发育具有重要意义。

随着对PDGF-AA作用机制及临床应用研究的不断深入，PDGF-AA作为药物，其需求量也大大增加。目前，市场上主要利用大肠杆菌和酿酒酵母对其进行表达。大肠杆菌的表达产物通常以包涵体形式存在，要通过变性复性得复杂操作才能得到活性形式的PDGF-AA，从而减少了活性蛋白的产率；另外，原核表达的PDGF-AA通常以融合蛋白的形式存在，除去融合的非PDGF-AA片段需要经过复杂且高成本的酶切步骤才能得与天然PDGF-AA一级结构完全相同的蛋白；第三，原核宿主表达尤其是在大肠杆菌中表达，因为LPS的存在而产生毒素性，因此往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定；第四，大肠杆菌表达系统不能对表达后的产物进行糖基化修饰，导致表达出来的产物往往生物活性不高，最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失活。虽然，国外有利用酿酒酵母对PDGF进行表达与纯化的相关研究报道，但PDGF在酿酒酵母中的表达水平比较低，在高密度发酵条件下，每升产品能得到的PDGF纯品不足10毫克，表达的产物的两个单体都经不同程度的糖基化修饰，表达出来的产物均一性差。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效生产人血小板源性生长因子A同源二聚体(PDGF-AA)酵方法，根据该方法可获得稳定、高效分泌表达rhPDGF-AA的毕赤酵母转化子并有效纯化到一种新的糖基化修饰形式的rhPDGF-AA，该重组蛋白较未经糖基化的蛋白具有更高的生物活性；利用该发明陈述的方法，可保证得到的rhPDGF-AA新的糖基化修饰蛋白具有正确的空间结构和生物学活性。

解决上述目的的技术方案如下：

一种生产人血小板源性生长因子A同源二聚体(PDGF-AA)的方法，包括以下步骤：

(1)克隆人PDGF-A基因：以人血小板细胞mRNA为模板，先用RT-PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，用PDGF-A特异引物扩增出完整人重组PDGF-A剪接体2基因片段，所用PDGF-A特异引物中引入Xho I酶切位点和在未端引入Xba I酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pMD20-T载体，得质粒rhPDGF-A/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列；

(2)构建真核表达载体：将表达载体pPICZαA和质粒rhPDGF-A/pMD20-T经过Xho I及Xba I双酶切后纯化回收，并利用T4DNA连接酶，得重组载体pPICZαA/PDGF-A；

(3)转化重组载体到真核酵母宿主中：重组载体pPICZαA/PDGF-A用SacI单酶切线性化后，用电击转化法转入GS-115中；经过Zeocin筛选得到阳性克隆，阳性克隆利用聚合酶链式反应得到了验证；

(4)高水平分泌表达酵母转化子的筛选：阳性克隆转接至含有高浓度Zeocin 2000μg/mL的YPD平板，筛选到了高Zeocin抗性的转化子，高抗性转化子在BMGY培养基培养至光密度值＞10，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1.0％，于诱导后的0h，24h，48h，72h，96h，120h时取样，共诱导120小时，经SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表达rhPDGF-AA酵母转化子，在摇瓶条件下的表达情况，该转化子表达的rhPDGF-AA超过60mg/mL；

(5)诱导上清液离心，收集离心后的上清液，20mM Tris pH 8.0透析后，利用CM阳离子交换柱于ATKA-HPLC系统中纯化，0.13M NaCl的20mM Tris pH 8.0缓冲液漂洗后，利用PBS(离子强度为0.2M)洗脱收集的样品，利用超滤法浓缩收集到的蛋白，浓缩样品经Sephadex G-75分子筛分离，收集OD₂₈₀＞50mAU的样品；收集的样品利用超滤方法浓缩，浓缩样品经Sephadex G-75分子筛分离，收集PDGF-AA目标蛋白，经该方法，最后得到纯度达97％以上的重组人PDGF-AA蛋白。

经质谱分子量测定和去糖基化分析，结果表明利用本发明纯化的PDGF-AA是一条PDGF-A链经糖基化修饰和另一条链未经糖基化修饰的二聚体蛋白，使上该纯化方法能有效将该修饰形式的蛋白和毕赤酵母分泌表达的两个单体都被糖基化的PDGF-AA分离开来，该纯化得到的重组蛋白具有高度均一性和极高的生物学活性。

优选地，所述rhPDGF-A特异引物为：

5’-GCCTCGAGAAGAGAAGCATCGAGGAAGCTG-3’加入了Xho I酶切位点；

5’-GCTCTAGATCACCTCACATCCGTGTC-3’加入了Xba I酶切位点。

本发明的另一目的是提供一种人血小板源性生长因子A同源二聚体。

具体技术方案如下：

根据上述方法生产得到的人血小板源性生长因子A同源二聚体，其中同源二聚体中一条PDGF-A链经糖基化修饰，另一条链未经糖基化修饰；所述同源二聚体的分子量27825.513Da。

用本发明所述的生产rhPDGF-AA的高水平表达酵母转化子及其分离纯化新的糖基化修饰形式的蛋白方法具有显著的优势：一方面，它能够防止宿主菌对表达产物的降解、减轻宿主细胞代谢的负荷以及表达产物对宿主的毒性作用；二是能够促进分泌蛋白按适当的方式折叠、恢复其天然构象；三是毕赤酵母在表达重组蛋白的同时进行适度的糖基化修饰，且不会引起超抗原反应；四是利用酵母载体上的分泌信号α-因子信号肽引导目的蛋白的基因分泌表达，目的蛋白会大量分必到培养液中并生成具有完全生物活性的同源二聚体，从而保持其天然活性；五是摸索出一条有效纯化具有生物活性的人重组PDGF-AA新的糖基化修饰蛋白的方法；六是经质谱分子量测定和去糖基化分析，结果表明利用本纯化方法得到的PDGF-AA是一条PDGF-A链经糖基化修饰和另一条链未经糖基化修饰的二聚体蛋白，而将两条链都未被糖基化的PDGF-AA除去，该纯化得到的蛋白具有高度均一性；七是测定了毕赤酵母表达PDGF-AA的生物活性，测定结果表明：毕赤酵母表达的rhPDGF-AA新的糖基化修饰的蛋白在极低浓度下(0.1ng)表现出极高的生物学活性且较大肠杆菌表达的产物具有更高的生物活性。

本发明探索出的最优组合的用真核宿主毕赤酵母高效表达和纯化PDGF-AA新的糖基化修饰蛋白的方法，既保证了PDGF-AA的生物学活性和均一性，也高效地获得了大量稳定蛋白。该方法将毕赤酵母中分泌表达的不同糖基化修改的PDGF-AA蛋白分离纯化开来，得到的产物是一条PDGF-A链经糖基化修饰和另一条链未经糖基化修饰的二聚体蛋白，经生物活性测定表明，该方法纯化到的蛋白较未经糖基化修饰的PDGF-AA具有更高的生物活性。该方法纯化到的PDGF-AA是一条PDGF-A链经糖基化修饰和另一条链未经糖基化修饰的二聚体蛋白，该种形式的蛋白是所有报道均未报道的新的糖基化修饰形式的蛋白。

附图说明

图1，真核表达载体pPICZαA/PDGF-A构建示意图；

图2，毕赤酵母转化子的PCR验证电泳分析示意图；

图3，摇瓶条件下，毕赤酵母表达的rhPDGF-AA各时段SDS-PAGE电泳分析示意图；

图4，诱导阶段，不同时间段培养液总蛋白及酵母菌体湿得结果分析图；

图5，rhPDGF-AA的CM阳离子柱纯化的洗脱曲线及SDS-PAGE分析蛋白纯度；

图6，分子筛纯化目的SDS-PAGE结果示意图及本法纯化得到的蛋白的SDS-PAGE结果；

图7，rhPDGF-AA的去糖基化分析SDS-PAGE的银染结果；

图8，PDGF-A单体的分子量大小分析；

图9，PDGF-AA二聚体蛋白的分子量大小分析；

图10，rhPDGF-AA生物学活性的结果示意图；

图11，本发明纯化的PDGF-AA与大肠杆菌表达产物的活性比较结果示意图。

具体实施方式

本发明选用毕赤酵母GS-115菌株，整合性表达质粒pPICZαA载体均购自美国Invritrogen公司。

所用培养基配方如下：

1)酵母生长培养基(BMGY)：

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到700mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL 1M磷酸钾溶液，100mL YNB，2mL 500*B，100mL 10*GY；

2)酵母诱导培养基(BMMY)

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到700mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL 1M磷酸钾溶液，100mLYNB，2mL500*B，100mL10*M；

3)YPD液体培养基

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，10g葡萄糖，定容到1000mL，121℃蒸气高压灭菌15-20min。(固体YPD培养基：向YPD液体培养基中加入18g琼脂，即得YPD固体培养基，用于制备YPD平板)。

一种高效生产人血小板源性生长因子A剪接体2同源二聚体(PDGF-AA)的方法，主要包括以下步骤：

1、克隆rhPDGF-A全基因：

设计一对引物，以人血小板细胞的mRNA为模板，先用RT-PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，用PDGF-A特异引物扩增出完整人重组PDGF-A基因片段，PCR条件为：95℃预变性，5min，一个热循环；94℃热变性30s，55℃褪火30s，72℃延伸45s，30个热循环；72℃复性10min。所获得的扩增片断连接到pMD20-T载体(购自于广州TAKARA公司)，用PCR，酶切和核酸测序鉴定，测定序列与Genebank公布的PDGF-A剪接体2的序列一致。

PCR扩增引物为：

上游引物：5’-GCCTCGAGAAGAGAAGCATCGAGGAAGCTG-3’(SEQ ID NO.1)加入了Xho I酶切位点；

下游引物：5’-GCTCTAGATCACCTCACATCCGTGTC-3’(SEQ ID NO.2))加入了XbaI酶切位点。

2、构建毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA/PDGF-A

1)用Xho I和Xba I双酶切重组质粒rhPDGF-A/pMD20-T，获得目的片断rhPDGF-A，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

质粒rhPDGF-A/pMD20-T       15μL

10×H缓冲液                5μL

Xho I                      5U

Xba I                      5U

无菌水                     至50μL

2)用Xho I和Xba I双酶切pPICZαA，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

质粒pPICZαA               15μL

10×H缓冲液                5μL

Xho I                      5U

Xba I                      5U

无菌水                     至50μL

3)由1)及2)步后所得目的片断和载体片断，DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。构建示意图见图1。

4)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：

质粒pPICZαA片段           1μL

目的片段落                 3μL

10×缓冲液                 1μL

T4连接酶                   0.5μL

无菌水                     至10μL

得重组载体pPICZαA/PDGF-A。

3、转化重组质粒至毕赤酵母GS-115中：

将5-10μg经Xho I和Xba I双酶切pPICZαA验证的质粒线性化后(Sac I)溶解在10μLMilliQ水中，与80μL GS-115菌感受态混均，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；按照Invitrogen公司操作手册电转化法将重组载体转化到宿主毕赤酵母菌GS-115中。转化后用含有100μg/mL Zeocin抗生素的YPD(Yeast extract peptone dextrose)平板进行筛选，利用PCR对转化子进行了验证(以5’Fac和3’AOX1为引物，PCR电泳结果如图2所示)。

4、高水平分泌表达酵母转化子的筛选：

经PCR验证的毕赤酵母转化子(阳性克隆)经YPD液体培养基洗下，经稀释后涂布接种至含有500μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板，28℃生长出的转化子通过YPD液体培养基洗下(YPD平板上的菌落通过YPD液体培养基洗下)，经稀释后再涂布到含有2000μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板，筛选高抗性的转化子，高抗性转化子以BMGY培养基培养至光密度值＞10.0，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1.0％，诱导120小时后，经SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表达rhPDGF-A酵母转化子。

5、rhPDGF-AA在摇瓶条件下的扩大表达：

高水平分泌表达酵母转化子于1L BMGY培养基培养至光密度值＞10，离心收集细胞，用150mL BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1.0％，每24小时取样一次并补加甲醇一次至终浓度为1％，经诱导120小时后，各时间段的样品测定其总蛋白含量及菌体温得，所得样品上清经SDS-PAGE分析。在扩大摇瓶诱导条件下，该转化子表达的rhPDGF-AA超过60mg/L；摇瓶条件下，诱导96小时左右，rhPDGF-AA的表达量达到最高值，再延长诱导的时间会其表达水平没有明显提高。SDS-PAGE电泳结果如图3所示，在约28KDa和30KDa处存在两条特异表达的蛋白条带(不加DTT，图3A，其中甲代表糖基化的PDGF-AA，乙代表一条链未经糖基化的PDGF-AA)及约13K和15K(加DTT还原，图3B，甲代表糖基化的PDGF-A，乙代表未经糖基化的PDGF-A)处有目的蛋白表达，发酵上清的总蛋白随诱导时间变化的曲线如图4A所示，发酵液菌体湿重变化如图4B所示。

6、rhPDGF-AA的纯化

诱导上清液于4℃离心，收集离心后的上清液，20mM Tris pH 8.0透析后，利用CM阳离子交换柱于ATKA-HPLC系统中纯化，0.13M NaCl的20mM Tris pH 8.0缓冲液漂洗后，利用PBS(离子强度0.2M)洗脱收集的样品，洗脱蛋白峰如图5A所示，洗脱蛋白的SDS-PAGE结果如图5B所示，利用超滤法浓缩收集到的蛋白，浓缩样品经Sephadex G-75分子筛分离，收集OD₂₈₀＞50mAU的样品；收集的样品利用超滤方法浓缩，浓缩样品经Sephadex G-75分子筛分离，收集PDGF-AA目标蛋白收集到的蛋白经SDS-PAGE分析，在加入与不加入DTT情况下，得到分子量分别为约28KDa的PDGF-AA蛋白条带和约13KDa及15KDa的PDGF-A单体蛋白(SDS-PAGE结果如图6所示)，经该方法，最后得到纯度达97％以上的重组人PDGF-AA蛋白。利用该方法和传统方法对表达产物进行分离纯的结果进行对比，SDS-PAGE结果可以看出，利用该方法能将PDGF-AA不同修饰的蛋白与其它蛋白分离开来，请参见SDS-PAGE结果如图6-B所示，其中1为纯化前的样品，2是利用本方法纯化得到的蛋白；3利用其它方法纯化到的蛋白。

7、PDGF-AA的去糖基化分析

将经分子筛纯化得到的PDGF-AA利用丙酮沉淀过夜，离心，得到沉淀，再利用丙酮洗涤沉淀一次，于室温下凉干；将TFMS中加入苯酚(90mM，1mL TFMS中约加入8μL的苯酚，苯酚于50℃水浴融溶)，将含有苯酚的TFMS于-10℃冷冻15min，将50μL TFMS加入到PDGF-AA蛋白沉淀中，于-10℃冰箱中反应10min，立即加入2M Tris 0.6mL，终止反应；将上述溶液加入到10mL PBS溶液中。利用超滤管超滤浓缩至0.2mL；按1∶9的比例加入丙酮，于-20℃淀过夜，离心，得沉淀；沉淀再利用无水乙醇洗涤一次，于室温凉干，向沉淀中加入20μL 1倍的SDS-PAGE上样缓冲液(不加DTT)进行电泳分析(10％SDS-PAGE)，并快速银染分析(结果如图7-A所示)，去糖基化结果表明，该表达的PDGF-AA的产物在酵母中经糖基化修饰(结果如图8所示)。

8、PDGF-A单体及PDGF-AA二聚体的分子量分析

取经分子筛纯化得到的样品共约30μg加入0.05mM的DTT于37℃还原1小时(8M尿素)，再转移到室温下，加入0.05mM IAA，于室温反应一小时，再加入丙酮，于-20℃过夜，经离心沉淀蛋白。样品经SDS-PAGE分析，SDS-PAGE结果如图8A所示。结果表明，得到两分子量不同的蛋白条带，说明该酵母表达系统表达的PDGF-A被部分糖基化修饰。将上述样品进行质谱分析两单体的分子量的大小，分析结果表明一单体的分子量约为13KDa(未被糖基化)，另一单体的分子量为15KDa(经糖基化修饰)，分析结果如图7-B所示；直接利用分离纯化的蛋白，经丙酮沉淀及无水乙醇洗涤除去盐杂质后，对PDGF-AA的二聚体蛋白进行分子量大小分析，分谱分析结果表明，该二聚体蛋白的分子量为27825.513Da(结果如图9所示)，结果证实该方法纯化到的PDGF-AA蛋白由一条糖基化的PDGF-A和一条未经糖基化的PDGF-A形成的二聚体蛋白。

9、rhPDGF-AA的生物学活性分析

1将NIH/3T3成纤维细胞于正常的10％FBS的DMEM中传代培养；到细胞生长密度约达80-90％时，利用胰酶消化，利用5％的CM处理的FBS(FBS-CM)(胎牛血清的CM阳离子交换柱过柱，去除其中的碱性生长因子：向25mL简装柱中加入5mL的CM阳离子树脂，利用5倍体积的0.1M的NaOH和HCl分别洗柱子两次，再用25mL PBS平稳柱子两次，向柱子中加入FBS共25mL，见到黄色FBS流出时开始收集FBS，收集到的FBS分另再通过柱子两次，将上述收集到的FBS利用0.22μm细菌滤器过滤两次，即得到经CM阳性子交换柱处理的FBS)的DMEM(2％FBS-CM)培养液将细胞调整到1X10⁵个/mL述细胞悬液接种到96孔培养板中，每孔接种100μL。向上述96孔板中分别加入终浓度为0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200ng/mL)的PDGF-AA，每个浓度分别做四个重复孔；于温箱中培养60小时；向各孔中加入10μL 5mg/mL的MTT，于培养箱中温育4小时，利用移液枪小心将培养液上清吸干净，向每孔中加入100μL的DMSO于震荡器中震荡10min充分溶解，测定570nm光值。所测结果表明，酵母表达的PDGF-AA具有生物学活性，在极低浓度下(0.1ng/mL)纯化得到的PDGF-AA具有良好的生物学活性(结果如图10A所示)。

2将NIH/3T3成纤维细胞于正常的10％FBS的DMEM中传代培养；到细胞生长密度约达80-90％时，加入无血清DMEM经36小时饥饿后，加入不同浓度的PDGF-AA纯化蛋白，作用15分钟后，利用PBS洗培养皿3次，加入含蛋白磷酸化酶的抑制剂于RIPA中，裂解细胞提取总蛋白，取10μg蛋白，经SDS-PAGE后，WB分析p-AKT及p-42/44的变化情况。WB结果表明，该方法纯化的PDGF-AA能激活相应p-AKT及p-42/44的磷酸化，说明纯化的蛋白具有生物活性(结果如图10B所示)。

10、本发明纯化的rhPDGF-AA与大肠杆菌表达产物的生物活性比较：

将NIH/3T3成纤维细胞于正常的10％FBS的DMEM中传代培养；到细胞生长密度约达80-90％时，加入无血清DMEM经36小时饥饿后，分别加入不同浓度的本方法纯化得到的PDGF-AA蛋白和从国外某知名公司利用大肠杆菌表达系统纯化的未经糖基化修饰的PDGF-AA蛋白，作用15分钟后，利用PBS洗培养皿3次，加入含蛋白磷酸化酶的抑制剂于RIPA中，裂解细胞提取总蛋白，取10μg蛋白，经SDS-PAGE后，WB分析p-AKT及p-42/44的变化情况。WB结果表明，该方法纯化的PDGF-AA在相同蛋白浓度下均较大肠杆菌的表达产物具有更高的生物活性(结果如图11所示)。

以上仅为本发明的具体实施例，并不以此限定本发明的保护范围；在不违反本发明构思的基础上所作的任何替换与改进，均属本发明的保护范围。