基于PCR的串联重复序列快速构建法和专用引物对及应用

摘要

一种基于PCR的串联重复序列快速构建法和专用引物对及应用，该方法是以根据目的顺式作用元件设计的引物对对目的顺式作用元件进行PCR扩增，得到方向相同的目的顺式作用元件的低拷贝串联重复序列，该方法仅用一个PCR快速构建3个以上同向串联子，阳性克隆率达到18％，用两个PCR和一个亚克隆，可以获得200个同向串联子。低拷贝串联子在酵母杂交中用于重复顺式元件的构建快速有效，而获得的高拷贝串联在高分子重复蛋白质的生产具有极广泛的用途。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种串联重复序列的构建方法，尤指一种用PCR快速构建串联重复序列的方法及该方法在酵母单杂交中启动子核心重复序列构建中的应用。

背景技术：

真核生物中各种转录因子在转录水平的调控是基因表达调控的主要方式。典型的转录因子都有DNA结合区与转录激活区(或抑制区)，在特定的时间、部位或特定条件(如胁迫条件)下，特定的转录因子与靶基因启动子的顺式作用元件特异性结合并相互作用，就可以激活或抑制靶基因的表达。

要阐明细胞内各种信号转导与基因表达的机制，以及细胞对外界环境刺激引起的一系列信号传递与应答基因表达调控等机理，鉴定各种调控基因表达的顺式作用元件和转录因子至关重要。

酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆或鉴定转录因子基因。而该酵母单杂交方法中，构建酵母报道子是用酵母单杂交方法鉴定特定转录因子中的一个重要内容。报道子的结构是将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子P_min上游，P_min启动子下游连接报道基因。进行cDNA融合表达文库筛选时，编码目的转录因子的cDNA融合表达载体转化进入酵母细胞后，其编码产物(转录因子)与顺式作用元件结合，就可以激活P_min启动子，并促使报道基因表达。一般来说，需要在最基本启动子Pmin上游构建3个以上按同一方向串联连接的顺式元件的重复序列。但是，现有构建顺式元件重复序列通常采用在顺式作用元件的两端加同一酶切位点，进行酶切后回收再用T4连接酶连接。由于顺式作用元件通常较小(小于100bp)，回收的效率低，同时连接时会出现正向连接和反向连接两种情况，出现3个以上的重复片段的机率很小，只有约2％左右，筛选和鉴定相当麻烦。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种基于PCR的串联重复序列快速构建法和专用引物对及应用，具体地说，就是用PCR的方法快速，构建一系列重复基因，用于酵母单杂交中启动子核心重复序列的构建，也可用于构建快速重复系列表达相同的蛋白结构域。

为了解决上述技术问题，本发明所采用技术方案是：一种用于扩增低拷贝方向相同的顺式作用元件的串联重复序列的引物对，其特点是：所述引物对是根据目的顺式作用元件的序列来设计，正向引物取目的顺式作用元件序列的前20bp；反向引物由两部分组成，前半部分27个碱基取目的顺式作用元件序列的前27bp的反向互补序列，后半部分23个碱基取目的顺式作用元件序列的最后23bp的反向互补序列。

一种基于PCR的串联重复序列快速构建法，该方法是以按上述引物对的设计方法，根据目的顺式作用元件设计的引物对，对目的顺式作用元件进行PCR扩增，得到方向相同的目的顺式作用元件的低拷贝串联重复序列。

本发明还可以上述低拷贝串联重复序列为模板，以根据目的顺式作用元件设计的引物对对其进行PCR扩增，可得到方向相同的目的顺式作用元件的高拷贝串联重复序列。该高拷贝串联重复序列在高分子重复蛋白质生产中应用极广。

上述目的顺式作用元件是DRE顺式作用元件。上述引物对为：

正向引物：5＞CAGTTTGAAAGAAAAGGGAA＜3；反向引物：

5＞TCTTTTTTTCCCTTTTCTTTCAAACTGGCTTTTTGGAACTCATGTCGGTA＜3。

本发明还提供了上述引物对在构建酵母单杂交系统启动子核心重复序列中的应用。以及本发明构建法在构建酵母单杂交系统启动子核心重复序列中的应用。

本发明主要解决了现有技术中多拷贝DRE(3个以上)串联的问题。现有技术构建串联DRE序列通常采用酶切和连接的方法，将同一序列用Hind III进行单酶切后，由于两端的酶切位点相同，出现反接的概率达到50％，要想筛选到同向串联4个以上相当困难。采用本发明，设计一对引物，采用PCR法，不依赖于酶切和连接，就可以获得3个同向串联的克隆18％以上，而且，由于引物设计的原因，不会出现反接的现象。该方法快速、高效、简单，并且可能同时获得2×、3×、4×等一系列同向串联顺式作用元件的重复序列，没有颠倒连接的现象，也没有反复回收的麻烦，鉴定和筛选非常快捷方便。从而，大大简化了实验程序，加快了实验速度。此外，本发明还能获得200个以上的同向串联子，对于获得高拷贝重复序列，高拷贝高分子重复蛋白质也有极广泛的用途。

附图说明：

图1是用PCR法构建DRE串联子的原理图。

图2是低拷贝DRE串联子产物的电泳图。

其中，泳道2-5：分别为反应5，15，25，35循环后的产物；M：100bp ladder；泳道1：阴性对照。

图3是串连子4×DRE的测序结果图，显示无酶切位点。

图4是高拷贝DRE串联子产物的电泳图。

其中，泳道1：反应20循环后的产物；泳道2：反应10循环后的产物；泳道3、4：反应30循环后的产物；泳道5、6：反应40循环后的产物；M：100bp ladder。

图5是将4×DRE串联子分别连接到pHISi和pLacZi上的酶切结果电泳图。

其中，M：200bp Lad；泳道1：pHISi-4×DRE酶切电泳图；泳道2：pLacZi-4×DRE酶切电泳图。

图6是将含4×DRE序列的pHISi和pLacZi分别转化YM4271酵母的结果图。

其中，右上图：含pHISi-4×DRE的YM4271酵母在缺陷培养基(SD/-His)上的生长情况，左上图：阴性对照；右下图：含pLacZi-4×DRE的YM4271酵母利用β-半乳糖苷酶活性进行蓝色显性反应，左下图：阴性对照。

具体实施方式：

以下将对本发明作进一步地说明。

rd29A基因是Yamaguchi-Shinozaki等从干旱处理的拟南芥中克隆而成，它不仅受干旱的诱导，也受高盐及低温的诱导。rd29A基因的表达在干旱高盐及低温胁迫下，受DREB类转录因子调控。其启动子序列鉴定出了71bpDRE顺式作用元件(其序列见SEQ ID NO.1)，这个顺式作用元件中含有TACCGACAT核心序列。

一、用PCR法构建低拷贝同向串联DRE重复序列：

材料：含rd29A启动子71bp DRE顺式作用元件的pCAMBIA1301质粒(中科院遗传与发育研究所陈受宜教授提供)。

1、引物对的设计是根据29A启动子71bp DRE顺式作用元件序列，用PrimerPremier 5.0程序设计。正向引物取29A启动子71bp序列前20bp。反向引物由两部分组成，前半部分27个碱基取29A启动子71bp序列前27bp的反向互补序列，这部分序列在进行第一轮反应后，其互补序列可以成为长引物成为正向引物，参与下一轮PCR反应生成2×或n×DRE序列；反向引物的后半部分23个碱基取29A启动子71bp序列最后23bp的反向互补序列，这23bp可以在任一轮PCR中作为反向引物，生成2×或n×DRE序列。

正向引物为：5＞CAGTTTGAAAGAAAAGGGAA＜3，见SEQ ID NO.2；

反向引物为：

5＞TCTTTTTTTCCCTTTTCTTTCAAACTGGCTTTTTGGAACTCATGTCGGTA＜3，见SEQ IDNO.3。其中反向引物又可作为中间引物，将相同的两个rd29A启动子序列同向连接在一起。

扩增rd29A启动子序列的上述引物对由美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen公司)合成。

2、用长引物PCR法获得低拷贝DRE串联子：

以上述引物对rd29A启动子序列进行PCR扩增，以下试剂中的Taq酶、10×Buffer 5、及dNTP购自天根生化科技(北京)有限公司(TIANGEN公司)；

50μl反应体系包括：Taq酶0.3微升(2.5U/微升)，10×Buffer 5微升，dNTP(2.5mmol)2.5μl，pCAMBIA1301质粒25ng，正向引物加0.25μl，终浓度约为0.05μM，反向引物加2.5μl，终浓度约为0.5μM，双蒸水补至所需体积。

PCR程序为：①94℃，预变性5min；②94℃，变性35s；③60℃，退火30s；④72℃，延长1.5min(第②步到第④步循环数设5，15，25，35四个梯度)；⑤72℃，延长7min(一个循环)。

该反应体系中可能会发生的反应有多步，如图1所示。

取扩增产物按常规技术进行电泳测定，电泳结果如图2所示。结果表明，前25个循环主要发生的是图1的第II步反应，35个循环就可明显看出有3×和4×DRE和产生，说明当1×、2×DRE较多时，就会发生第III、IV步以后的反应。

3、n×DRE的亚克隆：

切取上述扩增产物中的3×或4×DRE条带，采用QIAGEN公司的MinEluteGel Extraction Kit试剂盒，按说明书进行回收，插入pGEM-T载体。

插入pGEM-T载体的亚克隆步骤包括：

①准备选择性培养基：配500ml LB培养基(胰蛋白胨tryptone 5g，酵母粉yeast extract 2.5g，NaCl5g，pH7.0)，高压灭菌，待冷至60℃左右加入氨苄(Amp)储存液使终浓度为50mg/L，然后摇匀后倒平板；

②准备含X-gal和IPTG的筛选培养基：X-gal储液(20mg/ml)：用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液，包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏，储存于-20℃；IPTG储液(200mg/ml)：在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后，用蒸馏水定容至1ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃；在①步骤中制备好的含50mg/L Amp的LB平板表面加40ml X-gal储液和4μl IPTG储液，用无菌玻棒将溶液涂匀，置于37℃下放置3-4小时，使培养基表面的液体完全被吸收，置于暗处备用；

③将PCR回收产物插入pGEM-T载体：10μl反应体系包括连接反应缓冲液2×Buffer(60mM Tris-HCl(pH 7.8)，20mM MgCl2，20mM DTT，2mM ATP，10％polyethylene glycol(MW8000，ACS Grade)5μl、T4DNA连接酶(T4DNAligase)1μl、pGEM-T载体1μl、回收产物3μl，4℃连接16小时；

④将连接产物加入TOP10感受态细胞(购自TIANGEN公司)中，轻轻混匀，立即置冰上30min；将管置42℃恒温水浴中热激90s，然后迅速置于冰上1-2min；加入800μl预热的LB液体培养基，37℃预表达培养45-60min；

⑤将上一步培养基涂于加有Amp且含X-gal和IPTG的筛选培养基上，37℃过夜培养12-16小时；

⑥每个培养皿里能长出200个左右的白斑和几个蓝斑，筛选白斑进行一步实验。

4、阳性克隆的PCR检测和测序验证：随机挑选50个白斑，每个分别加入含有50mg/L Amp的1ml LB液体培养基摇菌12小时至液体混浊。以混浊菌液为模板用pGEM-T载体的通用测序引物T7和SP6进行PCR检测。

引物T7：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’，

SP6：5’-ATTTAGGTGACACTATAG-3’；

50μlPCR反应体系包括Taq酶0.3μl(2.5U/微升)，10×Buffer 5μl，新鲜混浊菌液1μl，dNTP(2.5mmol)2.5μl，用T7和SP6引物作正反向引物(各加2.5μl，终浓度约为0.5μM)，加双蒸水至50μl进行PCR检测。

PCR程序为：①94℃，预变性5min；②94℃，变性35s；③60℃，退火30s；④72℃，延长1.5min(第②步到第④步循环数为30)；⑤72℃，延长7min(一个循环)。

结果表明，50个菌中的2×DRE菌为26个，3×DRE为6个，4×DRE为3个。3个以上重复的达到18％以上。

将获得PCR验证含有4×DRE的一个白斑进行进一步摇菌，用高纯度质粒小提中量试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，DP107-02)提取质粒，送Invitrogen公司测序。测序结果见图3所示，4个DRE序列连接准确，连接部位没有酶切位点。4个ACCGAC框没有碱基突变。

二、用长引物PCR法获得高拷贝DRE串联子：

所用PCR试剂及量、引物对同低拷贝DRE串联子所用的相同，不同的是模板采用上一步提取的含4×DRE质粒约25ng。

PCR程序为：①94℃，预变性5min；②94℃，变性35s；③60℃，退火30s；④72℃，延长1.5min(第②步到第④步循环数调整为10，20，30，40)；⑤72℃，延长7min(一个循环)。

取PCR扩增产物按常规技术进行电泳测定，结果如图4所示，结果表明，20个循环后主要发生的是第V步反应，20-30个循环内，产物的拷贝数主要分布在500-1500bp之间。30个循环以后n×DRE的长度远远超过了1500bp，说明DRE的串联拷贝数超过了200个。

三、低拷贝同向串联DRE重复序列在酵母单杂交中的应用：

材料：pHISi、pLacZi载体、YM4271酵母及DH5α感受态购自MATCHMAKEROne-Hybrid System试剂盒(Clontech，K1603-1)，T4DNA连接酶和Buffer购自Promega。

1、pHISi-4×DRE和pLacZi-4×DRE载体的构建

参照Clontech公司提供的用户手册，将获得测序验证的pGEM-T-4×DRE通过酶切和连接，将4×DRE序列分别连接到pHISi和pLacZi载体上。

参照Clontech公司提供的用户手册，将获得测序验证的pGEM-T-4×DRE用T7(带Xho I酶切位点，由Invitrogen公司合成，5’-CCGCTCGAGCGGGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’，划线部分为Xho I酶切位点)和SP6引物扩增4×DRE序列和pGEM-T载体上的多克隆位点：

50μl PCR反应体系包括Taq酶0.3μl(2.5U/微升)，10×Buffer 5μl，含4×DRE质粒25ng，dNTP(2.5mmol)2.5μl，用T7引物(含Xho I酶切位点)和SP6引物作正反向引物(各加2.5μl，终浓度约为0.5μM)，加双蒸水至50μl进行PCR检测。

PCR程序为：①94℃，预变性5min；②94℃，变性35s；③60℃，退火30s；④72℃，延长1.5min(第②步到第④步循环数为30)；⑤72℃，延长7min(一个循环)。

用超薄DNA产物纯化试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，DP203-02)回收纯化扩增条带用于下一步酶切连接实验。

(1)酶切一：用Xho I和Sal I(TaKaRa)分别双酶切带两位点的4×DRE序列PCR扩增产物和pLacZi空载体，分别用TIANGEN胶回收试剂盒切胶回收。

酶切体系如下(20μL)：

4×DRE或载体pLacZi     约1μg

10×High buffer        2μl

Xho I                  1μl

SalI                   1μl

                                       

加双蒸水至             20μl(Total)

酶切二：用Sac I和Sac II(TaKaRa)分别双酶切带两位点的4×DRE序列PCR扩增产物和pHISi空载体，分别用TIANGEN胶回收试剂盒切胶回收。

酶切体系如下(20μL)：

4×DRE或载体pHISi                   约1μg

10×High buffer                     2μl

Sac I                               1μl

Sac II                              1μl

                                                   

加双蒸水至                          20μl(Total)

37℃放置2h，1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物分别切胶后，用试剂盒纯化。

(2)连接：用T4DNA连接酶(Promega)进行连接反应，目的基因片段与载体的摩尔数之比约为3∶1。

反应体系(10μL)，酶切一和酶切二的4×DRE序列分别与相应的酶切载体进行连接：

酶切回收4×DRE序列                   约50ng

载体双酶切回收片段(pHISi或pLacZi)    约300ng

2×T4 DNA Ligase Buffer              5μl

T4 DNA Ligase                        0.5μl

                                                  

加双蒸水至                           10μl(Total)

4℃连接过夜。

(3)转化大肠杆菌DH5α：将连接产物热激转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(步骤参考用户手册，筛选抗生素用Amp)，步骤如下：

①准备选择性培养基(含50mg/L Amp)：配500ml LB培养基(胰蛋白胨tryptone 5g，酵母粉yeast extract 2.5g，NaCl 5g，pH7.0)，高压灭菌，待冷至60℃左右加入氨苄(Amp)储存液使终浓度为50mg/ml，然后摇匀后倒平板；

②将连接产物加入DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，立即置冰上30min；将管置42℃恒温水浴中热激60s，然后迅速置于冰上1-2min；加入800μl预热的LB液体培养基，37℃预表达培养45-60min；

③将上一步培养基涂于含有50mg/L Amp的筛选培养基上，37℃过夜培养12-16小时，用PCR筛选阳性重组子；对阳性重组子用碱裂解法提取质粒，进一步做双酶切鉴定，1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。各挑选一个阳性克隆菌，进一步摇菌，并提取质粒用于后续实验。

结果：经双酶切验证，4×DRE序列分别连接到pHISi和pLacZi载体上，参见图5。

2、酵母单杂交试验

将含4×DRE序列的pHISi和pLacZi分别转化YM4271酵母，参照Clontech公司提供的用户手册进行酵母单杂交试验。

(1)酵母YM4271感受态细胞的制备：挑单菌落接种于10ml YPD液体培养基(配方：1％Yeast Extract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)，若制固体培养基，加入2％琼脂粉)中，30℃，250rpm培养过夜；测定过夜培养物的OD600值为3.0～5.0之间；将10ml YPD过夜培养物稀释至OD600值为0.2～0.4；在28～30℃摇床中继续培养3～6hr，使其OD600值达到0.6～1.0；于室温1500g离心5min收集酵母细胞，弃上清；用10ml洗液洗酵母细胞，随后于室温1500g离心5min离心收集细胞，弃上清；用1ml TE/LiAc重悬酵母细胞，以每管50μl分装。

(2)重组质粒DNA对酵母YM4271的转化：将感受态细胞离心，弃去上清，然后依次加入240ul50％PEG4000、36ul 1Mlicl、及50ul用水溶解的质粒DNA5-10ug(上一步提取的阳性克隆质粒)，剧烈震荡，混匀；30℃温育30分钟，平稳放置；42℃热激20-25分钟；6000-8000rpm离心，弃去上清；用1ml灭加水轻轻重悬；

(3)含pHISi-4×DRE重组质粒酵母YM4271的筛选：参照Clontech公司提供的用户手册，将质粒pHISi-4×DRE转化至酵母菌株YM4271的转化产物涂布于SD/-His营养缺陷型培养基上来筛选阳性克隆，利用3-AT竞争性实验对YM4271(pHISi-4×DRE)进行本底表达活性检测，预期结果为，在SD/-His培养皿上，阳性酵母生长良好。

(4)含pLacZi-4×DRE重组质粒酵母YM4271的筛选：参照Clontech公司提供的用户手册，将质粒pLacZi-4×DRE转化至酵母菌株YM4271的转化产物涂布于SD/-Ufa培养基，30℃培养4天，筛选阳性菌株。利用β-半乳糖苷酶显色反应对YM4271(pLacZi-DRE4)菌株进行本底表达活性检测，预期结果应为，含有pLacZi-4×DRE质粒的酵母过夜后变成蓝色，由此可以说明LacZ基因表达，可用于酵母单杂交系统的筛选。

结果表明，参见图6，4×DRE序列能与酵母的激活蛋白结合，启动下游HIS3和LacZ基因表达，而不含4×DRE序列的酵母不能启动HIS3和LacZ基因表达。该酵母表达系统可用于酵母单杂交鉴定DRE绑定蛋白的功能。

因此，本发明用PCR方法构建重复序列可用于同一序列快速串联，没有颠倒现象，特别用于酵母表达系统顺式串联子的构建是成功的。