一种运载荷载细胞因子的双调控溶瘤腺病毒的新型CIK细胞

摘要

本发明公开了一种运载荷载IL-2的双调控溶瘤腺病毒的新型CIK细胞，属新型CIK细胞的制备方法。该CIK细胞能够运载荷载细胞因子如IL-2的溶瘤腺病毒。该溶瘤腺病毒经过改造后，其穿梭质粒在缺失E1B55-kD的同时，利用hTERT启动子取代E1A启动子，达到双重调控病毒在肿瘤细胞中的选择性增殖。然后将此穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHG-fiber5/35重组，使完整的溶瘤病毒外壳具有嵌合型纤毛蛋白结构，以提高病毒感染CIK细胞的能力。该CIK细胞进入体内杀伤肿瘤细胞后，释放出的溶瘤腺病毒能发挥二次杀伤肿瘤细胞作用，同时所分泌的细胞因子IL-2能增强CIK细胞的抗肿瘤能力，发挥“细胞-病毒-基因”的三重协同抗肿瘤作用。该CIK细胞同时减少了全身应用细胞因子和溶瘤腺病毒的副作用。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和肿瘤生物治疗领域。具体的说，本发明涉及利用基因突变和重组技术，缺失病毒E1B55-kD蛋白、调控病毒E1A蛋白的表达、改造溶瘤腺病毒的纤毛蛋白，以提高溶瘤腺病毒靶向感染CIK细胞的能力和安全性。同时在溶瘤腺病毒中插入治疗基因IL-2，通过CIK细胞将荷载IL-2的双调控溶瘤腺病毒运载到肿瘤组织部位，发挥CIK细胞、溶瘤腺病毒和细胞因子的协同杀伤肿瘤作用，在增强靶向抗肿瘤作用的同时，避免了全身应用的副作用。

背景技术

溶瘤腺病毒作为一种特殊的肿瘤治疗药物和基因治疗载体近年来发展迅速，许多高效、靶向性病毒相继进入临床试验，显示出广阔的应用前景。目前，已进入临床试验的溶瘤病毒中，E1B-55kD蛋白缺失型腺病毒Onyx-015被认为是疗效最佳、最有前途的一种溶瘤腺病毒。

Onyx-015是1996年由美国Onyx医药公司开发的腺病毒基因药物，腺病毒缺失E1B-55kD蛋白后，不能在正常细胞内复制，而在p53失活的肿瘤细胞中大量复制，并溶解肿瘤细胞。在Ⅰ期临床试验中，Onyx-015治疗14例常规治疗失败的头颈癌患者，有6例肿瘤明显缩小，部分病例病情改善，未见明显不良反应。然而，在Ⅱ期临床试验中，Onyx-015治疗胰腺癌43例、胃肠癌19例、卵巢癌16例、大肠癌肝转移33例、远处转移癌9例，均无明显的客观疗效[1-3]。

为提高溶瘤病毒的疗效，刘新垣院士把Onyx-015改造成能够插入抗癌基因的载体pZD55，随着病毒在肿瘤细胞内的复制，抗癌基因表达量大大提高。 虽然荷载抗癌基因的溶瘤腺病毒ZD55在体内外实验均显示出更好的抗肿瘤疗效[4-5]，但仍无法完全消灭肿瘤。主要原因是溶瘤病毒进入人体后会受到多种免疫机制的清除。目前病毒主要给药方法是瘤内注射或静脉注射，由于各种免疫、生化或物理屏障的作用，导致病毒递送效率很低[6,7]。所以，病毒进入体内后很快被补体、抗病毒抗体及各种吞噬细胞等破坏，不能发挥有效的抗肿瘤作用。如何将病毒准确而高效地运输到肿瘤有待解决。

研究人员想到利用细胞作为病毒的运载工具，即病毒感染并进入具有肿瘤识别能力的细胞中，静脉注射细胞，利用细胞对肿瘤组织的趋向性，帮助病毒越过复杂的血液环境将病毒运抵肿瘤组织。目前常用的细胞载体主要有三类：肿瘤细胞、干细胞和T淋巴细胞，但这些细胞载体存在诸多问题，如获取困难、安全性低、血管穿透性差、肿瘤识别能力单一及细胞大量扩增困难等，无法满足临床要求[8-10]。因此，寻找一种能够对肿瘤组织广谱识别、保护病毒逃避免疫清除、有效穿透血管和肿瘤组织屏障的新型细胞载体，是确保溶瘤病毒发挥治疗作用的关键。

细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells，CIK）具有向肿瘤组织局部趋化聚集的特性，大量临床应用证明CIK细胞大剂量回输的安全性[11,12]。因此，利用CIK细胞作为病毒的载体是个理想的选择。2006年Thorne等[13]在《Science》报道了利用CIK细胞运载牛痘病毒（vvDD）的研究。结果显示，CIK细胞成功地将vvDD准确运载到小鼠肿瘤组织部位，效果明显优于其他种类细胞载体。

病毒必须对载体细胞具有较强的感染能力，才能顺利进入细胞，并达到抗肿瘤所需要的滴度。常用的5型腺病毒（Ad5）通过细胞表面柯萨奇-腺病毒受体（CAR）感染细胞。但CIK细胞低表达CAR，因此利用Ad5感染CIK细胞效果可能不佳。研究表明，人35型腺病毒（Ad35）感染细胞不依赖CAR受体，能够高效感染淋巴细胞及肿瘤细胞[14,15]。利用Ad35纤毛蛋白的knob和shaft替换Ad5纤毛蛋白的knob和shaft，构建的具有嵌合型纤毛蛋白的重组病毒能够高效地感染T淋巴细胞及NK细胞[16,17]。因此，用pBHG-fiber5/35代替腺病毒右臂质粒pBHGE3作为病毒重组包装的骨架质粒，使重组病毒具有嵌合型纤毛蛋白结构，可以提高病毒感染CIK细胞的能力。

溶瘤腺病毒感染并进入CIK细胞后，如果病毒过早复制必然会导致CIK细胞的溶解破坏，削弱CIK细胞的抗肿瘤作用，也无法将病毒运载到肿瘤组织。前已述及，E1B-55kD蛋白缺失的溶瘤腺病毒ZD55可以选择性地在肿瘤细胞内繁殖，而对正常细胞几乎无影响。为进一步控制其对CIK细胞及正常组织的毒副作用，利用在肿瘤细胞中高活性的人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因启动子替换ZD55的E1A 基因启动子，希望通过双重调控严格限制病毒在CIK细胞的增殖能力，而不影响其在肿瘤细胞内的增殖。

前已述及，溶瘤腺病毒荷载抗癌基因将进一步提高其抗肿瘤疗效。大量研究发现IL-2可刺激细胞毒T淋巴细胞、NK细胞等增殖，从而加强机体的免疫功能，控制肿瘤生长，减少复发[18]。但是，IL-2全身大剂量应用时产生严重的毒副作用，甚至导致病人死亡。将IL-2基因转染肿瘤细胞，在转染细胞的局部分泌IL-2，不仅可以避免全身性副作用，而且可以诱导机体产生抗肿瘤免疫反应[19]。同时，IL-2还是刺激诱导单个核细胞生成CIK细胞不可缺少的细胞因子。

因此，利用CIK细胞运输荷载IL-2的溶瘤腺病毒进入体内，能避免机体对溶瘤腺病毒的破坏；CIK细胞杀伤肿瘤细胞后，释放出的溶瘤腺病毒能发挥二次靶向杀伤肿瘤细胞作用；同时所分泌的细胞因子IL-2能增强CIK细胞的抗肿瘤能力，发挥“细胞-病毒-基因”的三重协同抗肿瘤作用。还能起到有效减少全身应用细胞因子和溶瘤腺病毒所导致的副作用。

发明内容

本发明涉及一种运载荷载IL-2的双调控溶瘤腺病毒的新型CIK细胞。更具体地说，在本发明中CIK既是抗肿瘤的效应细胞，又是溶瘤腺病毒的运载工具。所运载的溶瘤腺病毒经基因重组改造后具有如下特点：对CIK细胞具有较强的感染力；能保证病毒只在肿瘤细胞中增殖；荷载了治疗基因。在实施例中，CIK运载的溶瘤腺病毒是双调控并荷载IL-2作为治疗基因的溶瘤腺病毒。

本发明的技术方案是：一种运载荷载IL-2的双调控溶瘤腺病毒的新型CIK细胞，用pBHG-fiber5/35作为病毒重组的骨架质粒，以肿瘤特异性hTERT启动子替换E1B-55kD蛋白缺失的溶瘤腺病毒穿梭质粒pZD55的E1A启动子，并插入IL-2基因，重组为荷载IL-2的双调控溶瘤腺病毒。重组溶瘤腺病毒感染CIK细胞后，由CIK将其运载到肿瘤部位，待CIK杀伤肿瘤细胞自身死亡后，释放出溶瘤病毒，发挥溶瘤病毒和IL-2的抗肿瘤作用，避免了全身应用的副作用。同时，局部释放的IL-2又能进一步刺激CIK细胞的增殖和激活，增强CIK的抗肿瘤作用。

上述说明以及下面的实例仅是用作举例说明，并不构成对本发明范围的限制。也就是说，凡通过对溶瘤腺病毒改造，并以CIK作为溶瘤病毒载体均在本发明的范围。

本发明的有益效果是：利用基因突变和重组技术，缺失病毒E1B55-kD蛋白、调控病毒E1A蛋白的表达、改造溶瘤腺病毒的纤毛蛋白，提高了溶瘤腺病毒靶向感染CIK细胞的能力和安全性。同时在溶瘤腺病毒中插入治疗基因IL-2，通过CIK细胞将荷载IL-2的双调控溶瘤腺病毒运载到肿瘤组织部位，发挥CIK细胞、溶瘤腺病毒和细胞因子的协同杀伤肿瘤作用，在增强靶向抗肿瘤作用的同时，避免了全身应用的副作用。

附图说明

图1-1 MTT检测不同CIK细胞体外抑制肺癌细胞A549的增殖；

图1-2 MTT检测不同CIK细胞体外抑制肝癌细胞HepG2的增殖；

图1-3 MTT检测不同CIK细胞体外抑制宫颈癌细胞HeLa的增殖；

图1-4 MTT检测不同CIK细胞体外抑制肾癌细胞ACHN的增殖；

图2-1 Annexin V染色检测不同CIK细胞诱导ACHN肿瘤细胞凋亡；

图2-2 DAPI染色检测不同CIK细胞诱导HeLa肿瘤细胞凋亡。

上述图中，图1-1至图1-4 是MTT检测不同CIK细胞体外抑制肿瘤细胞的增殖；图2-1至 是图2-2是Annexin V染色及DAPI染色分别检测不同CIK细胞诱导肿瘤细胞凋亡。

具体实施方式

下面结合优选具体实施例对本发明进行详细描述，但并不构成对本发明范围的限制。也就是说，凡针对溶瘤腺病毒改造，并以CIK作为溶瘤病毒载体均在本专利的范围。使用本发明治疗各种肿瘤疾病等也均在本发明的范围。

实施例1  一种运载荷载IL-2的双调控溶瘤腺病毒的新型CIK细胞

（一）  利用hTERT启动子替换溶瘤病毒ZD55的E1A基因启动子

（1）hTERT启动子的克隆：

设计引物：P1：5’-AT CTCGAG TGG CCC CTC CCT CGG GTT AC-3’

Xho I

P2：5’-GC TACGTA CGC GGG GGT GGC CGG GGC CA-3’

SnaB I

以含pGL3-hTERT质粒为模板，PCR扩增条件为94℃ 1min, 55℃ 1min，72℃ 1min。PCR扩增得到hTERT启动子基因片段，并引人Xho I和SnaB I酶切位点。

（2）hTERT启动子基因替换病毒的E1A基因启动子：

① 缺失E1A基因启动子：

设计引物：

P3：5’- TCC TGT GGATCC GGG CCC CCA TTT C -3’

BamH I

P4：5’- TTCAGTACGTAGTCGACCTCGAGATATTACGCGCTATGAGT AAC AC -3’

与P3互补

P5：5’- TATCTCGAGGTCGACTACGTACTGAAAATGAGACATATTATC -3’

与P2互补

P6：5’- TACT ACT ATT GCA TTC TCTAGA CAC A -3’

Xba I

以pXC1质粒为PCR反应的模板，引物P3与P4进行第一次PCR反应，电泳回收394 bp片段。以pXC1质粒为PCR反应的模板，引物P5与引物P6进行第二次PCR反应，电泳回收830 bp片段。两次PCR反应的产物有26bp互补序列，以两次PCR产物混合作为模板，以引物P3与引物P6进行第三次PCR反应，电泳回收1198 bp片段。以BamH I + Xba I酶切1198 bp的 PCR产物，克隆进BamH I + Xba I酶切过的pZD55质粒。

② hTERT启动子插入E1A启动子缺失的质粒pZD55中：

以Xho I和SnaB I酶切PCR扩增得到hTERT启动子基因片段，克隆进经相同酶切过的E1A启动子缺失的质粒pZD55中，命名为pTERT-ZD55。

（二）荷载IL-2的双调控溶瘤腺病毒穿梭质粒pTERT-ZD55-IL-2的构建

（1）克隆IL-2的cDNA：

设计引物：P1：5’- AT AGATCT ATG CAA CTC CTG TC -3’

Bgl II

P2：5’- TA AGATCT TTA TGT TGA GAT GAT GC-3’

Bgl II

以pcDNA3-IL-2质粒为模板， PCR扩增得到IL-2的cDNA，并引人Kpn I 和Bgl II酶切位点。

（2）构建质粒pTERT-ZD55-IL-2：

将IL-2的cDNA基因片段经Bgl II酶切，克隆进经Bgl II酶切后的pTERT-ZD55质粒，命名为pTERT-ZD55-IL-2。

（三）骨架质粒pBHG-fiber5/35与pTERT-ZD55-IL-2穿梭质粒重组，包装成完整病毒的鉴定

293细胞铺于10cm 培养皿，将穿梭质粒pTERT-ZD55-IL-2、 pTERT-ZD55及pTERT-ZD55-EGFP分别与Ad5/F35嵌合型腺病毒骨架质粒pBHG-fiber5/35通过Effectene共转染至293细胞，9-14天出现病毒空斑，经过病毒空斑纯化，进行扩增，提取重组腺病毒的DNA。通过PCR分析，确定重组正确的病毒，得到TERT-ZD55/F35-IL-2、TERT-ZD55/F35和TERT-ZD55/F35-EGFP。

将鉴定正确的病毒分别感染HEK293细胞扩增病毒，CsCl梯度离心纯化病毒，50％组织培养感染量（TCID50）法测滴度。

（四）病毒感染CIK细胞

（1）CIK细胞的培养：

抽取健康成人的外周血20ml，Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，生理盐水洗涤2次后，以RPMI1640（含10％胎牛血清）调节细胞数至1～2×10⁶/ml，第0天加入IFN-γ（1000U/ml），放置于37℃ 5％ CO₂培养箱箱中培养24h，第1天加入IL-1 （100U/ml），CD3单抗（15μg/ml），重组人IL-2（300U/ml）继续培养，第4天补充新鲜培养液，调节细胞数为1×10⁶/ml，补加IL-2（100U/ml），第0天、第7天及第14天取细胞用台盼蓝拒染法记数，第15天收获细胞用FCM测定CD3⁺CD56⁺双阳性细胞百分数。

（2）病毒感染CIK细胞：

将TERT-ZD55/F35-IL-2、TERT-ZD55/F35和TERT-ZD55/F35-EGFP重组病毒（滴度为1×10¹¹Pfu）分别加入培养成熟的CIK细胞中，使得病毒感染并进入细胞中。

（五）检测包被病毒的CIK细胞体外杀伤肿瘤效应

将装载不同病毒的CIK细胞分别作用于肿瘤细胞，MTT法检测细胞增殖活性，Annexin V染色及DAPI染色法检测凋亡。结果显示，荷载IL-2的双调控溶瘤腺病毒的CIK对肿瘤细胞的杀伤作用明显优于单纯CIK和荷载溶瘤腺病毒的CIK。见图1-1至1-4和图2-1至2-2。