超高密度大规模产猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法及设备

摘要

本发明涉及超高密度大规模产猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法及设备。本发明还涉及制备猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗的方法。本发明的方法采用固定床篮式搅拌系统以及片状载体，优化了生产工艺，可获得高密度的病毒生产细胞，从而获得高滴度的病毒。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及超高密度大规模产猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法及设备。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndome，PRRS)又称蓝耳病，是由冠状病毒科动脉炎病毒属的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndome virus，PRRSV)引起的猪繁殖障碍和呼吸系统的传染病。2006年夏季蓝耳病自我国南方数省开始，逐步蔓延到我国大部分省份，许多猪场发生了以猪高热、呼吸困难、皮肤发红为特征的猪“高热病”，至今疫情仍有发生，给养猪业造成了严重的经济损失。猪“高热病”为多病原混合感染及继发感染引起，其中PRRSV为主要病原之一。然而对PRRS尚无特效药物，目前主要采取综合防治措施和对症疗法，其中免疫预防是控制该病的重要措施之一。因此许多研究者致力于该病疫苗的研究并取得了较大的进展，目前已有多种灭活疫苗和弱毒疫苗被批准使用，由于用弱毒疫苗预防导致PRRS的流行的现象时常发生，因此研究者多主张采用灭活疫苗。灭活疫苗具有安全性好、不存在散布病原和造成PRRS新疫源的危险、便于储存和运输等优点。因此如何提高灭活疫苗的质量，消除外源病毒，减少血清和内毒素含量，优化制造工艺等，成为现在研究者的主要目标。

此外，随着生物技术产业的飞速发展，随着产品过程优化和放大技术研究的进展，传统的培养方式已难以满足市场的需求，生物反应器开始普遍流行于生物制品行业中，而且不断有更先进的生物反应器推向市场，它克服了传统方式的缺陷，可由小规模到大规模自动化放大培养细胞及病毒，满足市场对疫苗的需求。

目前，蓝耳病疫苗的生产主要是通过转瓶培养Marc145细胞病繁殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的工艺进行生产。该方法自动化程度低，劳动强度大，并因为转瓶细胞培养环境的不可控性，导致细胞和蓝耳病疫苗质量不稳定，产品批次差异大。

此外，中国专利CN101612395A中，揭示了一种在生物反应器中用球形微载体培养敏感细胞，在细胞上接种猪繁殖与呼吸综合征病毒以繁殖病毒，培养方法为悬浮培养。由于球形微载体提供了更大的表面积，细胞可以生长到更高的细胞密度，使得细胞和病毒繁殖处于较优的环境，提高了病毒滴度。然而该方法是在较低的细胞密度(3×10⁶-10×10⁶个细胞/mL)时接种病毒，培养一段时间后，收获含有细胞的病毒液，因此在制备疫苗时候，需要至少冻融一次并进行过滤(去除细胞或细胞碎片)后才能灭活、乳化，制成疫苗。操作工艺、条件复杂，易于污染。并且该专利中所揭示的获得的病毒液中病毒的滴度相比转瓶培养工艺只提高了0.3-1个TCID₅₀，也即提高的病毒产量并不多。

综上，本领域还需要进一步研究生产猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，优化生产条件和生产设备，简化生产流程，提高产品质量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的制备猪繁殖与呼吸综合征病毒及疫苗的方法。

本发明的另一目的在于提供一种新的制备猪繁殖与呼吸综合征病毒的设备。

在本发明的第一方面，提供一种制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法，所述的方法包括：

(1)提供一生物反应器(细胞培养罐)，其中包括固定床篮式搅拌系统以及片状载体；

(2)在生物反应器中加入营养液和病毒生产细胞，从而细胞贴于片状载体，且在片状载体上的细胞密度为5.8×10³-7.2×10³个/cm²；培养病毒生产细胞至片状载体上的细胞密度为1×10⁵-5×10⁵个/cm²；

(3)在生物反应器中加入猪繁殖与呼吸综合征病毒；

(4)收获猪繁殖与呼吸综合征病毒液。

在另一优选例中，加入病毒生产细胞前，对生物反应器进行清洗和/或灭菌。

在另一优选例中，加入病毒生产细胞前，调节生物反应器运行条件至80±40rpm、37±2℃、PH7.25±0.3、溶氧率(DO)60±10％(v/v)。

在另一优选例中，所述的病毒生产细胞是Marc-145细胞。

在另一优选例中，所述的营养液是：DMEM高糖培养基，其中以8-10％(v/v)的比例加入牛血清。

在另一优选例中，所述的片状载体是Fibracel^TMDisks，1g＝1200-1500cm²。

在另一优选例中，培养期间通过灌注法补充营养液或维持液。

在另一优选例中，定期取样测定培养基中的葡萄糖含量，来判定病毒生产细胞的生长情况或确定培养基的补充时间。

在另一优选例中，所述的维持液是DMEM高糖培养基，其中以0.5-1％(v/v)的比例加入牛血清。

在另一优选例中，步骤(3)中，接种时，病毒感染复数(MOI值)为0.005-0.5；较佳地为0.01-0.02。

在本发明的另一方面，提供一种制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗的方法，所述的方法包括：

(1)提供一生物反应器(细胞培养罐)，其中包括固定床篮式搅拌系统以及片状载体；

(2)在生物反应器中加入病毒生产细胞和培养基，从而细胞贴于片状载体，且在片状载体上的细胞密度为5.8×10³-7.2×10³个/cm²；培养病毒生产细胞至在片状载体上的细胞密度为1×10⁵-5×10⁵个/cm²；

(3)在生物反应器中接种猪繁殖与呼吸综合征病毒；

(4)收获猪繁殖与呼吸综合征病毒液；

(5)将收获猪繁殖与呼吸综合征病毒液进行灭活和乳化，从而获得猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗。

在本发明的另一方面，提供一种生物反应器，其包括：

一生物反应器本体，所述生物反应器本体中包括固定床篮式搅拌系统以及片状载体；

一或多个位于生物反应器本体或与生物反应器本体相连接的加料口；

一或多个位于生物反应器本体或与生物反应器本体相连接的出料口；以及

一控制装置，其用于调节生物反应器运行条件至80±40rpm、37±2℃、PH7.25±0.3、溶氧率(DO)60±10％(v/v)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、细胞培养期间葡萄糖消耗量(g/d)。

图2、病毒繁殖期间葡萄糖消耗量(g/d)。其中，41h-48h以4.2L/d的速度灌流；48h-65.5h以8.4L/d的速度灌流；65.5h-89h以12.6L/d的速度灌流；89h-113h以8.4L/d的速度灌流；113h-185h以4.2L/d的速度灌流；185h更换维持液后不再进行灌流，直至培养结束。

图3、病毒繁殖期间TCID₅₀的变化。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究试验，在设备、载体、工艺条件等方面优化了生产猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法。在此基础上完成了本发明。

为此，我们实验室致力于探索蓝耳病疫苗的生产工艺优化，研究应用生物反应器采用片状载体培养Marc-145细胞繁殖PRRSV，并摸索较为合理的培养方法。

本发明提供了一种制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法，所述的方法包括：

(1)提供一生物反应器(细胞培养罐)，其中包括固定床篮式搅拌系统以及片状载体；

(2)在生物反应器中加入病毒生产细胞和培养基，从而细胞贴于片状载体，且在片状载体上的细胞密度为5.8×10³-7.2×10³个/cm²；培养病毒生产细胞至在片状载体上的细胞密度为1×10⁵-5×10⁵个/cm²；

(3)在生物反应器中加入猪繁殖与呼吸综合征病毒；

(4)收获猪繁殖与呼吸综合征病毒液。

生物反应器

如本文所用，所述的“生物反应器”可以与“细胞培养罐”互换使用。

本发明所述的生物反应器中包括固定床篮式搅拌系统。固定床篮式搅拌系统是在反应器中装配固定的篮筐，中间装填聚脂纤维载体，细胞可附着在载体上生长，也可固定在载体纤维之间，靠上搅拌中产生的负压，迫使培养基不断流经填料，有利于营养成分和氧的传递，这种形式的灌流速度较大，细胞在载体中高密度生长，且细胞始终在固定的位置生长，加强了PRRSV的感染机会。而且采用提升式搅拌系统，使得细胞承受的剪切力很小，有利于细胞的生长。

本发明所述的生物反应器中还包括片状载体。片状载体主要成分是聚酯类纤维及聚丙烯支架，细胞主要生长于纤维片上，片状载体直径较佳地约为6mm。作为本发明的优选方式，所述的片状载体是Fibracel^TMDisks，1g＝1200-1500cm²。本发明人发现，该种片状载体提供了一种良好的载体环境，有利于本发明的病毒生产细胞的吸附和排列，有利于在培养后产生超高密度的细胞，且有利于病毒对于细胞的感染以及病毒在细胞上的增殖。

作为本发明的优选方式，所述的生物反应器包括一些控制设备，其可以控制生物反应器的运行条件至80±40rpm、37±2℃、PH7.25±0.3、溶氧率(DO)60±10％(v/v)。在该运行条件下病毒生产细胞可良好地生长增殖以及生产病毒。

所述生物反应器的体积没有特别的限制，本领域人员在本申请的提示下易于做出选择。作为本发明的优选方式，所述的生物反应器的罐体积是10-20L，工作体积8-15L。

生物反应器的一些其他设施、配件是本技术领域的技术人员所熟知的。生物反应器的清洗、消毒可以采用本领域熟知的方法和试剂，如可以在121℃的温度下进行消毒。

细胞培养及培养基

可采用任何适宜于被猪繁殖与呼吸综合征病毒感染和繁殖的细胞作为病毒生产细胞。例如所述的细胞可以是Marc145细胞或MA104细胞等。作为本发明的优选方式，所述的病毒生产细胞是Marc145细胞。

用于培养本发明的病毒生产细胞的培养基可以采用现有技术中已知的那些，只要其能够为病毒生产细胞提供足够的营养成分和能量。

作为本发明的优选方式，所述的培养基是：DMEM高糖培养基，其中以8-10％(v/v)的比例加入牛血清。所述的高糖培养基中，葡萄糖含量是较高的，较佳地在3.0-4.5g/L。

作为本发明的优选方式，培养期间通过灌注法补充培养基。根据培养基中葡萄糖的浓度来没确定灌注的时机。一般当测得培养基中的葡萄糖浓度低于1.5g/L时，开始灌注培养基。灌注加入培养基的同时，还需要在截留细胞的同时排出培养上清(其中包括了一些代谢副产物)。

通过定期取样测定培养基中的葡萄糖含量，来判定病毒生产细胞的生长情况。当测得的病毒生产细胞至：在片状载体上的细胞密度为1×10⁵-5×10⁵个/cm²(如2×10⁵个/cm²)时，在生物反应器中接种猪繁殖与呼吸综合征病毒。

病毒接种及生产

在获得适宜于接种病毒的细胞培养环境后，进行猪繁殖与呼吸综合征病毒的接种。作为本发明的优选方式，接种时的病毒感染复数(MOI值)为0.005-0.5；较佳地为0.01-0.02。所述的“病毒感染复数(multiplicity of infection)”是指每一个细胞上所感染病毒的数量。MOI＝有感染力的病毒量/细胞总量。

病毒接种后，可以感染病毒生产细胞并利用细胞进行繁殖。接种后的一段时间(如24小时)后，可以收获病毒。作为本发明的优选方式，收获病毒的时间是在接种24小时之后，该时段收获的病毒的滴度可达到10^7.4TCID₅₀/mL；更佳地是在接种后70-185小时，该时段收获的病毒的滴度可达到10^12.0TCID₅₀/mL。远远高于现有的一般生产技术下获得的病毒的滴度。

病毒滴度(TCID₅₀)的测定可以根据本领域常规方法进行。比如可以按照韩先杰、王宏伟、王金宝，《猪繁殖与呼吸综合征病毒TCID₅₀的测定》，莱阳农科院学报22(2)：132～134，2005中所报导的方法。

采用本发明的方法生产可获得较纯的病毒液，其中基本上不含有细胞或细胞碎片，且含有很低的血清。该较纯的病毒液可直接用于疫苗的制备。

利用所述的病毒液制备疫苗的方法是本领域技术人员所公知的，通常包括病毒的灭活、乳化。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明人使用片状载体来培养细胞且生产病毒，不同于以往的转瓶培养或以球形微载体培养。所述片状载体可以为细胞生产病毒提供一个良好的生长和生产环境，可获得高浓度的细胞，进而获得高滴度的病毒。

(2)本发明所采用的是固定床篮式搅拌系统，而非其他培养方式如悬浮微载体培养方式。该篮式搅拌系统能够为病毒生产细胞提供良好当生长环境，有利于细胞的生长以及高产病毒。

(3)以往的技术中，在较低的细胞密度(3×10⁶-10×10⁶个细胞/mL)时接种病毒，获得的是含有细胞的病毒液，因此在制备疫苗时候，需要至少冻融一次并进行过滤后才能灭活、乳化，制成疫苗。而本发明是将细胞培养至高密度如1×10⁵-5×10⁵个/cm²后接种病毒，收获的病毒液病毒含量非常高，且基本上不含有细胞碎片，血清和内毒素含量也是非常少，进一步提高了产品质量，不需要进行冻融、也不需要进行过滤，可以直接制备成疫苗。

(4)本发明的方法获得的病毒滴度显著提高，通过本发明的培养方式能够提高5个TCID₅₀/mL。

(5)本发明的方法，在细胞培养过程中不需要使用抗生素，降低了生产成本且提高了安全性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实验设备与材料

试剂

(1)Hyclone DMEM高糖培养基，配方：

干粉培养基溶于5L水，含4mM L-谷氨酰胺，4500mg/L葡糖糖，含110mg/L丙酮酸钠，碳酸氢钠添加量为2g/L。干粉加入5L的注射用水溶解后，0.22微米滤器过滤除菌。

(2)济南劲牛血清，购自济南劲牛生物材料有限公司。

(3)培养基(营养液)：Hyclone DMEM高糖培养基中以8-10％(v/v)的比例加入济南劲牛血清(不含抗生素)。

(4)维持液：Hyclone DMEM高糖培养基中以0.5-1％(v/v)的比例加入济南劲牛血清(不含抗生素)。

(5)0.4％％(w/v)的NaOH。

仪器设备

(1)NBS的C310细胞培养罐(包括加料口、出料口及控制装置)：使用篮式搅拌桨，罐体积14L，工作体积10L。

(2)蠕动泵1个，蠕动泵设1rpm时流量约为4.2L/天。

(3)低温冰柜1个，设置温度为2-8℃。

(4)生物安全柜1个。

(5)转瓶机1个。

(6)显微镜1个。

(7)37℃温室1间。

(8)恒温水浴锅1个。

实验材料

(1)细胞：Marc-145，购自中国动物疫病预防控制中心。

(2)种毒：NADC-JXA1株PRRSV第10代病毒，购自中国动物疫病预防控制中心。

(3)载体：NBS提供的Fibracel^TMDisks，1g＝1200-1500cm²，也就相当于传统方法中1个3L转瓶。

(4)其它：2000mL玻璃瓶、1.5mL离心管、酒精灯、消毒酒精棉球、消毒酒精、消毒液、皮筋、铝箔纸。

实施例1、培养罐清洗、安装与灭菌

采用NBS的C310细胞培养罐：使用篮式搅拌桨(固定床篮式搅拌系统)，罐体积14L，工作体积10L。

将培养罐清洗干净后，加入约450g Fibracel^TMDisks片状载体(相当于传统培养方式中的450个3L转瓶)，再加入10L PBS，安装好罐子上的所有接口，并与主机箱连接，通过启动循环冷却水装置向罐子的夹套中充水至夹套体积的1/3-1/2。再与主机箱断开，稍稍拧松罐子底座上的螺丝，放入高压锅中，121℃灭菌1h后，待其冷却后拧紧罐子底座上的螺丝。将灭菌好的培养罐与主机箱连接，再将0.4％的NaOH瓶与培养罐的补料口管道连接上，渐渐改变参数，至所有参数都稳定，即：80rpm、37℃、PH7.25、DO 60％(体积)。如此运行1-3天，以鉴定培养罐安装是否出错或者灭菌是否彻底。鉴定完后，再抽出罐内所有液体，加入10L的营养液，再次调整参数至稳定。

实施例2、细胞接种与培养

取在转瓶上培养了48h的Marc-145细胞，消化后用营养液稀释至接种瓶中，细胞数量约为3.9×10⁹个。细胞接种至培养罐后，约15min细胞完全贴上载体，且在载体上的细胞密度约为6.7×10³个/cm²。在细胞培养期间，控制培养罐的搅拌速度为80rpm，温度为37℃，PH值为7.25，DO为60％。根据定期取样测定培养基中的葡萄糖含量(取出的样品直接使用常规的葡萄糖浓度测定试剂盒测定其葡萄糖含量)，按每天的葡萄糖消耗量来判定细胞的生长情况，并更改营养液的灌注。

Marc-145细胞接种到培养罐中后，培养96h，细胞数量增加到约2×10⁵个/cm²载体。细胞培养阶段，随着细胞数量的增加，细胞每天的耗糖量也随之增加。当细胞密度达到最大后，葡萄糖消耗量会处于一个稳定期，如果继续培养，葡萄糖消耗量会开始降低。为了保证细胞有足够的营养，当葡萄糖含量低于1.5g/L时，及时进行营养液的灌注，从45h开始以4.2L/d的速度进行营养液的灌流。具体葡萄糖消耗的数值见图1。

实施例3、病毒接种与繁殖

当葡萄糖消耗量达到最高的稳定期时，即细胞密度已达到最大。细胞培养4天后，载体上细胞密度达到2×10⁵个/cm²，接种NADC-JXA1株PRRSV第10代种毒200ml，MOI≈0.014。接毒后24h开始以循环灌流的方式收获病毒液，定期取样检测病毒的TCID₅₀。通过定期取样测定葡萄糖含量，来判定灌注维持液的速度。

病毒TCID₅₀的测定：静置培养Marc-145细胞，制备96孔细胞培养板，根据国家规程要求(参见中华人民共和国兽用生物制品规程)的检测方法来测定病毒样品的TCID₅₀。

从接毒后算起，收获的病毒液分三部分：(1)1-70h，约10L，病毒效价为10^6.0TCID₅₀/mL；(2)70-185h，约35L，病毒效价为10^12.0TCID₅₀/mL；(3)185-353h，约10L，病毒效价小于10^4.8TCID₅₀/mL。其中70-185h收获的病毒液经过无血清培养基稀释倍数试验(结果见表1)，结果表明，稀释50倍后病毒效价仍高于国家标准(10^6.0TCID₅₀/mL)，所以最后可以得到病毒液1770L。具体数值见图2和图3。

收获的病毒液中含有极低量的细胞碎片(肉眼没有看见培养基变浑浊，取出的样品在显微镜下观察没有看到细胞碎片或者其它杂质，只有在培养至280小时时，才能看见培养基稍变浑浊，在显微镜下观察也可以看见少许杂质，50个/mL)，血清含量也是非常少(只有0.01-0.02％)，内毒素也是≤10EU/ml，且不含有抗生素。可见本发明的方法进一步提高了产品质量。

表1、病毒液稀释试验

实施例4、清洗消毒

收获罐中所有病毒液后，将培养罐与收获桶、NaOH桶、主机箱断开，逐一拆下罐上连接的所有零件。

打开培养罐顶板，取出载体，先用清水冲洗掉载体上的培养液，再加少量的碱煮沸30min以去除载体上未脱落的细胞，再用纯水清洗3-5遍以去除碱性，使其与水的PH相当，将清洗干净的载体放入篮筐中37℃烘干，备用。

罐体、管道和其它用品先用清水冲洗，再用消毒水浸泡消毒，最后用纯水清洗干净。

讨论

使用传统的转瓶式培养方法时，若要收获跟我们的实验同样多的病毒液，就需要分多批培养，要投入较多的人力，仅这许多转瓶的清洗消毒就需要浪费较多的时间、人力、物力等。细胞传代和培养时使用的培养基、PBS和胰酶等相对要多很多，而且细胞传代和病毒接种过程中极容易造成污染。病毒的回收率低且纯度低，传统的培养方法收获的病毒液中是没有去掉细胞碎片的，血清和内毒素含量较高，且含有抗生素，这些对于预防免疫来说很容易使猪发生副反应。另外批次间产品的效价存在差异，疫苗质量不稳定。

相对地，在本发明中使用的生物反应器装有固定的篮筐，采用灌流式操作，它具有以下几个优点：

(1)细胞稳定的处在较好的营养环境中，有害代谢废物浓度积累较低；

(2)反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，病毒回收率高；

(3)病毒在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，有利于保持病毒的活性；

(4)收集的病毒液中没有或者含有极少的细胞碎片；

(5)维持液中血清比例从传统方式中的2％降到了0.5-1％，不仅节约了血清，降低了成本，而且减少了牛血清带来的外源性蛋白，避免了免疫时猪群产生副反应；

(6)内毒素含量低，≤10EU/ml。这是由于控制了配制溶液用水的质量，减少了转瓶的数量，且只收获了病毒液上清等一系列因素，且使用的聚酯纤维片也通过了内毒素的测试，极大的减少了内毒素产生的可能性；

(7)病毒液中不含抗生素；

(8)生物反应器占用的空间小，且要求的环境级别不高，减少了转瓶的使用和对于公用设施的依赖。

另外病毒液经过50倍稀释后，效价仍远远高于国家标准，这样不仅提高了产量，减少人力物力的投入，降低了疫苗生产的成本，而且降低了病毒液中的血清和内毒素的含量，大大提高了疫苗的质量，进一步保证了疫苗的安全性。

由此可见，本发明应用生物反应器培养Marc-145细胞繁殖PRRSV，效果明显优于传统转瓶培养方法。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。