一种利用短密青霉高效累积生产霉酚酸的方法

摘要

本发明涉及一种利用短密青霉高效累积生产霉酚酸的方法，将短密青霉按2wt％含量接种到PDA斜面上，控制温度为28℃，活化培养72h，然后将活化后的短密青霉接种在发酵罐中，采用优化后的葡萄糖-甘氨酸液体培养基进行发酵培养，控制温度为28℃，发酵得到霉酚酸。与现有技术相比，本发明发酵周期在240小时以内，最高产量可达5.0g/L，比分批发酵提高约30％。这种优化碳氮比补料流加分段调控pH反馈补料发酵策略控制简单、霉酚酸产量较高，具有较大的工业化应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产霉酚酸的方法，尤其是涉及一种利用短密青霉高效累积生产霉酚酸的方法。

背景技术

霉酚酸(myhophenoilc acid，MPA)为短密青霉(Penicillium brevicompactum)产生的抗真菌、抗肿瘤并具免疫抑制作用的抗生素。MPA是次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶的可逆性抑制剂，能选择性地抑制淋巴细胞活性，它的2-乙基酯类衍生物——霉酚酸酯(MMF)是新一代免疫抑制剂，在临床器官移植和自身免疫性疾病的治疗方面展示了良好的应用前景。MPA做为合成MMF的前体化合物，提高MPA的工业化水平对于生产企业来说十分重要。

现代抗生素的大规模工业化生产绝大多数都由传统的固体发酵改为液体深层发酵，霉酚酸的生产也是如此。在进行分批液体发酵培养时，人们逐渐发现次级代谢与霉菌生长相关联的这种过程具有广泛的研究战略意义。这种情况常会出现在液体发酵时，研究表明次级代谢与生长营养后期有着重要的联系。Brar(1968)在Clavicepspa spali产生麦角碱的研究中发现了次级代谢的繁殖期模式只有在支持快速繁殖期的培养时才出现，如果培养倾向于限制生长时，次级代谢就是与生长相关联。类似的情况还出现在Fusarium sambucinum产生恩镰抱菌素时，在青霉素发酵时也有类似的结果。在Aspergilluspa rvulus进行napthalenine的摇瓶液体发酵时发现了次级代谢无论生长是否受限都表现为生长相关型。在短密青霉(Penicilliumbrevicompactum)发酵时，发现霉酚酸的产量在贫瘩的或富集的培养基中均表现出与生长相关联。

在液体发酵时，美国专利US 4452891提到，该菌在振荡、27℃条件下培养6天能产生2.4g/L，而在非振荡、27℃条件下培养14d能达到3.6g/L；而H.Ozali进行菌种诱变后，液体发酵水平由1.7g/L提高到5.8g/L。在营养缺陷型菌株提高产量上文献报道0.5％的蛋氨酸会抑制40％霉酚酸的产量，筛选蛋氨酸缺陷的突变株可以将发酵水平提高50％；霉酚酸是一个典型的次级代谢产物，在微生物稳定期开始合成，整个发酵周期为8-13天。目前的文献报道中均采用间歇发酵的方式，徐志南等研究采用将短密青霉的孢子固定在一个旋转纤维床发酵罐(RFB)上分批发酵但是周期较长产量没有得到显著提高，而流加补料发酵方式几乎没有。因此在工业生产上采用流加补料发酵策略的方式有更广泛的应用前景。在发酵过程中，短密青霉的菌丝生长分为球状菌丝和丝状菌丝，在，菌丝的生长与自溶并存，研究文献表明丝状菌丝更有利于霉酚酸的生产。因此发酵过程中如何累计更高的菌体密度，适当的添加霉酚酸合成前体物，并且控制好丝状菌丝的生长与后期的菌丝自溶时机显得尤为重要。合理的补加碳源和氮源能够更好的提高菌体密度，并且后期菌丝生长状况与发酵液pH的调控范围密切相关。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作简单、霉酚酸产量较高的利用短密青霉高效累积生产霉酚酸的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种利用短密青霉高效累积生产霉酚酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

将短密青霉按2wt％含量接种到PDA斜面上，控制温度为28℃，活化培养72h，然后将活化后的短密青霉接种在发酵罐中，采用优化后的葡萄糖-甘氨酸液体培养基进行发酵培养，控制温度为28℃，发酵得到霉酚酸。

所述的PDA斜面组成包括以下组分及含量：蛋白胨2.0g/L、酵母粉1.0g/L、淀粉1.0g/L、葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)10.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH值为6.5。

所述的优化后的葡萄糖-甘氨酸液体培养基包括以下组分及含量：葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)100～150g/L、甘氨酸14～15g/L、磷酸二氢钾2～4g/L、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5～1g/L、蛋氨酸0.5～1g/L，溶剂为蒸馏水，pH值为4.4～4.8。

所述的发酵培养分为发酵初期和发酵中后期两个阶段，发酵初期为发酵达到144小时以上，期间需要向发酵罐中补充葡萄糖及甘氨酸，残留葡萄糖的浓度为20～30g/L，发酵中后期需要向发酵罐中补加葡萄糖-甘氨酸补料培养基，调节发酵罐中的发酵液pH稳定在6.2～6.4。

所述的发酵初期时补加的葡萄糖浓度为400g/L，补料速率为9～13g/L·天，补加的甘氨酸浓度为50g/L，补料速率为1g/L·天。

所述的葡萄糖-甘氨酸补料培养基中葡萄糖浓度为400g/L，蛋氨酸浓度为2.0g/L。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)采用优化发酵初期葡萄糖-甘氨酸补料培养基碳氮比来达到更高的菌体密度；

(2)操作简单，发酵第一阶段开始补料，恒速补入补料液即可；

(3)发酵第二阶段通过补葡萄糖调控pH，有利于快速产生霉酚酸；

(4)霉酚酸产量较高，最高可达5.0g/L，接近于目前国际报道的最高值。本发明为实现霉酚酸的商业化生产提供了一种有效方法。

附图说明

图1为实施例1中产品的发酵曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

斜面PDA培养基培养10天置于4℃冰箱保藏斜面。取斜面种子用30％甘油洗脱孢子形成孢子悬浊液，2％接种到种子摇瓶培养基中(g/L)：蛋白胨2.0，酵母膏1.0，淀粉1.0，葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)10.0，pH 6.5。28℃、转速220r/min条件下培养72小时按接种量10％按培养基体积计接种到7L发酵罐中。发酵初期采用优化的发酵培养基(g/L)：葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)100.0，甘氨酸(C₂H₅NO₂)14.6，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)3.0，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)1.0，蛋氨酸(C₅H₁₁O₂NS)0.5，蒸馏水为溶剂，pH为4.6，其中碳氮源分开灭菌，加入适量泡敌。

控制发酵温度为28℃、溶氧20％以上进行发酵，发酵初期恒速补料，补料培养基配方组成和速率比：葡萄糖400g/L，甘氨酸50g/L，补料碳氮比为11∶1，葡萄糖补料速率11g/L·天，甘氨酸补料速率1g/L·天。发酵初期补料发酵144小时后，残糖(残留葡萄糖)下降到20～30g/L，此时用3mol/L的无菌NaOH溶液将pH值调整到6.4，并开始补料调控pH在6.2～6.4范围内，补料培养基配方组成为：葡萄糖400g/L，蛋氨酸2g/L。继续发酵到240小时放罐。最终霉酚酸产量达到5.0g/L。发酵过程中，其他的发酵参数为：温度28℃、溶氧20％以上，发酵曲线如图1所示，最终得到的霉酚酸产量最高达到5.0g/L，比分批发酵产量提高约30％。

实施例2

斜面PDA培养基培养10天置于4℃冰箱保藏斜面。取斜面种子用30％甘油洗脱孢子形成孢子悬浊液，2％接种到种子摇瓶培养基中(g/L)：蛋白胨2.0，酵母膏1.0，淀粉1.0，葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)10.0，pH 6.5。28℃、转速220r/min条件下培养72小时按接种量10％按培养基体积计接种到7L发酵罐中。发酵初期采用优化的发酵培养基(g/L)：葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)150，甘氨酸(C₂H₅NO₂)14，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)2.0，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5，蛋氨酸(C₅H₁₁O₂NS)1.0，蒸馏水为溶剂，pH为4.4，其中碳氮源分开灭菌，加入适量泡敌。

控制发酵温度为28℃、溶氧20％以上发酵，发酵初期恒速补料，补料培养基配方组成和速率比：葡萄糖400g/L，甘氨酸50g/L，补料碳氮比为9∶1，葡萄糖补料速率9g/L·天，甘氨酸补料速率1g/L·天。发酵初期补料发酵144小时后，残糖(残留葡萄糖)下降到20～30g/L，此时用3mol/L的无菌NaOH溶液将pH值调整到6.4，并开始补料调控pH在6.2～6.4范围内，补料培养基配方组成为：葡萄糖400g/L，蛋氨酸2g/L。继续发酵到240小时放罐。最终霉酚酸产量达到4.4g/L。发酵过程中，其他的发酵参数为：温度28℃、溶氧20％以上。霉酚酸产量最高达到4.4g/L。

实施例3

斜面PDA培养基培养10天置于4℃冰箱保藏斜面。取斜面种子用30％甘油洗脱孢子形成孢子悬浊液，2％接种到种子摇瓶培养基中(g/L)：蛋白胨2.0，酵母膏1.0，淀粉1.0，葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)10.0，pH 6.5。28℃、转速220r/min条件下培养72小时按接种量10％按培养基体积计接种到7L发酵罐中。发酵初期采用优化的发酵培养基(g/L)：葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)100.0，甘氨酸(C₂H₅NO₂)15，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)4.0，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5，蛋氨酸(C₅H₁₁O₂NS)0.5，蒸馏水为溶剂，pH为4.8，其中碳氮源分开灭菌，加入适量泡敌。

控制发酵温度为28℃、溶氧20％以上发酵，发酵初期恒速补料，补料培养基配方组成和速率比：葡萄糖400g/L，甘氨酸50g/L，补料碳氮比为13∶1，葡萄糖补料速率13g/L·天，甘氨酸补料速率1g/L·天。发酵初期补料发酵144小时后，残糖(残留葡萄糖)下降到20～30g/L，此时用3mol/L的无菌NaOH溶液将pH值调整到6.4，并开始补料调控pH在6.2～6.4范围内，补料培养基配方组成为：葡萄糖400g/L，蛋氨酸2g/L。继续发酵到240小时放罐。最终霉酚酸产量达到4.0g/L。发酵过程中，其他的发酵参数为：温度28℃、溶氧20％以上。霉酚酸产量最高达到4.0g/L。