铜绿假单胞菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒

摘要

本发明公开一种铜绿假单胞菌的环介导等温扩增检测引物、检测方法和检测试剂盒。本发明针对铜绿假单胞菌的ecfX基因，设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该检测引物组的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过LAMP的检测方法，对待检测样品进行检测，特别是饮用水，确认是否存在铜绿假单胞菌的特定基因片段，进而确定待检测样品是否存在铜绿假单胞菌的检测方法。本发明的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、特异性强、检测时间短，从样品处理到报告结果整个过程仅需24h，不需要PCR仪和电泳仪，操作过程简单，特别适合基层检测机构和饮用水加工企业自检使用。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的病原菌快速检测技术，特别涉及对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)特定基因ecfX基因的片段具有特异性的检测引物组，将所述检测引物组用环介导等温扩增法LAMP检测铜绿假单胞菌的检测方法和检测试剂盒。

背景技术：

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)又称绿脓杆菌，是一种单生鞭毛，运动活泼，无芽胞，专性需氧的革兰氏阴性杆菌，广泛存在于水、土壤、空气、以及人和动物机体皮肤及肠道中，为饮用水中的主要污染源之一。铜绿假单胞菌可产生多种内外毒素，导致急性肠道疾病和皮肤炎症，此外，因其具有多重耐药能力，在特定条件下，该菌还可引起继发感染或混合感染，引发肺炎、脑膜炎、败血症等，严重时可导致死亡。

近年来，饮用天然矿泉水中铜绿假单胞菌污染情况日渐受到重视，国内外研究者对矿泉水成品水中铜绿假单胞菌污染进行调查，发现成品水中铜绿假单胞菌检出率在1.2％～23.6％之间，并认为加工环节是导致污染发生的主要原因。针对目前饮用水(包括生活饮用水、天然矿泉水、纯净水等)铜绿假单胞菌污染报告明显增加的现状，世界各国都加强了水质卫生管理，美国、加拿大、巴西、日本、欧洲各国及世界卫生组织/粮农组织(WHO/FAO)等，均限定瓶装饮用水(包括天然矿泉水水源)铜绿假单胞菌MPN＜3/L或每250mL中不得检出。我国新修订的《GB8537-2008饮用天然矿泉水》也于2009年10月1日正式实施，其中明确规定粪链球菌、铜绿假单胞菌和产气荚膜梭菌这三种致病菌不得检出，并且要求对每批产品出厂前进行铜绿假单胞菌检测。

目前，在铜绿假单胞菌的检测技术方面，国内外标准中仍沿用传统的理化检测方法，包括涂布法、多试管MPN法、滤膜法等，需要纯培养和生化鉴定等多个步骤，整个检测周期3-5天，灵敏度低，且不能满足现场快速检测的需要，特别是大批量水样的快速检测。

LAMP方法是2000年Notomi等开发的一种新型核酸扩增技术，针对待测靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，在BstDNA聚合酶的作用下，在65℃左右等温条件1h内可以进行特异高效快速的核酸扩增，达到10⁹拷贝，扩增结果可直接观察焦磷酸镁沉淀或者加入显色剂进行判断。LAMP方法与PCR技术相比，检测时间短，具有更高的灵敏性，且操作简单，不需要昂贵仪器，仅仅需要普通水浴锅就可以完成检测。近年来LAMP方法已广泛用于疾病预防和病原检测等方面。

发明内容：

本发明的第一个目的在于提供一种应用环介导等温扩增检测铜绿假单胞菌的检测引物组，该检测引物组对铜绿假单胞菌的ecfX基因具有特异性。

该检测铜绿假单胞菌的检测引物组由下列引物组成：

上游外引物F3(5’-3’)：GGATGAGCGCTTCCGTG；

下游外引物B3(5’-3’)：AAGTTGCGGGCGATCTG；

上游内引物FIP(5’-3’)：CTTGCGCAGGAAGCGCAGC-GTTCCGTCTCGCATGCCTA；

下游内引物BIP(5’-3’)：GCCGACCTCGCCCAGGATA-GCTCGACCGATTGCCG。

本发明的第二个目的是提供一种铜绿假单胞菌的检测方法，其特征在于，以铜绿假单胞菌的ecfX基因为靶基因，通过LAMP方法用上述检测引物组对样品中的菌体的DNA选择性扩增所述的靶基因ecfX的特定片段，确认是否存在有扩增产物。

所述的样品优选为饮用水。

所述的检测方法具体优选为：

(1)样品的制备和模板的提取：将待检样品用铜绿假单胞菌的增菌液增菌培养，提取培养液中菌体的DNA作为模板；

(2)环介导等温扩增LAMP：将扩增反应体系于65℃孵育45～60min，80℃终止反应1～2min；

所述的扩增反应体系包括：1×Thermopol反应缓冲液、1.4-1.8mmol/L dNTP s、4-8mmol/L硫酸镁(MgSO₄)、0.15-0.25μmol/L上游外引物F3、0.15-0.25μmol/L下游外引物B3，1.2-2μmol/L上游内引物FIP、1.2-2μmol/L下游内引物BIP、0.8-1mol/L甜菜碱、0.24-0.32U/μL的Bst DNA聚合酶和适量步骤(1)得到的模板DNA，余量为水；

(3)LAMP反应产物的检测：

利用电泳检测、荧光检测或浊度检测LAMP反应产物是否具有扩增产物。

所述的荧光检测是在反应管中加入SYBR Green I显色剂，1～5min后观察结果，如颜色为橙色，则待检测样品铜绿假单胞菌阴性，如颜色为绿色，则待检测样品铜绿假单胞菌阳性，含有铜绿假单胞菌。

所述的电泳检测是将LAMP反应产物经琼脂糖电泳，如电泳图呈现LAMP特征性阶梯状条带，则待检测样品铜绿假单胞菌阳性，含有铜绿假单胞菌，如电泳图无任何条带则待检测样品为阴性。

所述的浊度检测是用肉眼观察或浊度仪在400nm光下检测浊度，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊则为阳性，含有铜绿假单胞菌，如未见浑浊则为阴性。

10×Thermopol缓冲液为现有技术中的物质，可以从试剂公司购买到，其含有200mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵(NH₄)28O₄、20mmol/L硫酸镁(MgSO₄)和1％曲拉通X-100(TtitonX-100)。

所述的步骤(1)的样品的制备和模板的提取具体优选为：所述的样品为饮用水水样，将水样过截留细菌的滤膜，将滤膜转移到选择性增菌液，36±1℃培养20h，再提取培养液中菌体的DNA作为模板，所述的选择性增菌液为每1000ml LB培养基含有0.2g溴化十六烷基三甲胺和15mg萘啶酮酸。利用该选择性增菌液可以选择的对饮用水样中的铜绿假单胞菌进行增菌，摒弃其他杂菌。更有利于对饮用水样进行检测。

所述的截留细菌的滤膜优选为孔径为0.45μm的滤膜。

本发明的第三个目的是提供一种铜绿假单胞菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒至少包括含有上述上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP和下游内引物BIP的检测引物组的环介导等温扩增反应液以及Bst DNA聚合酶。

所述的铜绿假单胞菌的检测试剂盒优选还包括显色剂：SYBR Green I。

所述的铜绿假单胞菌的检测试剂盒优选还包括选择性增菌液，该选择性增菌液为每1000ml LB培养基含有0.2g溴化十六烷基三甲胺和15mg萘啶酮酸。

ecfX基因是与铜绿假单胞菌毒力因子有关的特异性靶基因，经研究发现，该基因比其他如外膜蛋白基因oprI、oprL和16srRNA具有更高的特异性，因此适用于铜绿假单胞菌的检测，特别适用于水环境中的铜绿假单胞菌的检测。本发明针对铜绿假单胞菌的ecfX基因，设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该检测引物组的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过LAMP的检测方法，对待检测样品进行检测，特别是饮用水，确认是否存在铜绿假单胞菌的特定基因片段，进而确定待检测样品是否存在铜绿假单胞菌的检测方法。本发明的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、特异性强、检测时间短，从样品处理到报告结果整个过程仅需24h，不需要PCR仪和电泳仪，操作过程简单，特别适合基层检测机构和饮用水加工企业自检使用。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

选择性增菌液的配制：

选择性增菌液：每1000ml LB培养基含有0.2g溴化十六烷基三甲胺和15mg萘啶酮酸。

配制方法：

1.萘啶酮酸抑菌剂配制：每10ml水中加入15mg的萘啶酮酸干粉，搅拌振荡溶解，再过0.22μm的膜，过滤除菌，得到萘啶酮酸抑菌剂。

2.选择性增菌液的配制：每1000ml选择性增菌液是这样配制的，称取21g LB培养基干粉和0.2g溴化十六烷基三甲胺，用1000ml的蒸馏水溶解，搅拌加热煮沸充分溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至40℃，无菌条件下，再加入10ml萘啶酮酸抑菌剂，混合均匀，而制得选择性增菌液。

实施例1：桶装水中铜绿假单胞菌的检测

1、水样过滤

取某桶装水水样(1)250mL，无菌操作滤过0.45um滤膜，将滤膜转移到100ml选择性增菌液中培养，36℃±1℃培养20h，得到细菌培养物。

2、细菌DNA的提取

取1mL细菌培养物于12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，加入50μL TE溶液充分悬浮混匀，于100℃水浴10min，冰浴3min，12000r/min离心5min，取上清液备用，该上清液含有细菌的DNA，作为模板DNA。

3、LAMP扩增

在装有23μL环介导等温扩增(LAMP)反应液的反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶(8U/μL)和1μL模板DNA，于恒温水浴锅上65℃孵育60min，80℃终止反应1min，取出反应管。

所述23μL环介导等温扩增(LAMP)反应液组成为：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、4μL 10mmol/LdNTPs、0.5μL 10μmol/L上游外引物F3、0.5μL 10μmol/L下游外引物B3、1μL40μmol/L上游内引物FIP、1μL 40μmol/L下游内引物BIP、1.5μL 100mmol/L MgSO₄、9μL2.5mol/L甜菜碱、3μL灭菌双蒸水ddH₂O。

4、显色剂观察

在反应管中加入1μL显色剂(质量分数为10％的荧光染料SYBR GREEN I)，直接用肉眼观察颜色变化，反应管颜色变为绿色，说明样品中含有铜绿假单胞菌。

应用传统生化鉴定方法(GB8538-2008)对该样品进行检测，检测结果为阳性，样品中含有铜绿假单胞菌，检测结果吻合，证明此方法数据可靠。

实施例2：瓶装水中铜绿假单胞菌检测

本实施例与实施例1基本相同，只是水样为取某瓶装水水样(2)250mL，按照实施例1的操作进行检测。经检测反应管颜色变为橙色，说明样品为铜绿假单胞菌阴性，不含铜绿假单胞菌。

应用传统生化鉴定方法(GB8538-2008)对该样品进行检测，检测结果为阴性，样品中不含有铜绿假单胞菌，检测结果吻合，证明此方法数据可靠。

实施例3：桶装水中铜绿假单胞菌的检测

本实施例与实施例1基本相同，水样也是某桶装水水样(1)，只是步骤(3)中的LAMP扩增中，23μL环介导等温扩增(LAMP)反应液组成为：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、3.5μL 10mmol/LdNTPs、0.375μL 10μmol/L上游外引物F3、0.375μL 10μmol/L下游外引物B3、0.75μL 40μmol/L上游内引物FIP、0.75μL 40μmol/L下游内引物BIP、1μL 100mmol/LMgSO₄、8μL 2.5mol/L甜菜碱、5.75μL灭菌双蒸水ddH₂O。

经检测反应管颜色变为绿色，说明样品中含有铜绿假单胞菌。与实施例1的检测结果吻合。

实施例4：瓶装水中铜绿假单胞菌检测

本实施例与实施例2基本相同，水样也为某瓶装水水样(2)，只是步骤(3)中的LAMP扩增中，23μL环介导等温扩增(LAMP)反应液组成为：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、4.5μL 10mmol/LdNTPs、0.625μL 10μmol/L上游外引物F3、0.625μL 10μmol/L下游外引物B3、1.25μL 40μmol/L上游内引物FIP、1.25μL 40μmol/L下游内引物BIP、2μL 100mmol/L MgSO₄、10μL 2.5mol/L甜菜碱、0.25μL灭菌双蒸水ddH₂O。

且在上述23μL环介导等温扩增(LAMP)反应液的反应管中加入0.75μL Bst DNA聚合酶(8U/μL)和1.25μL模板DNA，于恒温水浴锅上65℃孵育45min，80℃终止反应2min，取出反应管。其他步骤同实施例2。

经检测反应管颜色变为橙色，说明样品为铜绿假单胞菌阴性，不含铜绿假单胞菌。与实施例2的检测结果吻合。

二、特异性和灵敏度检测

1、特异性

收集铜绿假单胞菌20株及非铜绿假单胞菌23株，将这些菌株分别在营养肉汤(副溶血性弧菌在3.5％氯化钠营养肉汤)37℃培养24h后，取1mL菌液，按照实施例1的方法提取各个细菌的DNA，并分别进行LAMP扩增和加入显色剂观察。

其检测结果如表1所示。

表1：试验所用菌株和检测结果

注：+：阳性结果、-：阴性结果；ATCC：美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection)，CMCC：中国普通微生物菌种保藏管理中心(China Microbiological Culture Collection)，GIM：广东微生物研究所(Guangdong Institute ofMicrobiology)，NCTC：英国典型菌种保藏中心(National Collection of Type Cultures)，A.S：中国科学院(Academy of Science)

由表1可以看出，本发明的检测试剂盒和检测方法具有较好的特异性，只有铜绿假单胞菌菌株扩增阳性，其他非铜绿假单胞菌菌株为阴性。

2、灵敏度

以铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853为参考菌株，将其在LB培养基中37℃培养24h后，取1mL菌液，用灭菌生理盐水进行10倍梯度稀释，选取适宜的3个稀释度进行平板计数。取经平板计数细菌数分别为1.57×10⁰cfu/mL、1.57×10¹cfu/mL、1.57×10²cfu/mL、1.57×10³cfu/mL浓度的菌液各1mL，按实施例1中的方法提取细菌DNA，进行LAMP扩增，加入显色剂显色观察，验证本发明的灵敏度。经过3次重复实验，其中2次实验结果灵敏度为1.57×10¹cfu/mL，1次实验结果灵敏度为1.57×10²cfu/mL，因此确定该本发明的检测方法的最低检测限为1.57×10¹cfu/mL～1.57×10²cfu/mL，具有较高的灵敏度。