新型含二茂铁吡唑基的铜、银配合物及用途

摘要

一类新型含二茂铁吡唑基的铜、银配合物，结构式如下：

说明书

一、技术领域

本发明涉及两种具有抗肿瘤活性的有机金属配合物，确切地说是含二茂铁吡唑基的铜、银配合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

二、技术背景

自从1965年美国Rosenbe偶然发现顺铂具有抗癌活性以来，金属配合物的药用性引起了人们的广泛关注，开辟了金属配合物抗癌药物研究的新领域。铂类化合物在治疗某些癌症方面的确取得了一些效果，但是严重的副作用也显示出来，这就促使我们寻找一些新的药物来代替。随着人们对金属配合物的药理作用认识的进一步深入，新的高效、低毒、具有抗癌活性的金属化合物不断被合成出来。经过化学工作者的努力，发现除铂外周期表中还有许多其它金属的化合物都具有抗癌活性，如镓、锗、锡、钌、铑、钒、铬、铜、银、金等金属配合物。实验证明：铜、银配合物都具有抗癌活性。如银(I)、铜(I)的双二磷配合物、反式一二(水杨醛肟)合铜和一些大环配体与铜的配合物对癌细胞都有抑制作用。2009年7月新华社报道，墨西哥国立自治大学(UNAM)化学系科学家研制出以金属为基础的新药.并已通过实验室和活体证明这些药具有良好的抗癌效果。这种新药取名为“Casiopeina″。它也是一种铜配位化合物。

另外，配体的性质与抗肿瘤活性也有密切关系。申请人合成了具有生物活性的配体3-三氟甲基-5-二茂铁吡唑乙酸，其主要设计思想是选择具有芳香性、热稳定性、低毒性及特殊生理(物)活性的二茂铁基作为主体，并与具有广泛生物活性的杂环吡唑基结合，从而达到提高化合物生物活性，降低其毒性的目的。并且配体中还引入了可以提高化合物的亲酯性和对生物体膜的渗透性的三氟甲基，这更有利于增加化合物的生物活性。

申请人选择3-三氟甲基-5-二茂铁吡唑乙酸(LCOOH)作为第一配体，引入含磷的具有一定生物活性的双二苯基膦甲烷作为第二配体，合成了含二茂铁吡唑基的铜、银配合物。并对其进行活性筛选，期望筛选出高效、低毒的非铂类抗肿瘤药物。

申请人对本申请的主题进行了如下的文献检索：

1、http://www.google.com网检索结果：(2010/1/12)

2、中国期刊网检索结果：

全文-二茂铁吡唑金属配合物无相关文献。

全文-抗肿瘤活性二茂铁吡唑金属配合物无相关文献。

三、发明内容

本发明的目的在于提供具有抗肿瘤活性的金属配合物，所要解决的技术问题是遴选配体并确认该金属配合物的抗肿瘤活性。

本发明选择具有生物活性的3-三氟甲基-5-二茂铁吡唑乙酸作为配体，分别与前驱体[Cu₂(dppm)₂(NO₃)₂]和[Ag₂(dppm)₂(NO₃)₂]组装合成含二茂铁吡唑基的有机金属配合物。并对其进行抗肿瘤活性筛选。所述的前驱体由双二苯基膦甲烷分别与硝酸铜、硝酸银制备得到的并记为[Cu₂(dppm)₂(NO₃)₂]和[Ag₂(dppm)₂(NO₃)₂]。

3-三氟甲基-5-二茂铁吡唑乙酸有以下化学式：

在以下的叙述中为方便表述，记作：LCOOH。

本发明所称的一类新型含二茂铁吡唑基的铜、银配合物，结构式如下：

式中：

在以下的叙述中为方便表述：a、b分别记为：[Cu₃(dppm)₃O(OOCL)]和[Ag₂(dppm)₂(OOCL)₂]

申请人对上述两种金属配合物进行了体外抗肿瘤活性研究，确认两者均具有抗肿瘤的生物活性，也就是说上述两种金属配合物的用途就是在制备抗肿瘤药物中的应用，具体地说就是在制备抗肺癌或抗肝癌或抗黑色素瘤药物中的应用。

本发明具有以下的特点：

a.申请人选取了3-三氟甲基-5-二茂铁吡唑乙酸作为第一配体，不仅为组装金属配合物提供了有利的条件，而且引入了毒性低，生物活性好的有机基团，从而达到提高配合物的生物活性(见表1)。

b.申请人尝试引入含磷的具有一定生物活性的双二苯基膦甲烷作为第二配体，使得抗癌药物的研究向更宽广的领域发展。

c.本合成采用的原料便宜易得，成本低。而且，毒性低，环境友好。

四、附图说明

图1是配合物[Cu₃(dppm)₃O(OOCL)]的晶体结构图。

图2是配合物[Ag₂(dppm)₂(OOCL)₂]的晶体结构图。

五、具体实施方式

通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。

一.新型含二茂铁吡唑基的金属配合物的原料合成

(1)配体[3-三氟甲基-5-二茂铁吡唑乙酸(LCOOH)]的合成

称取5-二茂铁基-3-三氟甲基吡唑S(6.40g，0.02mol)溶解在乙腈中，再称取t-BuOK(3.36g，0.03mol)加入到上述溶液中，60℃加热2h后，将BrCH₂COOC₂H₅(6.68g，0.04mol)逐滴滴入烧瓶中，滴完后反应进行4～5h，TLC检测知反应基本结束。减压蒸出乙腈，加水升温回流使产物水解，1.5h后结束反应，取出混合物，冰浴下向上述混合物中滴加稀HCl(1M)调节溶液的pH至弱酸性(pH＝5～6)。用乙酸乙酯反复萃取，保留乙酸乙酯层，用无水MgS0₄干燥过夜，过滤。蒸出乙酸乙酯，得黄色油状物，通过柱层析分离。得到纯品3.40g，产率45％，MS：(EI，70eV)：MS：(EI)：M/z＝378.02[M⁺].Anal.Calc for C₁₅H₁₃O₂N₂F₃Fe：C 47.70，H3.39，N 7.38％；Found：C 47.62，H 3.44，N 7.41％.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝4.293(s，5H)，4.490(s，4H)，5.086(s，2H)，6.512(s，1H)

(2)前躯体[Cu₂(dppm)₂(NO₃)₂]的制备

在250mL烧瓶中加入0.94g(5mmol)的硝酸铜用100mL的乙腈溶解，加入0.32g(5mmol)铜粉，在氮气保护下加热回流，溶液从绿色变成无色，趁热过滤，得到无色溶液，再向溶液中加入双(二苯膦基)甲烷3.84g(10mmol)，加热回流30min，蒸出部分溶剂，得到无色沉淀，过滤干燥称量3.55g，产率75％。Anal.Calcd.for C₅₀H₄₄N₂O₆P₄Cu₂：C 58.88，H 4.35，N 2.75；Found：C 58.10，H 4.103，N 2.902(％).

IR(KBr，cm^-1)：3025(m)，1484(m)，1436(s)，1398(s)，1307m)，1098(m)，1027(w)，787(m)，739(s)，694(s)，515(s)，475(s).

(3)前躯体[Ag₂(dppm)₂(NO₃)₂]的制备

在500mL烧瓶中加入硝酸银1.70g(10mmol)和双(二苯膦基)甲烷3.84g(10mmol)，用200mL甲醇溶解，在氮气保护下回流30min，蒸出大部分的溶剂，得到淡黄色的微晶沉淀，粗产物最后用甲醇重结晶得到大块的无色透明晶。干燥称量3.78g，产率80％.Anal.Calcd.forC₅₀H₄₄N₂O₆P₄Ag₂：C 54.17，H 4.00，N 2.53；Found：C 54.10，H 4.112，N 2.701(％).IR(KBr，cm^-1)：3447(w)，3055(m)，1573(w)，1482(s)，1435(m)，1410(m)，1185(m)，1158(m)，1097(s)，1030(s)，997(s)，781(m)，756(m)，737(s)，718(m)，696(s).

2.金属配合物的合成

(1)[Cu₃(dppm)₃O(OOCL)]的合成

向50mL烧瓶中加入LCOOH(0.0756g，0.2mmol)，用少许甲醇至刚好溶解，逐滴加入1MNaOH调节pH值在8左右，得淡黄色滤液。称取[Cu₂(dppm)₂(NO₃)₂](0.2mmol，0.2042g)加到上述溶液中，升温至80℃回流3h，冷却过滤，静置析出黄色晶体。Anal.Calcd.forC₉₁H₇₈N₂O₂F₃P₆FeCu₃：C 63.51，H 4.57，N 1.63；Found：C 63.40，H 4.533，N 1.713(％).

(2)[Ag₂(dppm)₂(OOCL)₂]的合成

向50mL烧瓶中加入LCOOH(0.1512g，0.4mmol)，用少许甲醇至刚好溶解，逐滴加入1M NaOH调节pH值在8左右，得淡黄色滤液。再称取[Ag₂(dppm)₂(NO₃)₂](0.2mmol，0.2212g)加到上述溶液中，升温至80℃回流3h，在烧瓶中有沉淀析出，得淡黄色粉末。用甲醇溶解，避光静置，一星期后析出黄色晶体。Anal.Calcd.for C₈₂H₆₈N₄O₄F₆P₄Fe₂Ag₂：C 56.64，H 3.94，N 3.22；Found：C 56.63，H 3.866，N 3.114(％).

二.新型含二茂铁吡唑基金属配合物的体外抗肿瘤活性研究

采用MTT[3-(4，5)-双甲基-2-噻唑-(2，5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定类衍生物对人肺癌细胞(A549)，人肝癌细胞(HepG2)和小鼠黑色素瘤(B16-F10)的最低抑菌浓度(minimalinhibitory concentration，MIC)。

(1)培养液(每升)的配制：①悬浮细胞：RPMI-1640培养粉一袋(10.4g)，新生牛血清100mL，青霉素溶液(20万U/mL)0.5mL，链霉素溶液(20万U/mL)0.5mL，加三蒸水溶解后，用5.6％的NaHCO₃溶液调pH值至7.2-7.4，最后定容至1000mL。过滤灭菌。②贴壁细胞：同上，再加入NaHCO₃2.00g，HEPES 2.38g。

(2)D-Hanks缓冲液(每升)的配制：NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.06g，KH₂PO₄ 0.06g，NaHCO₃ 0.35g。高压灭菌。

(3)胰蛋白酶液的配制：利用D-Hanks缓冲液配成浓度为0.5％胰蛋白酶液。过滤除菌。

(4)实验药液的配制：将测试样品用少量的三蒸水溶解配成储备液，一般按实验最高浓度的10倍配制储备液。根据化合物溶解性不同，可用三蒸水直接溶解，或用少量DMSO助 溶，再加三蒸水溶解。DMSO在培养液中的浓度不宜过大，加药后的每孔细胞悬液中DMSO的终浓度一般不超过0.05％-0.1％。储备液保存于-20℃冰箱中备用。

(5)人肺癌细胞(A549)的培养：为贴壁生长细胞，常规培养于RPMI-1640培养液内(含10％小牛血清、100U/ml链霉素)，置37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔3-4天传代一次。传代时先弃去原培养液，再用D-Hanks缓冲液洗涤；然后用0.5％胰蛋白酶消化30秒左右，加入少量新鲜培养液终止消化；吹打，使贴壁细胞从培养瓶壁上脱落下来；移取适量至新鲜培养瓶中，再补充新鲜培养液至原体积(培养液体积约为培养瓶容量的1/10)。

(6)人肝癌细胞(HepG2)的培养：为悬浮生长细胞，常规培养于RPMI-1640培养液内(含10％小牛血清、100U/mL链霉素)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔3-4天传代一次。传代时将原瓶中培养液转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃去原培养液，加入等量新鲜培养液，吹打均匀，移取适量至新鲜培养瓶中，再补充新鲜培养液至原体积(培养液体积约为培养瓶容量的1/10)。

(7)小鼠黑色素瘤(B16-F10)的培养：与人肝癌细胞(HepG2)的培养方法相同。

(8)细胞孵育：取对数生长期的3种肿瘤细胞，调细胞悬液浓度为1-1.5×10⁵个mL^-1。在96孔培养板中每孔加细胞悬液100μL，置37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。培养24h后，分别按设计加入药液。

(9)加药：将测试药液按照最终浓度的浓度梯度分别加入到各个孔中，每个浓度设6个平行孔。实验分为药物试验组(分别加入不同浓度的测试药)、对照组(只加培养液和细胞，不加测试药)和空白组(只加培养液，不加细胞和测试药)。将加药后的96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。阳性对照药物(五氟脲嘧啶、顺铂)的活性按照测试样品的方法测定。

(10)存活细胞的测定：在培养了48h后的96孔板中，每孔加MTT 40μL(用D-Hanks缓冲液配成4mg/ml)。在37℃放置4h后，移去上清液。每孔加150μLDMSO，振荡5min，使formazan结晶溶解。最后，利用自动酶标仪在570nm波长处检测各孔的光密度(OD值)。

抑制率的计算：细胞生长的抑制率按照下列公式计算：

生长抑制率＝(1-存活率)×100％＝[1-(OD_实验-OD_空白)/(OD_对照-OD_空白)]×100％(OD_实验表示测试药物组的平均光密度，OD_对照表示对照组的平均光密度，OD_空白表示对照组的平均光密度)。

半数抑制浓度(IC₅₀)定义为当50％的肿瘤细胞存活时的药物浓度。根据测定的光密度(OD值)，制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。

测得的IC₅₀见表1所示

表1本发明所列部分含二茂铁吡唑基金属配合物对肿瘤细胞的抑制IC₅₀值(μg/mL)

由此可见，这两种新型含二茂铁吡唑基的金属配合物对人肺癌细胞(A549)，人肝癌细胞(HepG2)和小鼠黑色素瘤(B16-F10)有明显的抑制作用，因此本发明的新型含二茂铁吡唑基的金属配合物有望在制备抗肿瘤药物中应用。