胶原靶向治疗增生性瘢痕蛋白药物的制备及应用

摘要

本发明属基因工程领域，涉及靶向hIL-10的重组蛋白及其应用。本发明重组蛋白是由人白细胞介素10（humaninterlenkin10,hIL-10）与胶原特异结合的CBD多肽在基因水平融合后表达的重组蛋白，重组后形成了一种新的蛋白。该蛋白具有与hIL-10同样的抗病毒、抗肿瘤以及机体免疫功能的活性；更为重要的是CBD-IL-10在伤口愈合过程中能够与胶原特异靶向结合，作为治疗增生性瘢痕及瘢痕疙瘩疾病药物的应用中，可预防抑制瘢痕的形成。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及免疫学领域的机体免疫功能调节及基因的重组表达技术领域的人白细胞介素10（human interlenkin 10, hIL-10）与胶原特异结合的CBD多肽在基因水平融合后所表达的重组蛋白及其该重组蛋白应用。

背景技术

皮肤损伤愈合后，瘢痕仍继续增殖，即可发展成增生性瘢痕。增生性瘢痕突出皮面，形状不规则，高低不平，潮红充血，质地实韧。有灼痛和瘙痒感，于环境温度增高，情绪激动，或进食辛辣刺激性食物时症状加剧。增生往往延续几月或几年后才逐渐发生退行性变化，表现为突起高度减低，颜色转暗，充血消退,变软。有些最终可以平复，痛痒症状也大为减轻或消失。增生瘢痕，好发于损伤深度仅及真皮的创伤，如深2度烧伤和切取厚的中厚度片的供皮区创面等，偶尔亦见于较深的创伤和手术切口。

增生瘢痕与正常瘢痕的病理组织差别，仅在于瘢痕深部胶原纤维的增厚，排列不规则，或呈旋涡形，或缠绕成绳索状。究其形成原因，是因为瘢痕组织中胶原蛋白过度沉积，胶原蛋白的合成代谢超常持续进行，超过分解代谢的速度，在相当长的时间内，大量形成胶原纤维最终形成增生瘢痕。

基因工程是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。1989年Fiorentino等发现小鼠Th2细胞株产生一种新的细胞因子，能抑制Th1细胞株细胞因子mRNA的转录，称为细胞因子合成抑制因子（cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF），同年命名为白细胞介素10（interlenkin 10，IL-10）。人成熟IL-10分子为160氨基酸残基，分子量18.7kDa，pI8.1。白细胞介素10（IL-10）是人体多种细胞产生的重要免疫调节细胞因子，具有广泛的生物学活性，包括免疫抑制、抗炎及免疫调节特性，主要生物学功能是限制和终止炎症反应，调节多种免疫细胞的分化和增殖，同时也具有调理免疫刺激的特性，清除感染和非感染的颗粒。体内外和动物实验表明IL-1在炎症、恶变和自身免疫性疾病方面都发挥了重要功能，在临床上应用于治疗急、慢性炎症疾病、自身免疫性疾病如炎性肠炎、类风湿性关节炎、克隆病、多发性硬化症、银屑病等。

但针对增生性瘢痕，目前还没有有效的解决方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胶原靶向hIL-10重组蛋白（简称CBD-IL-10）及其临床应用，该重组蛋白既保持了hIL-10的生物学活性，又增加了hIL-10在体内的靶向性，不仅赋予了该蛋白具有与hIL-10同样的抗病毒、抗肿瘤以及机体免疫功能的活性，更为重要的是其在伤口愈合过程中能够与胶原特异靶向结合，从而预防抑制瘢痕的形成。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：胶原靶向治疗增生性瘢痕蛋白药物的制备中所采用的一种靶向CBD-IL-10重组蛋白，其氨基酸序列如下所示：

H₂N->

其中：H₂N-’代表蛋白质氨基端（N末端），‘-COOH’ 代表蛋白质羧基端（C末端）。

上述靶向hIL-10重组蛋白在作为治疗增生性瘢痕及瘢痕疙瘩疾病药物的应用。

瘢痕组织中胶原蛋白过度沉积，而CBD多肽（TKKTLRT，7肽）能够特异性结合胶原蛋白，是胶原蛋白特异性结合的多肽序列。将胶原蛋白特异结合的CBD导向肽与IL-10融合表达，既可以降低用药剂量及治疗成本，减轻用药带来的毒副作用；同时更为重要的是在体内能够使IL-10药物“靶向”到达体内作用部位而有效发挥药理作用。本发明与现有技术相比，本发明通过基因工程手段把hIL-10与胶原特异结合的CBD多肽在基因水平融合后表达的重组蛋白，重组后形成了一种新的蛋白（CBD-IL-10），并且赋予了该蛋白具有与hIL-10同样的抗病毒、抗肿瘤以及机体免疫功能的活性；更为重要的是CBD-IL-10在伤口愈合过程中能够与胶原蛋白特异靶向结合，从而预防抑制瘢痕的形成。

附图说明

图1是IL-10 氨基酸序列序列表。

图2是靶向CBD-IL-10的重组蛋白氨基酸序列表。

具体实施方式

本发明通过基因工程手段把hIL-10与胶原特异结合的CBD多肽在基因水平融合后表达的重组蛋白（CBD-IL-10）。所述的hIL-10，其氨基酸序列如下：

H₂N-Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Lys Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Gln-COOH；

所述胶原特异结合的CBD导向肽，其氨基酸序列如下：

H₂N-Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr-COOH，‘H₂N-’代表蛋白质氨基端（N末端），‘-COOH’ 代表蛋白质羧基端（C末端）；hIL-10和CBD导向肽之间通过引入Gly Gly Gly Gly Ser柔性Linker连接，蛋白表达之后不会影响各自的结构和功能。

融合后的靶向CBD-IL-10的氨基酸序列如下：

H₂N-Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Lys Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Gln Gly Gly Gly Gly Ser Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr-COOH，‘H₂N-’代表蛋白质氨基端（N末端），‘-COOH’ 代表蛋白质羧基端（C末端）。

实施例1：CBD-IL-10的表达、纯化及生物学活性测定

（一）CBD-IL-10基因的获得

1. 总RNA的提取

人外周血经淋巴细胞分离液分离单个核细胞, PBS洗涤2次，重悬于10% RPMI 1640培养液，加入终浓度为10g/L的ConA，置5% CO2培养箱，37℃培养48h，收集细胞。参照RNA抽提试剂盒的方法，抽提总RNA，-80℃保存备用。

2. 总RNA的提取及IL-10 cDNA的扩增

用Takara公司RNA提取及反转试剂盒，按说明抽提总RNA，进行RT- PCR反应：总RNA 500ng，5×逆转录Buffer2μl，oligo dT 0.5μl，6 mer 0.5μl，AMV逆转录酶0.5μl，DEPC水加至10μl。37℃温育30min，后85℃温育3 min，得到细胞cDNA。

（二）载体的构建、表达及其鉴定

1. pMD18-T克隆载体的构建

按大肠杆菌惯用密码子设计CBD基因序列、引物及相应的酶切位点以及linker(G₄S)，合成如下2条引物F1 、F2。

CBD导向肽氨基酸序列如下：H2N-Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr-COOH；

CBD基因序列：5’accaaaaaaacccttcgcacc3’；

F1: 5’catatgagcccaggccagggcacccagtctgagaacag3’；

F2:5’gtcgactcaggtgcgaagggtttttttggtagaaccaccaccaccgtttcgtatcttcattgtcatgtag3’；

以F1、F2为引物，以cDNA为模板，随之按95℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环后72℃进行延伸12min，得到PCR产物，产物回收连入pMD18-T载体，进行酶切鉴定和序列测定，得到pMD18T-IL10-CBD重组克隆载体。

2. pET-IL10-CBD表达载体的构建

测序正确的pMD18T-IL10-CBD重组克隆载体及原核pET-22b(+)表达载体，分别经NdeI /SalI双酶切，回收目的片段进行连接，连接产物转化BL21(DE3)，挑取克隆，同样回收质粒，酶切鉴定，进一步经测序鉴定，构建成pET-IL10-CBD表达载体的工程菌。

3．CBD-IL-10重组蛋白在大肠杆菌中的表达

上述工程菌pET-IL10-CBD/BL21接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日以2% 的接种量接种到同样的培养基中，继续在37℃振荡培养至对数生长中期、培养液光密度OD₆₀₀为0.5~0.6时，加入IPTG继续培养4~5 hr诱导表达，离心收集菌体。

4、CBD-IL-10蛋白表达的检测及鉴定

将诱导表达的菌体培养物离心，收集菌体，采用12 %的SDS-PAGE电泳分析表达产物，IPTG诱导者与未诱导者相比，在分子量相应处有一条明显的深染新生蛋白带，蛋白表达量占菌体总蛋白的40%，与预计融合蛋白的分子量大小相符。将蛋白从凝胶电转移至PVDF膜上，常规Western blot分析，ECL发光，可见一明显显色带，分子量一致。未诱导菌株，标准蛋白及表达菌中其它条带无阳性反应。

（三）基因工程菌的培养及高密度发酵

1. 一级种子的制备

挑选LB(含氨苄青霉素 )平板上的单菌落接种于10ml LB（含氨苄青霉素）液体培养基中，37℃ 200 rpm振荡培养过夜。

2. 发酵种子液的培养

把一级种子按2%的接种量接种于适量的改良的LB液体培养基(含氨苄青霉素 )中，同样条件下培养菌体的密度至OD₆₀₀为1.5-2左右。

3、基因工程菌的高密度发酵

按5%的接种量把发酵种子液接种于含蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、硫酸铵、硫酸镁、磷酸盐、甘氨酸和甘油等为主要成分的复合培养基中，搅拌速度为100-800rpm, 溶氧控制在20-40%，温度为37℃条件下，补料流加至OD₆₀₀约为30时，加入终浓度为1mmol∕L的IPTG，再发酵4hr离心收集菌体。

（四）CBD-IL-10融合蛋白的纯化

1. 融合蛋白的粗提

取诱导表达的菌体30g，用150mL 20mmol/L pH6.8的PB (1.5ml1mol/LMgCl_2、3.5mgDNase，适量EDTA)细胞破碎仪破碎细胞，4℃搅拌裂解3hr。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测发现表达的融合蛋白存在于上清和沉淀中，说明诱导表达的重组蛋白是以可溶性及包涵体形式存在的。4℃ 12000rpm离心15min，收集上清，装入透析袋，用pH6.8的10mmol/L的PB透析24-36hr，换液2-3次，离心收集上清液。

2．包涵体的溶解及复性

裂菌沉淀IL-10包涵体经洗涤、尿素溶解，于4℃在复性缓冲液的逐渐稀释下缓慢复性。

3、融合蛋白的纯化

取阳离子交换基质SP-Sepharose Fast Flow装柱，柱体积5.4×20cm，用10mmol/L pH6.8的PB平衡，上样后用含0.5 mol/L NaCl的10mmol/L pH6.0的PB线性梯度洗脱，收集主峰即得到融合蛋白。即为CBD-IL-10，氨基酸序列如图2所示。

（五）CBD-IL-10的生物活性测定

MC/9细胞来源于小鼠的肥大细胞，在小鼠IL-4或IL-3以及小鼠IL-10或人IL-10的协同刺激下生长繁殖，且细胞数量随着IL-10浓度的增加而增长，具体如下：

给100μl MC/9细胞 (2×10⁴细胞/ml) 加入小鼠IL-4 20 U、人IL-10标准品2 U或表达的CBD-IL-10，37℃，5%CO2孵箱培养72hr，台盼蓝染色，血细胞计数板计数MC/9活细胞数。根据细胞数量计算IL-10的活性单位，与对照组mIL-4、阴性上清液比较差异均无显著意义(p>0.05)，而IL-10标准品和表达的CBD-IL-10均能刺激MC/9细胞的增殖，细胞数量与单抗中和组、阴性对照组比较差异均有显著意义(p<0.05)。因此，大肠杆菌表达的可溶性和包涵体复性的IL-10均具有生物学活性。经ELISA定量检测及MC/9细胞的活性分析，粗制品的可溶性和包涵体复性IL-10的比活性分别为1.02×10⁴U/mg和4.1×10²U/mg。

实施例2：CBD-IL-10抑制瘢痕增生试验

（一）增生性瘢痕组织  

烧伤愈合后3个月的前臂增生性瘢痕组织 (病理证实)，红色、硬，高出正常皮肤约4~7 mm。应用BALA/c-nu雄性小鼠30只，6~8周龄，体重18~20g。

（二）烧伤后增生性瘢痕的动物模型的制备  

去除增生性瘢痕下脂肪组织，将瘢痕切成6mm×5mm×3mm大小组织块，置于预冷DMEM (含青霉素、链霉素双抗各100 U/ml)的培养液中，无菌条件下在裸鼠肩胛皮肤作一小切口，将瘢痕组织小块移植在皮下，不予缝合。在3 h内完成30只动物模型。观察动物模型有无感染、排斥反应，选择稳定的瘢痕模型作为治疗动物使用。瘢痕模型建立20d，此时增生性瘢痕血液循环建立，瘢痕稳定。

（三）实验动物分组　

实验分为对照组、hIL-10标准组及CBD-IL-10大剂量治疗组、中剂量治疗组、小剂量治疗组，裸鼠数目每组分别为6只，采用瘢痕内注射的方法，IL-10为10μg /ml/次，CBD-IL-10分别为5、10和20μg /ml/次，200μl/次，3次/周，总共治疗3周；对照组每次仅给以PBS，其余相同。停药3d后取材，用游标卡尺直接测量瘢痕最大径a和最小径b换算成瘢痕体积，公式为V=ab²/2。与对照组相比，IL-10及CBD-IL-10个治疗组，均能明显抑制瘢痕的生长（如表1. p<0.05）。

表1治疗前后瘢痕体积变化(mm³)

组别移植前治疗3周后对照组90.0±0.570.0±3.1 hIL-1090.0±0.449.2±4.3*CBD-IL-10低剂量组90.0±0.549.5±5.8*CBD-IL-10中剂量组90.0±0.638.2±7.1^#CBD-IL-10高剂量组90.0±0.336.5±5.6^#

*p<0.05，^#p<0.01 vs 对照组

（四）亚微及超微结构观察  

HE、Masson染色后，光镜下各组瘢痕组织外周均有一层纤维结缔组织包膜包绕。对照组的瘢痕组织内有大量成纤维细胞样细胞，贴近包膜处有血管存在，胶原纤维粗大，漩涡状排列。各治疗组瘢痕组织内成纤维样细胞少见，胶原稀疏，排列较整齐，中、大剂量治疗组尤其显著。

亚微结构特点：对照组成纤维细胞细胞器丰富，粗面内质网显著扩张，间质可见粗大胶原纤维束，呈漩涡状、结节状排列；有较多的毛细血管，血管内皮细胞生长旺盛，突出于血管腔，使血管腔呈部分闭塞状。各治疗组表现为: 较多坏死、凋亡的成纤维细胞；部分成纤维细胞及血管内皮细胞则表现为空泡变性，部分成纤维细胞体积较小，粗面内质网不扩张，核浆比增大，呈现为典型纤维细胞的特点；间质胶原束较稀疏，排列较整齐。

实施例3：胶原特异性结合鉴定

利用ELISA鉴定：鼠尾酸溶胶原中和后，加入到0.1mg/孔的96孔板中，4℃过夜，PBST洗涤3次，每孔加入200ul 0.25%的BSA室温下封闭2小时。同样TBST洗涤3次，相应孔中加入0.157-10 uM的CBD-IL-10各3个平行孔，对照组加入相同浓度的IL-10，37℃孵育1小时，PBS洗涤3次。加入50 ul鼠抗IL-10单克隆抗体（1：1000稀释）室温孵育1小时, 同上洗涤3次，加入100 ul碱性磷酸标记的山羊抗鼠抗体（1：10000稀释），室温孵育1小时，同上洗涤3次。每孔加入100 ul 2mg/ml的磷酸硝基苯（p-NPP）室温10分钟，每孔加入100 ul 0.2M的NaOH终止反应。每孔取100 ul 转入另一96孔板中，405nm酶标仪读数，结果统计分析表明，CBD-IL-10组具有显著的胶原结合特异性（表2）

。

<211>173

<212> PRT

<213> 人工序列

<173> Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Lys Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Gln Gly Gly Gly Gly Ser Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr。