一种防治桃红颈天牛的大型真菌杀虫剂

摘要

一种防治桃红颈天牛的大型真菌杀虫剂，其组分及含量为：40%褐鳞环柄菇毒肽类毒素粗品，35%条纹毒鹅膏菌毒肽类毒素粗品和25%10目的菌糠粉。其制备方法为：1、大型真菌的筛选；2、摇床液体深层发酵；3、超声破碎、冷冻离心处理发酵液；4、毒肽类毒素粗品的提取；5、载体的选择与处理；6、成型。本发明对防治桃红颈天牛具有致死率高、选择性强、药效时间长和耐高温的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物农药，特别是涉及一种防治园林蛀干害虫桃红颈天牛的微生物源大型真菌杀虫剂及其制备方法。

背景技术

桃红颈天牛是一类危害性十分严重的蛀干害虫，它的危害主要是幼虫蛀蚀桃树、杏树和樱桃等核果类树干，在木质部形成弯曲的隧道，破坏韧皮部和木质部，造成树皮脱落、树势衰弱、枝干易折，常引起整株树枯死，是公认的、最难防治的害虫。

目前用于防治桃红颈天牛的微生物源真菌杀虫剂主要是白僵菌杀虫剂，此杀虫剂是由白僵菌孢子粉制成的活菌制剂，作用机理是白僵菌的活孢子侵入桃红颈天牛幼虫体内后形成大量菌丝并产生生物毒素使昆虫死亡。此杀虫剂具有易降解、无药物残留、不杀害虫的天敌、害虫不产生抗药性等优点，但是存在以下不足：1、致死率不高，幼虫死亡率低，仅为22.6%；2、对桃红颈天牛的幼虫毒杀选择性差，而对菜青虫和松毛虫针对性强；3、药效时间短，不耐高温，当温度高于28℃时孢子即失活，高温季节使用效果不好。

大型真菌是菌物中能形成大型子实体的一类真菌，子实体的大小足以让肉眼辨识和徒手采摘。大型真菌种类繁多，有些种类可以食用，具有较高的营养价值和药用价值，如香菇、金针菇、灵芝、冬虫夏草等；还有些种类不能食用，因为含有生物毒素，是大型有毒真菌，俗称毒蘑菇。据统计已知的大型有毒真菌有129种，这些大型真菌虽然不能食用，但是具有较高的药用价值，如有的种类含有忌避、拒食、毒杀害虫的生物毒素，这些毒素是天然产物，具有易降解、种类多、活性强、与环境相容性好、易与其他药物混配、合理使用对人畜安全等优点，倍受人们高度重视，研制开发大型真菌杀虫剂将成为生物农药研究的热点。目前尚未发现大型真菌杀虫剂在防治桃红颈天牛中的应用。

发明内容

本发明提供的是一种防治桃红颈天牛的大型真菌杀虫剂，该大型真菌杀虫剂对防治桃红颈天牛具有致死率高、选择性强、药效时间长和耐高温的特点。

本发明的目的是这样实现的：一种防治桃红颈天牛的大型真菌杀虫剂，其组分及含量为：40%褐鳞环柄菇毒肽类毒素粗品，35%条纹毒鹅膏菌毒肽类毒素粗品和25%10目的菌糠粉。

一种防治桃红颈天牛的大型真菌杀虫剂，其制备方法为：

1、大型真菌的筛选

从大型真菌中筛选含有毒肽类毒素的褐鳞环柄菇和条纹毒鹅膏菌母种试管各1支。

2、摇床液体深层发酵

（1）、液体培养基：马铃薯200克、葡萄糖20克、NaNO₃3克、KH₂PO₄1克、KCl0.5克、MgSO₄·7H₂O0.05克、FeSO₄0.01克、蒸馏水1000毫升、PH7.0。

（2）、取两个容量为1000毫升的三角瓶，贴上标签，标明A瓶、B瓶，然后分别向A瓶、B瓶中加入液体培养基500毫升。在121℃~126℃、0.1兆帕下灭菌15~20分钟。

（3）、接种：在超净工作台上操作。首先用移液管分别取5毫升无菌水加入到褐鳞环柄菇和条纹毒鹅膏菌母种试管种中，随后用接种针在试管斜面上刮取菌落，洗脱菌丝制成褐鳞环柄菇和条纹毒鹅膏菌菌悬液各5.5毫升，然后将褐鳞环柄菇菌悬液倒入A瓶中，将条纹毒鹅膏菌菌悬液倒入B瓶中。

（4）、摇床液体深层发酵：将A瓶褐鳞环柄菇菌悬液和B瓶条纹毒鹅膏菌菌悬液置于摇床上，在温度26~28℃、转速110转／分钟的条件下深层发酵7~10天。

3、超声破碎、冷冻离心处理发酵液

将A瓶褐鳞环柄菇发酵液和B瓶条纹毒鹅膏菌发酵液分别用JY99-2D超声波细胞粉碎机，在功率200瓦，工作间歇1秒／1秒的条件下对菌丝和细胞进行破碎处理，再以10000转／分钟冷冻离心，分离上清液，滤渣用1~3倍量无菌水清洗三次，最后合并上清液，弃去残渣，A瓶褐鳞环柄菇发酵液离心得上清液486毫升；B瓶条纹毒鹅膏菌发酵液离心得上清液483毫升。

4、毒肽类毒素粗品的提取

首先向486毫升褐鳞环柄菇的上清液和483毫升条纹毒鹅膏菌的上清液中分别加5~8倍量95%甲醇，在室温下充分搅拌1~3小时，然后在50~60℃下用旋转蒸发仪加热减压浓缩，结果得褐鳞环柄菇的毒肽类毒素粗品18.4克，回收率3.8%；条纹毒鹅膏菌的毒肽类毒素粗品20.2克，回收率4.2%。

5、载体的选择与处理

载体选用袋料栽培香菇的废料菌糠。首先将菌糠烘干粉碎，然后过筛成10目的菌糠粉备用。

6、成型

首先按40%、35%依次称取褐鳞环柄菇和条纹毒鹅膏菌的毒肽类毒素粗品，然后混合均匀，最后添加25% 10目的菌糠粉作载体进行充分搅拌，待均匀后即成白色粉状大型真菌杀虫剂。

下面通过两个实验来说明大型真菌杀虫剂在防治园林蛀干害虫桃红颈天牛中的有益效果。

实验例1、大型真菌杀虫剂对桃红颈天牛幼虫的毒杀效果实验。

实验材料

按如下方法得到大型真菌杀剂：将褐鳞环柄菇菌悬液和条纹毒鹅膏菌菌悬液置于摇床上，在温度26℃、转速110转／分钟的条件下深层发酵7天。再将褐鳞环柄菇发酵液和条纹毒鹅膏菌发酵液分别用JY99-2D超声波细胞粉碎机，在功率200瓦，工作间歇1秒／1秒的条件下对菌丝和细胞进行破碎处理，再以10000转／分钟冷冻离心，去残渣，留上清夜。然后各取褐鳞环柄菇上清液和条纹毒鹅膏菌上清液200毫升。分别加1000毫升95%甲醇，在室温下充分搅拌1小时，然后在55℃下用旋转蒸发仪加热减压浓缩，得褐鳞环柄菇毒肽类毒素粗品，回收率4.2%；条纹毒鹅膏菌毒肽类毒素粗品，回收率3.8%。最后称取0.4克褐鳞环柄菇毒肽类毒素粗品、0.35克条纹毒鹅膏菌毒肽类毒素粗品与0.25克的10目菌糠粉混匀即成大型真菌杀虫剂。另从辽宁省昌图白僵菌厂引进白僵菌杀虫剂，作阳性试验。

桃红颈天牛是在沈阳城区园林的桃树和行道的京桃树上捕捉到的。捕捉头数22头，其中雌性成虫9头，雄性成虫13头。将捕捉到的桃红颈天牛进行实验室饲养，雌雄共成功配对7对。约10天左右配对成功的天牛产卵，总产卵数目约1200～1400头。天牛产卵位置不一，或将卵产在枝干缝隙处或将卵产在沙土上或将卵产在树皮翘起处或将卵产在纱布上。待卵孵化为初龄幼虫后开始对幼虫进行毒杀活性实验。

实验方法：

首先将大型真菌杀虫剂用无菌水配成0.5毫克/毫升、1.0毫克/毫升、1.5毫克/毫升、2.0毫克/毫升不同浓度的药液；用无菌水将白僵菌杀虫剂配成2.0毫克/毫升浓度的药液作阳性实验；用无菌水作空白对照。然后将新鲜桃树枝条用粉碎机粉碎成木屑。称取5克木屑置于小号培养皿中。用移液管量取1毫升不同浓度的药液于培养皿中的木屑上。用一次性牙签将药液与木屑混匀平铺于培养皿中。选取20头刚孵化好的正常生长的天牛初龄幼虫置于处理后的混合物上，设3个重复。将培养皿放在阴暗处培养。3天后进行观察，记录虫体死亡个数、毒杀效果、死亡率和校正死亡率。实验结果见表1。

表1.不同浓度大型真菌杀虫剂对桃红颈天牛初龄幼虫的毒杀实验结果

从表1可以看出，大型真菌杀虫剂的四种浓度对桃红颈天牛的初龄幼虫均有明显的毒杀作用，且均高于白僵菌的杀虫效果，呈现随着浓度增加死亡率增高的趋势，其中以浓度为2.0毫克/毫升时桃红颈天牛幼虫的死亡率88.33％为最高。另外还可以看出初龄幼虫死亡率随给药时间延长而升高。说明大型真菌杀虫剂对桃红颈天牛初龄幼虫具有显著毒杀效果。

实验例2、大型真菌杀虫剂对桃红颈天牛幼虫的树干注射堵孔毒杀效果实验

实验材料同实验例1。

实验方法：

2010年9月27日在沈阳大学京桃树林选择正在被天牛幼虫蛀蚀的树木5株，分别将五株树木进行编号D₁、D₂、D₃、D₄、D₅。在每株树上随机选择若干个正在被天牛幼虫蛀蚀的孔洞，将天牛幼虫排泄的新鲜虫粪和碎木屑用铁丝钩掏净，用大号注射器分别吸取5毫升2.0毫克/毫升、3.0毫克/毫升、4.0毫克/毫升、5.0毫克/毫升、6.0毫克/毫升的大型真菌杀虫剂依次注入D₁、D₂、D₃、D₄、D₅五株树木的蛀孔内，最后用黄泥封住孔口。10天后进行观察。

表2.大型真菌杀虫剂对桃红颈天牛幼虫的树干注射堵孔实验结果

从表2可以看出采用注射堵孔法，大型真菌杀虫剂对桃红颈天牛幼虫的防治效果显著，呈现出幼虫死亡率随大型真菌杀虫剂浓度增加而增高的趋势。当浓度达到5.0毫克/毫升时幼虫死亡率达到100%。由此可见，用大型真菌杀虫剂可以有效防治果园、城区园林和行道树的桃红颈天牛蛀干害虫。

综上所述，本发明的优点在于：

1、本发明采用注射堵孔法防治桃红颈天牛，防治效果好，药效高。

2、本发明研制的大型真菌杀虫剂对桃红颈天牛的防治选择性强，杀不到害虫的天敌和有益生物。

3、本发明研制的大型真菌杀虫剂是由毒肽类毒素粗品配制而成，不是活菌制剂，因此具有耐高温、有效期长、与其它药物相容性好等优点。

具体实施方式

实施例1

一种防治桃红颈天牛的大型真菌杀虫剂，其组分及含量为：40%褐鳞环柄菇毒肽类毒素粗品，35%条纹毒鹅膏菌毒肽类毒素粗品和25%10目的菌糠粉。

一种防治桃红颈天牛的大型真菌杀虫剂，其制备方法为：

1、大型真菌的筛选

从大型真菌中筛选含有毒肽类毒素的褐鳞环柄菇和条纹毒鹅膏菌母种试管各1支。

2、摇床液体深层发酵

（1）、液体培养基：马铃薯200克、葡萄糖20克、NaNO₃3克、KH₂PO₄1克、KCl0.5克、MgSO₄·7H₂O 0.05克、FeSO₄0.01克、蒸馏水1000毫升、PH7.0。

（2）、取两个容量为1000毫升的三角瓶，贴上标签，标明A瓶、B瓶，然后分别向A瓶、B瓶中加入液体培养基500毫升。在121℃、0.1兆帕下灭菌15分钟。

（3）、接种：在超净工作台上操作。首先用移液管分别取5毫升无菌水加入到褐鳞环柄菇和条纹毒鹅膏菌母种试管种中，随后用接种针在试管斜面上刮取菌落，洗脱菌丝制成褐鳞环柄菇和条纹毒鹅膏菌菌悬液各5.5毫升，然后将褐鳞环柄菇菌悬液倒入A瓶中，将条纹毒鹅膏菌菌悬液倒入B瓶中。

（4）、摇床液体深层发酵：将A瓶褐鳞环柄菇菌悬液和B瓶条纹毒鹅膏菌菌悬液置于摇床上，在温度26℃、转速110转／分钟的条件下深层发酵7天。

3、超声破碎、冷冻离心处理发酵液

将A瓶褐鳞环柄菇发酵液和B瓶条纹毒鹅膏菌发酵液分别用JY99-2D超声波细胞粉碎机，在功率200瓦，工作间歇1秒／1秒的条件下对菌丝和细胞进行破碎处理，再以10000转／分钟冷冻离心，分离上清液，滤渣用2倍量无菌水清洗三次，最后合并上清液，弃去残渣，A瓶褐鳞环柄菇发酵液离心得上清液486毫升；B瓶条纹毒鹅膏菌发酵液离心得上清液483毫升。

4、毒肽类毒素粗品的提取

首先向486毫升褐鳞环柄菇的上清液和483毫升条纹毒鹅膏菌的上清液中分别加5倍量95%甲醇，在室温下充分搅拌2小时，然后在50℃下用旋转蒸发仪加热减压浓缩，结果得褐鳞环柄菇的毒肽类毒素粗品19.4克，回收率4.0%；纹毒鹅膏菌的毒肽类毒素粗品20.7克，回收率4.3%。

5、载体的选择与处理

载体选用袋料栽培香菇的废料菌糠。首先将菌糠烘干粉碎，然后过筛成10目的菌糠粉备用。

6、成型

首先按40%、35%依次称取褐鳞环柄菇和条纹毒鹅膏菌的毒肽类毒素粗品，然后混合均匀，最后添加25% 10目的菌糠粉作载体进行充分搅拌，待均匀后即成白色粉状大型真菌杀虫剂。

实施例2

一种防治桃红颈天牛的大型真菌杀虫剂，其组分及含量为：40%褐鳞环柄菇毒肽类毒素粗品，35%条纹毒鹅膏菌毒肽类毒素粗品和25%10目的菌糠粉。

一种防治桃红颈天牛的大型真菌杀虫剂，其制备方法为：

1、大型真菌的筛选

从大型真菌中筛选含有毒肽类毒素的褐鳞环柄菇和条纹毒鹅膏菌母种试管各1支。

2、摇床液体深层发酵

（1）、液体培养基：马铃薯200克、葡萄糖20克、NaNO₃3克、KH₂PO₄1克、KCl0.5克、MgSO₄·7H₂O0.05克、FeSO₄0.01克、蒸馏水1000毫升、PH7.0。

（2）、取两个容量为500毫升的三角瓶，贴上标签，标明A瓶、B瓶，然后分别向A瓶、B瓶中加入液体培养基200毫升。在126℃、0.1兆帕下灭菌20分钟。

（3）、接种：在超净工作台上操作。首先用移液管分别取5毫升无菌水加入到褐鳞环柄菇和条纹毒鹅膏菌母种试管种中，随后用接种针在试管斜面上刮取菌落，洗脱菌丝制成褐鳞环柄菇和条纹毒鹅膏菌菌悬液各5.5毫升，然后将褐鳞环柄菇菌悬液倒入A瓶中，将条纹毒鹅膏菌菌悬液倒入B瓶中。

（4）、摇床液体深层发酵：将A瓶褐鳞环柄菇菌悬液和B瓶条纹毒鹅膏菌菌悬液置于摇床上，在温度27℃、转速110转／分钟的条件下深层发酵8天。

3、超声破碎、冷冻离心处理发酵液

将A瓶褐鳞环柄菇发酵液和B瓶条纹毒鹅膏菌发酵液分别用JY99-2D超声波细胞粉碎机，在功率200瓦，工作间歇1秒／1秒的条件下对菌丝和细胞进行破碎处理，再以10000转／分钟冷冻离心，分离上清液，滤渣用3倍量无菌水清洗三次，最后合并上清液，弃去残渣，A瓶褐鳞环柄菇发酵液离心得上清液186毫升；B瓶条纹毒鹅膏菌发酵液离心得上清液183毫升。

4、毒肽类毒素粗品的提取

首先向186毫升褐鳞环柄菇的上清液和183毫升条纹毒鹅膏菌的上清液中分别加6倍量95%甲醇，在室温下充分搅拌1小时，然后在55℃下用旋转蒸发仪加热减压浓缩，结果得褐鳞环柄菇的毒肽类毒素粗品6.7克，回收率3.6%；条纹毒鹅膏菌的毒肽类毒素粗品7.3克，回收率4.0%。

5、载体的选择与处理

载体选用袋料栽培香菇的废料菌糠。首先将菌糠烘干粉碎，然后过筛成10目的菌糠粉备用。

6、成型

首先按40%、35%依次称取褐鳞环柄菇和条纹毒鹅膏菌的毒肽类毒素粗品，然后混合均匀，最后添加25%10目的菌糠粉作载体进行充分搅拌，待均匀后即成白色粉状大型真菌杀虫剂。

实施例3

一种防治桃红颈天牛的大型真菌杀虫剂，其组分及含量为：40%褐鳞环柄菇毒肽类毒素粗品，35%条纹毒鹅膏菌毒肽类毒素粗品和25%10目的菌糠粉。

一种防治桃红颈天牛的大型真菌杀虫剂，其制备方法为：

1、大型真菌的筛选

从大型真菌中筛选含有毒肽类毒素的褐鳞环柄菇和条纹毒鹅膏菌母种试管各1支。

2、摇床液体深层发酵

（1）、液体培养基：马铃薯200克、葡萄糖20克、NaNO₃3克、KH₂PO₄1克、KCl0.5克、MgSO₄·7H₂O 0.05克、FeSO₄0.01克、蒸馏水1000毫升、PH7.0。

（2）、取两个容量为1000毫升的三角瓶，贴上标签，标明A瓶、B瓶，然后分别向A瓶、B瓶中加入液体培养基600毫升。在123℃、0.1兆帕下灭菌18分钟。

（3）、接种：在超净工作台上操作。首先用移液管分别取5毫升无菌水加入到褐鳞环柄菇和条纹毒鹅膏菌母种试管种中，随后用接种针在试管斜面上刮取菌落，洗脱菌丝制成褐鳞环柄菇和条纹毒鹅膏菌菌悬液各5.5毫升，然后将褐鳞环柄菇菌悬液倒入A瓶中，将条纹毒鹅膏菌菌悬液倒入B瓶中。

（4）、摇床液体深层发酵：将A瓶褐鳞环柄菇菌悬液和B瓶条纹毒鹅膏菌菌悬液置于摇床上，在温度28℃、转速110转／分钟的条件下深层发酵9天。

3、超声破碎、冷冻离心处理发酵液

将A瓶褐鳞环柄菇发酵液和B瓶条纹毒鹅膏菌发酵液分别用JY99-2D超声波细胞粉碎机，在功率200瓦，工作间歇1秒／1秒的条件下对菌丝和细胞进行破碎处理，再以10000转／分钟冷冻离心，分离上清液，滤渣用1倍量无菌水清洗三次，最后合并上清液，弃去残渣，A瓶褐鳞环柄菇发酵液离心得上清液527毫升；B瓶条纹毒鹅膏菌发酵液离心得上清液513毫升。

4、毒肽类毒素粗品的提取

首先取300毫升褐鳞环柄菇的上清液和300毫升条纹毒鹅膏菌的上清液，然后分别加7倍量95%甲醇，在室温下充分搅拌3小时，然后在60℃下用旋转蒸发仪加热减压浓缩，结果得褐鳞环柄菇的毒肽类毒素粗品11.1克，回收率3.7%；纹毒鹅膏菌的毒肽类毒素粗品12.3克，回收率4.1%。

5、载体的选择与处理

载体选用袋料栽培香菇的废料菌糠。首先将菌糠烘干粉碎，然后过筛成10目的菌糠粉备用。

6、成型

从表2可以看出采用注射堵孔法，大型真菌杀虫剂对桃红颈天牛幼虫的防治效果显著，呈现出幼虫死亡率随大型真菌杀虫剂浓度增加而增高的趋势。当浓度达到5.0毫克/毫升时幼虫死亡率达到100%。由此可见，用大型真菌杀虫剂可以有效防治果园、城区园林和行道树的桃红颈天牛蛀干害虫。