新的成体祖细胞

摘要

本发明涉及来自口腔粘膜固有层的新的祖细胞群的分离和应用。所述新的祖细胞群为高度增殖的，并且能够分化为一系列细胞系。而且，这些新的祖细胞具有免疫调节活性，并且因此可以用于组织的异源转移或用于协助对抗免疫障碍。

说明书

本发明涉及新的祖细胞(PC)及其后代，包括源自该祖细胞的分化的细胞；获得所述PC及其后代，包括所述分化的细胞，尤其是肌细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元细胞或雪旺细胞的方法，所述方法通过将所述组细胞分化成分化的细胞；并且涉及通过培养所述分化的细胞获得的重建的组织。此外，本发明涉及所述PC及其后代，包括所述分化的细胞在生产用于遭受诸如面部烧伤或损伤的个体的替代组织中的应用；并且涉及提供具有用于神经元再生潜力的神经元细胞。本发明还涉及所述PC和得到的后代用于治疗免疫相关的障碍的应用，所述免疫相关的障碍包括但不限于移植物抗宿主病(GVHD)和如糖尿病的慢性病症。

引言

由于围绕多能胚胎干细胞(ESCs)的应用的伦理和道德问题，用于组织工程应用的成体干细胞(ASCs)的分离和应用已获得极大的关注。已从体内的多个位置，诸如皮肤、骨膜、牙髓、脐带、腱和牙周膜分离到ASC。然而，骨髓基质细胞(BMSCs)是描述最多的。发现ASC来源替代骨髓来源的探索是持久性的，因为BMSC的数量随着年龄减少，并且它们的增殖和分化能力明显损失(1)。ASC为自我更新的和多能的，使之适合于治疗应用。它们的体外寿命有限降低了它们潜在的致瘤性，这也作为相对于ESC的优点。分离这些细胞的组织决定了它们潜在的治疗应用，一些ASC来源能够唯一地分化为它们来源的组织，例如分离的皮层祖细胞(2)。

因此，在寻找用于组织工程目的的理想活组织检查位置中，考虑诱导时ASC可以产生的细胞系范围以及它们的增殖能力很重要。实际上，分离足量的来自成体组织的干细胞可能极其受限。一些ASC已被表征为没有/具有较少的活性端粒酶，使得它们在体外扩增困难和受限制(2，3)。

此外，ASC的分离通常为创伤性的，例如BMSC的分离需要骨髓穿刺，或者皮肤来源的前体的分离需要皮肤活组织检查；后者导致疤痕形成。

口腔粘膜内的创伤愈合的特征在于炎症减少、上皮再次快速形成和不同的成纤维细胞响应，使得形成的疤痕最小；与在皮肤中观察到的相比，一般被认为是更加“胎儿样”的过程(4-8)。

已报道口腔粘膜上皮的基底层中存在祖细胞(PCs)(9-11)，但是到目前为止，未见有关存在口腔粘膜固有层(OMLP)中固有的祖细胞或干细胞群的报道。最近的综述通过参照皮肤真皮中的PC群，强调了OMLP中存在祖细胞或干细胞群的可能性(12)。传统地，PC被描述为单能或多能细胞。从这个角度来看，它们可以相当于成体干细胞。但是祖细胞被认为处在细胞分化的更远阶段。它们为“在中间”的干细胞，并且为完全分化的细胞。它们具有的潜能类型取决于它们的“亲代”干细胞的类型，还取决于它们的生态位(niche)。与大部分与干细胞类似，它们形成于集落中，在适当的条件下它们生长并分化为它们的目标组织。祖细胞和成体干细胞具有许多共同的特性，然而，两类细胞都不同于胚胎干细胞(ESCs)，胚胎干细胞(ESCs)为真正的干细胞，因为ESC为多能的，并且显示出无限的自我更新能力。相反地，许多被称为成体干细胞的细胞可以被定义为祖细胞更好，因为它们无限的自我更新能力和可塑性并未被全面证实。祖细胞被用作身体的修复系统。它们补充特化细胞，而且还维持血液、皮肤和肠道组织。

我们先前已报道，不考虑创伤环境，配对的患者口腔粘膜和皮肤成纤维细胞具有明显的显型和基因型区别，导致在口腔粘膜中观察到优先愈合响应(6-8)(Enoch等人，2009，出版中)。这些发现支持了OMLP中可能特异性固有PC群，并且正是这种细胞群可以促成在这种组织创伤上观察到的优先愈合响应的观点。重要地是，从OMLP分离PC群为治疗应用提供了明显优势，提供了容易取得并且微创的活组织检查位置，并且快速愈合，结果患者不形成疤痕/形成的疤痕最小。

我们在此首次公开了口腔粘膜固有层中固有的新的PC群的存在。这种细胞群可以从口腔粘膜活体组织检测物可靠地分离，并且我们惊奇地发现，这种PC群具有极大的用于治疗应用的潜力，因为它可以分化为一系列细胞系，而且这种PC群具有有利的增殖能力，能够产生用于治疗目的的足量细胞。实际上，源自单一OMLP PC的克隆在体外可以快速扩增，这得益于活性端粒酶的惊人表达。正是这些克隆群为多能的，并且可以分化为间充质和神经来源的细胞系。

在此，我们还首次公开了本发明的新PC群具有免疫调节性，更具体地是免疫抑制潜力的发现。实际上，我们发现将仅仅少数本发明的PC与淋巴细胞共培养就可以抑制免疫应答。这对于用于细胞或组织的异源转移具有重要意义，因为本发明的PC的使用/存在将会防止组织排斥。

将此放入文中，先前证明间充质干细胞(MSCs)对适应性免疫系统施加免疫调节性作用。最近公开的研究使用人牙周膜干细胞(也是间充质来源的)证明与淋巴细胞的直接接触产生了最有效的免疫抑制作用(13)。在MSC中观察到抑制程度为剂量依赖性的，免疫抑制水平随着存在的MSC数量的减少而降低。相反地，本发明的OMLP PC以非接触依赖性和非剂量依赖性方式发挥作用，产生对异源诱导的免疫应答的抑制。这种抑制作用可能是本发明的OMLP PC的极其重要的特征，因为由严重的移植物抗宿主病(GVHD)直接导致的死亡率仍然是异源造血干细胞(HSC)移植中的主要障碍之一。GVHD的特征在于HSC移植物中存在的T细胞直接攻击“外来抗原性”宿主。已报道的在GVHD治疗中的临床试验有限。最近Ringden等人的研究证明，在注入MSC的8位患者中，6位患者消除了所有症状，显示出完全的响应(14)。由此可见，本发明的祖细胞或其后代本身可以作为用于调节免疫应答的治疗剂，由此治疗炎症障碍，如在异源造血干细胞(HSC)移植中的GVHD。

此外，由此还可见，本发明的祖细胞及其后代本身可以作为用于调节免疫应答的治疗剂，由此治疗免疫障碍，例如但不限于GVHD。

因此，我们发现OMLP通过提供自我更新和多能的PC群，为组织工程应用提供了优选的细胞来源，所述PC群来自最小微创的活组织检查位置，该位置迅速愈合并且形成的疤痕最小。我们进一步发现，当与其他PC或ASC相比时，这种OMLP PC群具有有利的免疫调节活性。

发明内容

一种分离的人成体祖细胞(PC)及其后代，其中所述细胞源自口腔粘膜的固有层，并且进一步地，所述细胞为多能的、自我更新的和具有免疫调节性。

在此提及的多能与分化为在此所述的许多细胞类型的能力有关。

在此提及的自我更新包括提及的更新但不是无限意义上的。

在此提及的免疫调节性与本发明的PC或其后代，包括分化的细胞，以非接触依赖性或非剂量依赖性方式或者不依赖于HLA II细胞表面表达诱导来抑制免疫应答的能力有关。

在本发明优选的实施方案中，所述PC为三种干细胞标记物CD90、CD105和CD166阳性。

进一步理想地，所述PC为细胞标记物CD34和CD45阴性。

更进一步理想地，所述PC为以下四种细胞标记物阳性(与iPS相关，见下文)：Nanog、KLF-4、Sox2和Oct4。

还进一步地，所述PC为任何一种或多种以下细胞标记物阳性：CD90、CD105、CD166、STRO-1、CD44、CD146、Nanog、KLF-4、Sox2、Oct4、Notch1/2/或3、Delta 1或Jagged 2。

在此提及的对特定细胞标记物阳性或阴性的细胞与所述细胞表达所述标记物的能力有关，其中阳性意味着所述标记物表达，阴性意味着所述标记物表达缺失。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述PC经过超过45次的群倍增，并且理想地，在整个这种倍增时间或其中的一部分时间内还表达端粒酶。

如上所述，在本发明优选的实施方案中，所述PC在mRNA水平上为转录因子Nanog阳性(但是在蛋白水平并非必需的)，Nanog被认为是维持胚胎干细胞多能性的关键。此外，所述PC还为转录因子Oct4阳性，Oct4涉及未分化的干细胞的自我更新，它在用胶原酶消化口腔粘膜固有层之后在新鲜分离的细胞中表达(然而，它在传统的间充质干细胞培养基中培养之后消失)。此外，所述PC为Sox2和KLF-4阳性，Sox2是调节未分化的胚胎干细胞的自我更新和控制Oct4表达的重要转录因子，KLF-4是在维持干细胞中看来很重要的另一种转录因子。本发明的PC还为神经嵴标记物Sox10(其对神经嵴和周围神经系统发育重要)；Slug、Snail和Twist阳性，以及为发育标记物Notch1阳性。

这些标记物的存在暗示所述PC可以分化成的目标细胞类型。实际上，为了诱导的多能干细胞(iPS)技术今后的发展和利用，以上胚胎标记物在mRNA或蛋白水平上在祖细胞中的表达和未成熟发育标记物在祖细胞中的表达表明可能有优先的细胞类型，其比目前使用的细胞类型需要的修饰更少。实际上，在这方面值得注意的是，本发明的PC表达主要的四种细胞因子(Nanog、KLF-4、Sox2和Oct4)，它们用于iPS中将成纤维细胞重新编程回复为胚胎样干细胞。这四种因子在OMLP的PC中是自然表达的，表明我们拥有可以被分离且无需iPS重新编程就像胚胎干细胞一样起作用的细胞群。因此我们拥有具有多能性能力的PC群和/或进一步地，我们拥有产生胚胎干细胞类型细胞的PC群，其比其他细胞类型需要更少的重新编程。

因此，在本发明进一步的方面，提供了iPS，其包括表达以下四种细胞标记物或为以下四种细胞标记物阳性的OMLP的PC：Nanog、KLF-4、Sox2和Oct4。

此外，在本发明进一步的方面，提供了用于从口腔粘膜固有层获得祖细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)通过去除细胞的脂肪组织和上皮层处理来自受试者的口腔粘膜样品；

(b)去除剩余的固有层细胞外基质以形成细胞的混合悬浮液；

(c)分离潜在的祖细胞，并且让它们形成集落；以及

(d)利用祖细胞的特征性标记物选择集落。

在步骤(a)中，脂肪组织可以通过任何的简便方法去除，例如通过解剖活组织检查样品。链霉蛋白酶/分散酶是合适用于去除口腔粘膜上皮层的酶。如2mg/ml、37℃下过夜处理将满足需要，尽管本领域技术人员在此方面可以进行变化。

在步骤(b)中，固有层细胞外基质可以通过用胶原酶消化去除。如在1mg/ml梭状芽孢杆菌A胶原酶中于37℃下过夜孵育处理将满足需要，尽管本领域技术人员在此方面可以进行变化。

在步骤(c)中，以上潜在的祖细胞可以利用对细胞粘合剂的粘附不同来分离，所述细胞粘合剂如Dowthwaite等人2004和Jones和Watt，1993，(10，15)报道的纤维连接蛋白或包含RGD氨基酸序列的片段。然后可以让粘附至纤维连接蛋白基质的单细胞培养12-14天形成集落(＞32个细胞)，所得到的集落可以在克隆环(cloning ring)内通过胰蛋白酶消化而分离。可供选择地，如以上Jones和Watt的文章中所讨论的，在步骤(c)中可以使用其他基质如胶原蛋白和层粘连蛋白作为用于区别粘附的细胞粘合剂。此外，如果分离了足量的细胞，细胞可以使用流式细胞仪或磁活化细胞分类(MACS)选择来分选。

我们已经专门使用细胞的克隆群(而不是来自未分选的整个组织的异源分离物)用于本研究，因为这样能够精确地限定纯的细胞群。在不太优选的研究本发明的方式中，可以采用利用常规技术对整个组织的异源分离。这些技术可以包括，例如利用与细胞粘合剂的粘附区别来分离潜在的祖细胞，所述细胞粘合剂如Dowthwaite等人(2004)以及Jones和Watt(1993)(10，15)报道的纤维连接蛋白、RGD氨基酸序列、胶原蛋白或层粘连蛋白。在单层培养中，在被传代和扩增成异源祖细胞培养物之前，可以让粘附至例如纤维连接蛋白基质的单细胞生长至融合。

在上述步骤(d)中，祖细胞的特征性标记物包括端粒酶和转录因子Nanog以及转录因子Oct4，端粒酶被认为是胚胎干细胞中维持自我更新的关键；转录因子Nanog被认为是保持多能性的关键；转录因子Oct4涉及未分化的干细胞的自我更新。可以检测的其他标记物为神经嵴标记物，例如Sox10(其对神经嵴和周围神经系统的发育重要)；Slug、Snail、Twist和p75。其他有用的标记物为发育标记物Notch1。可以检测的其他标记物包括CD90、CD105、CD166、STRO-1、CD44、CD146、CD34、CD45、Sox2、KLF-4、Notch 2或3、Delta 1和Jagged。除CD34和CD45外，可以寻找对任何一种或多种前述标记物为阳性，并且优选地，对一种以上的这样的标记物为阳性，例如按逐渐优选的顺序，对至少两种、三种、四种、五种或六种或更多种这样的标记物为阳性的选定细胞。为证实这些祖细胞并不是造血来源的，可以寻找对CD34和CD45阴性的选定细胞。

标记物的存在或缺失可以通过标准方法来确定，优选免疫细胞化学法或荧光激活细胞分类(FACS)分析。

相应地，在本发明进一步优选的方法中，所述方法在步骤(c)之后并且在实施步骤(d)之前，还包括使用常规方法确定任何一种或多种上述特定标记物表达的步骤，所述常规方法例如但不限于，免疫细胞化学法或荧光激活细胞分类(FACS)分析。

在本发明进一步优选的方法中，所述方法还包括以下的其它步骤：

(e)扩增步骤(d)中选择的集落。

通常，这些选择的集落在单层培养物中扩增，并且这可能持续至衰老。

如有经验的人员所知道的，通过变化培养条件可以实现祖细胞分化为选定的显型。例如，本发明人已发现在含10％胎牛血清的Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM)中培养的细胞，显示成纤维细胞型形态，而且保持表达三种干细胞标记物CD90、CD105和CD166a，并且理想地，还有STRO-1、CD44、CD146系列。此外，理想地，它们还为CD34和CD45阴性。然而，通过改变培养基，可能获得软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、骨细胞和神经元细胞。在以下实施例中将进一步列出培养基的细节。

然而，简言之，通过在添加1x胰岛素、转铁蛋白和硒(ITS)添加剂(Invitrogen，UK)、50μg/ml L-抗坏血酸盐(Sigma，UK)和5ng/ml转化生长因子β1(TGFβ1)((Peprotech EC Ltd.，UK)的基础培养基(添加2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素、0.25μg/ml两性霉素B的Dulbecco改进Eagle培养基[DMEM])的细胞团(pellet)培养系统中培养PC获得软骨细胞。

使用成骨诱导培养基(添加10％(v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素、0.25μg/ml两性霉素B、50μg/ml L-抗坏血酸盐、10μM地塞米松和5mM β-甘油磷酸盐(Sigma，UK)的Alpha改进Eagle培养基(α-MEM)(Invitrogen，UK)获得骨细胞。

使用成脂肪诱导培养基(添加10μg/ml胰岛素、1μM地塞米松、100μM吲哚美辛、100μM3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤[IBMX](Sigma，UK)的SCM)培养3天，然后转移至成脂肪维持培养基中进一步培养24小时。然后再用诱导培养基培养细胞。这个培养基的循环重复28天。所述成脂肪维持培养基由添加10μg/ml胰岛素的SCM组成。

使用X-VIVO^TM10培养基(Lonza Group Ltd.，UK)培养用于神经元细胞和雪旺细胞系的PC，所述X-VIVO^TM10培养基中添加了0.1mM β-巯基乙醇(Sigma，UK)、1％(v/v)非必需氨基酸(Invitrogen，UK)、100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素、0.25μg/ml两性霉素B和80ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)(Peprotech EC Ltd.，UK)。

使用以前描述的方法使这些细胞进行神经元分化(16，17)。简言之，对单细胞悬浮液计数并以5.6×10³个细胞/cm²接种于0.1％Matrigel^TM(BD Biosciences，UK)包被的腔室培养玻片(chamber slides)上，置于DMEM-F12(3∶1)培养基中，所述DMEM-F12(3∶1)培养基添加了40ng/ml hrbFGF、10％(v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B。培养细胞7天，每3天更换培养基。培养7天之后，从培养基中去除rhbFGF，并用10ng/ml神经生长因子(NGF)、10ng/ml脑源性生长因子(BDNF)和10ng/ml神经营养因子(neurotrophin)3(NT3)替代。再培养细胞7天，每3天更换培养基。

如之前Toma等人(2005)(18)的描述进行雪旺细胞的分化。将胶原酶处理的细胞以与用于神经元分化所述的密度相等的密度接种于聚-D-赖氨酸层粘连蛋白(laminin)(2μg/ml)包被的腔室培养玻片上。在DMEM-F12(3∶1)中培养细胞7天，所述DMEM-F12(3∶1)添加了10％(v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B。然后用neurobasal培养基(Invitrogen，UK)替代该培养基，所述neurobasal培养基含有1％(v/v)FCS、1％(v/v)N2添加剂(Invitrogen，UK)、4μM毛喉素(forskolin，Sigma，UK)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素、0.25μg/ml两性霉素B和10ng/ml heregulin β1(Peprotech EC Ltd.，UK)。在该培养基中进一步培养细胞7天。每3天更换培养基，50％的条件培养基被再应用于细胞。

相应地并且优选地，上述方法进一步包括涉及分化所述选择的PC的最终步骤，如在此所述，其中通过以选定的方式将所述PC的培养条件变为用于产生选定的分化细胞而实现分化。

此外，在本发明进一步的方面，提供了用于获得肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、雪旺细胞和/或神经元细胞的方法，所述方法包括分化至少一种从口腔粘膜的固有层获得的祖细胞(PC)或其后代。

在本发明的上下文中，“肌细胞”是指平滑肌细胞和横纹肌细胞，“骨细胞(bone cells)”是指成骨细胞和骨细胞(osteocytes)。

在本发明进一步的方面，提供了通过分化至少一种从口腔粘膜固有层分离的祖细胞而获得的至少一种分化的细胞。

理想地，所述分化的细胞为软骨细胞、或肌细胞、或脂肪细胞、或骨细胞、或雪旺细胞，和/或神经元细胞。

这种分化的细胞的实例包括能够形成软骨(通过标记物聚集蛋白聚糖(aggrecan)+、Sox9+、col2a1 A+型而证实的)、脂肪细胞(通过油红O染色的表达而证实的，并且理想地，还通过在信使RNA水平上的脂蛋白脂肪酶、CAATT/增强子结合蛋白α[CEBPα]和过氧化物酶体增殖物激活受体γ[PPARγ]的表达证实的)、骨细胞(通过Von Kossa和碱性磷酸酶染色而证实的)(图12)、雪旺细胞(通过免疫细胞化学法检测S100和髓鞘碱性蛋白(MBP)的产生而证实的)和神经元细胞(通过免疫细胞化学法检测巢蛋白(nestin)、β-微管蛋白III(TUJ-1)、神经纤维细丝蛋白M、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和微管相关蛋白2(MAP2)的产生而证实的；还参见图6a-g)的细胞。

在本发明这个方面优选的实施方案中，所述分化的细胞和源自集落的细胞是采用以上描述的方法获得的。

在进一步的方面，本发明还提供了通过培养分化的细胞获得的重建组织。

本发明所述的PC和重建组织可以用于各种医学应用中，因此在本发明的进一步方面，提供了用于药物的本发明的分化的细胞或重建组织。

例如，由这些细胞形成的骨细胞、肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞和重建组织全部可以应用于治疗创伤或烧伤，或修复由疾病如癌症导致的损伤。这对于治疗面部损伤和疤痕特别有意义。

神经细胞可以用于神经障碍，如帕金森症。雪旺细胞可以用于神经损伤的修复和治疗脊髓损伤。

有利地，所述PC或其后代包括分化的细胞，可以源自需要治疗的患者，但是可供选择地，可以源自另一个体，并且被用于异源组织工程和移植。由于所述PC或其后代固有的免疫调节性质，而且尤其是这些细胞抑制免疫应答的能力，这种后者选择可用于实施本发明的研究。

进一步地，源自需要治疗的个体或任何其他人的所述PC或其后代，可以与源自除需要治疗个体之外的个体的分化组织同时给予，并且在这种情况下，所述PC或其后代发挥有益的免疫抑制作用。

因此，在本发明另一方面，提供了用于治疗创伤、烧伤，或修复由疾病导致的损伤的方法，所述方法包括用如前所述的分化的细胞或重建组织替代损伤组织，其中所述分化的细胞或所述组织可以源自需要治疗的患者，也可以源自另一个体的OMLP的PC。

进一步地，在本发明另一方面，提供了用于治疗创伤、烧伤或修复由疾病导致的损伤的方法，所述方法包括同时给予i)源自除需要治疗的个体之外的个体的分化的细胞或组织，其中细胞或组织并非源自OMLP的PC，和ii)OMLP的PC或其后代。

由于OMLP的PC或其后代的免疫抑制性质，以上部分ii)中所述PC可以源自任何个体。本发明的这种后者方面的实例为同时输入来自除需要治疗的个体之外的个体的造血干细胞，并且所述PC预防或用于治疗GVHD。

在本发明进一步的方面，提供了用于治疗炎症障碍或免疫障碍的方法，所述方法包括向待治疗的个体给予如上所述的祖细胞或其后代，包括分化的细胞或组织，或者通过以上所述方法获得的祖细胞或其后代。

在本发明更进一步的方面，提供了如上所述的祖细胞或其后代，包括分化的细胞或组织，或者通过以上所述方法获得的祖细胞或其后代，包括分化的细胞或组织作为药物的应用。

在优选实施方案中，所述应用为治疗任何一种或多种以下障碍：创伤、烧伤、组织损伤、炎症、自身免疫、GVHD异源造血干细胞(HSC)移植、糖尿病或免疫障碍。

现在将参考以下附图更详细地描述本发明。其中：

图1显示被包被到纤维连接蛋白上并且根据粘附区别被分离的p75阳性细胞。

图2显示在(a)DMEM/10％FCS，(b-c)X-VIVO10培养基中扩增的集落中不同的形态。(b)显示连接至层粘连蛋白基质的典型神经球样结构，以及(c)显示从这种球迁移出来并具有神经样形态的细胞，与(a)中可见的成纤维细胞形态对比。

图3显示SY5Y成神经细胞瘤细胞系的典型形态。可见单个分化的神经细胞从连接至培养板的未分化细胞群中迁移出来(http://en.wikipedia.org/wiki/SHSY5Y)。

图4为如Li等人，2005所述的，使用X-VIVO10培养基条件在单层培养物中扩增分离的集落时产生的神经球的显微照片。Bar＝50μm。

图5通过采用FITC偶联二抗的免疫细胞化学法，对培养于X-VIVO10培养基中的未分化OMLP祖细胞中的神经标记物(a)神经丝蛋白M(-ve)，(b)TUJ-1(+ve)和(c)GFAP(+ve)，以及雪旺细胞标记物(d)MBP(-ve)和(e)S100(+ve)的免疫定位。Bar＝50μm。由于未观察到信号，未显示MAP2数据。

图6通过采用FITC偶联二抗的免疫细胞化学法，对未分化的OMLP祖细胞中的神经标记物(a)巢蛋白，(b)TUJ-1，(c)神经丝蛋白M，(d)GFAP和(e)MAP2，以及雪旺细胞标记物(f)MBP和(g)S100的免疫定位(全部+ve)。Bar＝10μm(在图6e中为50μm)。

图7显示OMLP中胚胎和发育标记物的阳性表达。通过RT-PCR确定在完整OMLP消化物中胚胎标记物(Nanog、Oct4、Sox2、KLF-4和hTERT)以及发育标记物(Notch 1、2、3、Delta 1和Jagged 2)的阳性表达。HuES9ESC RNA用作所有反应的阳性对照。

图8显示PC确实可以从OMLP分离，并且在体外快速扩增。利用粘附区别由OMLP消化物克隆扩增PC(A)。从三位患者分离多个PC克隆，其显示成纤维细胞样形态(A、B)和体外快速增殖，在达到细胞衰老之前总计＞50PDs(C、D、E)。

图9显示OMLP PC表达干细胞标记物，并且不是造血或纤维细胞来源的。对扩增的克隆进行干细胞标记物CD90、CD105、CD166和CD44，以及造血/纤维细胞标记物CD34和CD45表达的FACS分析。从三位患者分离的PC克隆被证实为CD90+、CD105+、CD166+、CD44+、CD34-和CD45-。

图10显示OMLP PC表达活性端粒酶。通过ICC，PC集落证明了端粒酶的表达(A)。单层扩增之后，通过Q-TRAP对表达定量。所有集落(n＝3)为活性端粒酶阳性(B、C、D)。使用热灭活(HI)作为对照。在丙烯酰胺凝胶上分离Q-TRAP产物证实了端粒重复序列“阶梯”效应(E)。

图11显示OMLP PC源自神经嵴。在Jagged 1(A、B、C)存在下，来自两位患者的PC的CFE显著较高。通过ICC，在发育集落中通过神经嵴标记物(D)Snail、(E)Slug、(F)Sox10、(G)Twist和(H)Notch 1的表达证实了神经嵴来源。

图12显示OMLP PC可以分化为间充质细胞系。PC向下分化为间充质细胞系。通过Van Gieson’s染色(A)和聚集蛋白聚糖ICC(B)证实向下分化为成软骨细胞系。通过针对钙沉积的Von Kossa染色分析成骨细胞诱导(C)，以及通过针对脂滴的油红O染色分析成脂肪细胞诱导(D)。

图13显示OMLP PC上细胞表面(a，b)HLA I的表达水平。柱状图显示OMLP-PC上细胞表面(a，b)HLA I和(c，d)HLA II表达的表达水平和在IFNγ存在/不存在时中荧光强度的变化。注解：红色指示Ig对照，绿色指示第1天，蓝色指示第2天，以及棕色指示第7天。

图14显示在未刺激的OMLP-PC中不存在HLA II蛋白。Western印迹证明在未刺激的OMLP-PC中不存在HLA II蛋白，并且用IFNγ刺激24小时之后诱导出HLA II蛋白。

图15显示OMLP-PC对淋巴细胞增殖的非剂量依赖性抑制作用。单向MLC结果证明OMLP-PC对淋巴细胞增殖的强效抑制作用。这些数据证明这种现象为非剂量依赖性的，并且与通过用IFNγ预刺激诱导HLA II表达无关。数据表示为CPM+/-标准差。这些数据来自一个OMLP-PC克隆，但是代表了测试的所有克隆。***P＜0.001通过单向ANOVA和Bonferroni事后检验确定。

图16显示MSC对淋巴细胞增殖的可变的抑制作用。单向MLC结果显示MSC对淋巴细胞增殖的可变的抑制作用。这些数据证明这种现象为剂量依赖性的。数据表示为CPM+/-标准差。

图17显示OMLP-PC对T细胞增殖的非剂量依赖性抑制作用。单向MLC结果证明OMLP-PC对T细胞增殖的强效抑制作用。这些数据证明这种现象为非剂量依赖性的，并且与通过用IFNγ预刺激诱导HLA II表达无关。数据表示为CPM+/-标准差。这些数据来自一个OMLP-PC克隆，但是代表了测试的所有克隆。***P＜0.001通过单向ANOVA和Bonferroni事后检验确定。

图18显示OMLP-PC对淋巴细胞增殖的非接触依赖性抑制作用。单向MLC结果证明OMLP-PC以非接触依赖性方式对淋巴细胞增殖的强效抑制作用。这些数据证明这种现象为非剂量依赖性的，并且与通过用IFNγ预刺激诱导HLA II表达无关。数据表示为CPM+/-标准差。这些数据来自一个OMLP-PC克隆，但是代表了测试的所有克隆。***P＜0.001通过单向ANOVA和Bonferroni事后检验确定。

图19显示OMLP-PC对T reg细胞的数量没有作用。FACS结果证明OMLP-PC对T reg细胞数量没有作用。这些数据证明这种现象为非剂量依赖性的，并且与通过用IFNγ预刺激诱导HLA II表达无关。数据表示为平均％T Reg细胞+/-标准差。这些数据来自3位患者。

图20显示OMLP-PC对CD3+CD38+激活的T细胞的作用。FACS结果证明当与应答细胞以接触或透孔(transwells)方式共培养时，OMLP-PC对CD3+CD38+激活的T细胞数量的作用。这些数据证明这种现象为非剂量依赖性的，并且与通过用IFNγ预刺激诱导HLA II表达无关。数据表示为平均％CD3+CD38+T细胞+/-标准差。这些数据来自3位患者。

图21显示OMLP-PC对CD3+CD25+激活的T细胞的作用。FACS结果证明当与应答细胞以接触或透孔(transwells)方式共培养时，OMLP-PC对CD3+CD25+激活的T细胞数量的作用。这些数据证明这种现象为非剂量依赖性的，并且与通过用IFNγ预刺激诱导HLA II表达无关。数据表示为平均％CD3+CD25+T细胞+/-标准差。这些数据来自3位患者。

材料和方法

祖细胞的分离和维持培养

从认可的患者(n＝3)获得正常的无疾病口腔粘膜活组织检查样品，所述患者都在英国卡的夫大学(Cardiff University)的University Hospital of Wales的School of Dentistry经过常规牙科处理。本研究先前已获得地方伦理委员会批准，并且依照Helsinki规定(Helsinki convention)告知捐赠者。

如先前(6)所述的，酶消化活组织检查样品后获得单细胞悬浮液。在70％乙醇中对组织进行表面消毒(30秒)，剪掉组织上任何多余的脂肪，并将其剪成5mm²的块。然后将组织与分散酶(Sigma，UK；cat.no P-3417；2mg/ml)一起于4℃下孵育过夜，以利于分离上皮和固有层组织。第二天将上皮组织从固有层组织剥离并丢弃。然后将OMLP组织机械切碎，并与梭状芽孢杆菌A胶原酶(Roche Life Sciences，UK；cat.no 103 586；1mg/ml)于37℃下分解过夜。在含血清的培养基(SCM)中制备分散酶和胶原酶溶液，所述培养基(SCM)添加2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素、0.25μg/ml两性霉素B和10％(v/v)热灭活胎牛血清[FCS](cat.no 10270-106)(Dulbecco’s改进Eagle培养基[DMEM](cat.no21969-035)。培养基和添加剂购自英国的Invitrogen。然后，释放的细胞在重悬于基础培养基之前成团、清洗和再次成团，所述基础培养基添加2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素、0.25μg/ml两性霉素B(Dulbecco’s改进Eagle培养基[DMEM](cat.no 21969-035))。

随后利用与纤维连接蛋白的粘附区别分离PC(10，15)。将基础培养基中的OMLP单细胞悬浮液接种至牛血浆纤维连接蛋白(10μg/ml于4℃下在PBS+[0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4，含1mM氯化镁和1mM氯化钙]中稀释过夜；Sigma，UK；cat.no F-4759)包被的6孔板上，于37℃下孵育20分钟。丢弃在此时间范围内未粘附的细胞，并让粘附的细胞于37℃、5％CO₂的潮湿气氛下在SCM中形成单细胞集落(＞32个细胞，从我们的分析中消除任何可能的短暂扩充细胞)。在通过用0.05％(w/v)胰蛋白酶/0.53mM乙二胺四乙酸(EDTA)(Invitrogen，UK；cat.no 25300-054)的胰蛋白酶消化进行分离克隆环内的细胞之前，对指定集落内的细胞进行手工计数，并且以2×10³个细胞/cm²的密度重新接种于SCM中。

在达到融合时，通过采用0.05％(w/v)胰蛋白酶/0.53mM乙二胺四乙酸(EDTA)(Invitrogen，UK；cat.no 25300-054)的胰蛋白酶消化并且使用上述密度重新接种而将细胞传代。通过如先前所述的(19)对每次传代的细胞数量直接计数，得到细胞群在体外的群体倍增数。培养克隆的PC群直至衰老，所述衰老定义为常数PD值/周＜0.5，并通过细胞形态学评估。

克隆的异源扩增

本方法包括许多以上以标题“祖细胞的分离和维持培养”描述的技术。然而，在利用与纤维连接蛋白的粘附区别分离PC之后，在单培养上作为异源祖细胞群被传代和扩增之前，使粘附的细胞生长至融合。

用于胚胎和发育标记物的RT-PCR

采用(Invitrogen，UK)从整个OMLP消化物提取RNA。按照厂商的说明，使用随机六聚体引物和莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase)(Promega，UK)从总RNA中得到cDNA。按照厂商的说明，使用(Promega，UK)进行标准PCR反应，起始变性步骤为94℃，5分钟，接着40个循环：94℃(1分钟)，Ta(30秒)，72℃(1分钟)，以及最后的延长步骤为72℃，10分钟。针对Nanog(17)[F 5’TGC TTA TTC AGG ACA GCC CT 3’和R 5’TCT GGT CTT CTG TTT CTT GAC T 3’]Ta 44℃，Oct4⁽²⁰⁾[F 5’CGA CCA TCT GCC GCT TTG AG 3’和R 5’CCC CCT GTC CCC CAT TCC TA 3’]Ta60℃，Sox2[F 5’AAC CCC AAG ATG CAC AAC TC 3’和R 5’CGG GGC CGG TAT TTA TAA TC3’]Ta 55℃，KLF-4[F 5’ACC CAC ACA GGT GAG AAA CC 3’和R 5’ATG TGT AAG GCG AGG TGG TC 3’]Ta 55℃，hTERT(21)[F 5’CGG AAG AGT GTC TGG AGC AA 3’和R 5’GGA TGA AGC GGA GTC TGG A 3’]Ta 55℃，Notch 1[F 5’CTA CCT GTC AGA CGT GGC CT 3’和R 5’CGC AGA GGG TTG TAT TGG TTC G 3’]Ta 56℃，Notch 2[F5’AAG CAG AGT CCC AGT GCC TA 3’和R 5’CAG GGG GCA CTG ACA GTA AT 3’]Ta 56℃，Notch 3[F 5’CAG TCG CCT GAG AAT GAT CAC 3’和R 5’GAA TGA CCA GCA GCA AGA CAG 3’]Ta 53℃，Delta 1[F 5’ATC CTT GTC CTC ATG CTG CT 3’和R 5’GCC TTG AAG CCA TTC TTG TC3’]Ta 53℃以及Jagged 2[F 5’CTA CAA TGG TGG CAT CTG TG 3’和R 5’GCG ATA CCC GTT GAT CTC AT 3’]Ta 53℃的表达分析cDNA。使用Primer3引物设计软件设计未公开的引物(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并且用0.005％(v/v)溴化乙锭显像。在所有反应中使用HuES9 ESC系cDNA为阳性对照。

流式细胞术

用于流式细胞术的扩增细胞通过用Accutase^TM(Sigma，UK)处理传代，并且在染色之前计数。细胞悬浮液在磷酸缓冲盐(PBS)中清洗两次以去除残留的血清，然后用三种干细胞标记物CD90-别藻蓝蛋白(APC，R & D Systems，UK)，CD105-R-藻红蛋白(RPE)和CD166-异硫氰酸荧光素(FITC)(所有抗体进行1∶50稀释；Ancell Inc.，USA)于4℃下进行三重标记45分钟。细胞还使用与用于造血和纤维细胞标记物CD34-FITC和CD45-RPE(1∶50；Ancell Inc.，USA)相同的方法分别染色。将细胞于PBS中清洗两次，然后用2％多聚甲醛于冰上固定5分钟。在检测之前，将固定的细胞悬浮液稀释于1ml的PBS中。

用配备488nm和633nm激光激发源的FACSCanto^TM流式细胞仪(BD Biosciences，UK)分析细胞，每个样品记录30,000个事件。荧光团偶联免疫球蛋白和单一染色用作各自的对照。在用FlowJo 7.2.2版软件(Tree Star Inc.，USA)分析之前，补偿所有数据。

定量端粒扩增法(Q-TRAP)

使用先前Wege等人2003(22)所述的合适的Q-TRAP方法对扩增克隆中活性端粒酶的存在进行分析和定量。简言之，将细胞以10,000个细胞/μl的浓度于冰上的1X CHAPS裂解缓冲液(Chemicon International，UK)中裂解30分钟。将裂解的细胞于4℃下以20,000xg离心20分钟。使用干冰迅速冷冻裂解物上清液，并且在使用之前贮藏于-80℃下。制备总计20μl的mastermix混合液：12.5μl Sybr Green PCR mix(Applied Biosystems，UK)、100ng TS引物[5’AAT CCG TCG AGC AGA GTT 3’]、50ng ACX引物[5’GCG GCG CTT ACC CTT ACC CTA ACC 3’](Kim和Wu(1997)(23)先前公开了引物序列)和焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水，每次反应加入5μl，相当于10,000个细胞的量。加热使裂解物灭活(85℃，30分钟)，并且裂解缓冲液用作阴性对照。制作501mel细胞裂解物的标准曲线(范围1-10,000细胞)，以计算端粒酶的相对表达。所有反应进行三次，使用AbiPrism 7000序列检测系统(Applied Biosystems，UK)，并且数据表示为相对于501mel阳性对照细胞系的10,000个细胞的端粒酶表达百分率。

可溶性Jagged 1存在下的集落形成效率

利用如上所述的与纤维连接蛋白的粘附区别确定集落形成效率(CFE)。在SCM+/-Notch配体、重组鼠Jagged 1/Fc嵌合体(R & D Systems，UK；50ng/ml)中培养9天使集落形成。每3天替换培养基和Jagged 1。

CFE表示为形成的集落总数(＞32个细胞)与初始粘附细胞数量的比率。

免疫细胞化学(ICC)

发育集落：将连接至纤维连接蛋白包被的多孔平板的发育集落中的细胞于4℃下、在冰甲醇∶丙酮(1∶1)中固定20分钟。在PBS中清洗细胞，然后用0.1％X100(Sigma，UK)于室温下渗透化20分钟(仅有p75神经生长因子[NGF]受体、Twist、Slug和Sox10抗体)。按照抗体厂商的说明，用于端粒酶染色的固定细胞与2N盐酸于室温下孵育20分钟，然后用0.1M硼酸钠中和5分钟。随后，在适当的血清(Dako UK Ltd.，UK；1∶20稀释)中于室温下封闭细胞30分钟。细胞于4℃下与一抗孵育过夜(p75 NGF受体[ME20.4]1∶100，Twist[H-81]1∶50；Slug[G-18]1∶100；Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA；Snail[Ab17732]1∶50；Sox10[Ab25978]1∶50；端粒酶[Ab5181]1∶2000；Abcam Plc，UK；Notch 1[bTAN20]1∶5；Developmental Studies Hybridoma Bank，USA)。于室温下孵育四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)抗-兔、FITC抗-小鼠(Dako UK Ltd.，UK)、FITC抗-羊和FITC抗-大鼠(Sigma，UK)二抗1小时。

后神经和雪旺细胞分化：如先前所述的，固定、清洗和封闭细胞。在封闭之前，用0.2％X100使与微管相关蛋白2(MAP2)抗体一起孵育的细胞渗透化。于4℃下将细胞在一抗(MAP2[HM-2]1∶400；胶质纤维相关蛋白(GFAP)[GF-5]1∶200；神经元特异性β-微管蛋白III[TUJ-1]1∶1000；神经丝蛋白M(NFM)[Ab9034]1∶500；S100[4C4.9]1∶50；髓磷脂碱性蛋白(MBP)[EP1448Y]1∶100；Abcam Plc，UK)中孵育过夜。二抗的孵育如上所述。

使用包含4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Vector Laboratories，UK)的封固剂复染可用的细胞核，并且使用配备Nikon DXM1200照相机和Nikon ACT-1软件(Nikon UK Ltd.)的Olympus Provis AX70显微镜(Olympus Optical Co.，UK Ltd.)显像。

成软骨细胞、成骨细胞和成脂肪细胞的分化

对扩增克隆的单细胞悬浮液实施多个间充质细胞系的分化诱导方案。

成软骨细胞分化：置于微离心管中的单细胞悬浮液在1ml SCM中以5×10⁵个/管的浓度于1500转/分钟(RPM)下成团。过夜使得细胞团形成。用成软骨诱导培养基(添加1x胰岛素、转铁蛋白和硒(ITS)添加剂(Invitrogen，UK)、50μg/ml L-抗坏血酸盐(Sigma，UK)和5ng/ml转化生长因子β1(TGFβ1)(Peprotech EC Ltd.，UK)的基础培养基)替代SCM。每2天更换培养基，并且在吸出条件培养基之前离心细胞团。持续培养细胞团达到21天。

成骨细胞的分化：将细胞以3×10³个细胞/cm²的浓度接种于6孔培养皿中。在SCM中培养细胞直至达到融合，此时用成骨诱导培养基(添加10％(v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素、0.25μg/ml两性霉素B、50μg/ml L-抗坏血酸盐、10μM地塞米松和5mM β-甘油磷酸盐(Sigma，UK)的Alpha改进Eagle培养基(α-MEM)(Invitrogen，UK))替代培养基。每3天向培养物补充成骨诱导培养基，培养总计21天。

成脂肪细胞的分化：将细胞以3×10³个细胞/cm²的浓度接种于6孔培养皿中。在SCM中培养细胞直至达到融合，此时用成脂肪诱导培养基(添加10μg/ml胰岛素、1μM地塞米松、100μM吲哚美辛、100μM 3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤[IBMX](Sigma，UK)的SCM)替代培养基长达3天。然后，用成脂肪细胞维持培养基(添加10μg/ml的SCM)进一步孵育细胞1天。细胞在诱导和维持培养的循环中重复培养总计28天。

神经元和雪旺细胞的分化

在限定的ESC培养基(24)中培养和扩增分离的集落。如先前所述，将集落用胰蛋白酶消化，并且接种至人层粘连蛋白包被的多孔板(2μg/cm²；Sigma，UK)上。细胞在X-VIVO^TM10培养基(Lonza Group Ltd.，UK)中维持，所述X-VIVO^TM10培养基添加了0.1mM β-巯基乙醇(Sigma，UK)、1％(v/v)非必需氨基酸(Invitrogen，UK)、100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素、0.25μg/ml两性霉素B和80ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)(Peprotech EC Ltd.，UK)。

将细胞传代，并且通过于37℃下在1mg/ml梭状芽孢杆菌胶原酶IV(Invitrogen，UK)中孵育分解神经球5-10分钟，随后机械分解。

使用先前描述的方案(16，17)将细胞进行神经元分化。简言之，对单细胞悬浮液计数，并以5.6×10³个细胞/cm²接种于0.1％Matrigel^TM(BD Biosciences，UK)包被的腔室培养玻片上，所述腔室培养玻片置于添加了40ng/ml hrbFGF、10％(v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B的DMEM-F12(3∶1)培养基中。培养细胞7天，每3天更换培养基。培养7天之后，去除培养基中的hrbFGF，并用10ng/ml神经生长因子(NGF)、10ng/ml脑源性生长因子(BDNF)和10ng/ml神经营养因子3(NT3)替代。再培养细胞7天，每3天更换培养基。

雪旺细胞的分化如Toma等人(2005)(18)先前所描述的。将胶原酶处理的细胞以与用于神经元分化的密度相等的密度接种于聚-D-赖氨酸层粘连蛋白包被的腔室培养玻片上(2μg/ml)。细胞在DMEM-F12(3∶1)中培养7天，所述DMEM-F12(3∶1)添加10％(v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B。然后，用neurobasal培养基(Invitrogen，UK)替代培养基，所述neurobasal培养基含有1％(v/v)FCS，1％(v/v)N2添加剂(Invitrogen，UK)、4μM毛喉素(Sigma，UK)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素、0.25μg/ml两性霉素B和10ng/ml heregulin β1(Peprotech EC Ltd.，UK)。在该培养基中进一步维持细胞7天。每3天更换培养基，将50％的条件培养基再应用于细胞。

免疫组织化学

取培养21天之后的分化的成软骨细胞团的10μm冷冻切片。在PBS中清洗切片10分钟，然后于室温下在羊血清(1∶20；Dako UK Ltd.，UK)中封闭30分钟。于4℃潮湿的箱内，将切片在聚集蛋白聚糖抗体[1∶50；6B4](Cardiff University，Bruce Caterson教授馈赠)中孵育过夜。随后在PBS中清洗切片10分钟，并且于室温下与抗-小鼠二抗(1∶50；Dako UK Ltd.，UK)孵育1小时。在PBS中清洗切片，然后在盖玻片下用荧光封固介质(fluorescence mounting medium)(Dako UK Ltd.，UK)封固。如先前ICC所述的，对载玻片显像。

组织学

成软骨细胞团的Van Gieson’s染色：如先前所述的，制备从成软骨细胞分化的细胞团切出的冷冻切片。在水中清洗切片，然后用天青石蓝染色5分钟。切片用水冲洗，然后用Mayer’s苏木素进一步染色5分钟。切片在水中清洗，然后在包含1％(v/v)盐酸的70％(v/v)乙醇中分化。切片在自来水中进一步清洗5分钟，然后用Van Gieson’s染色3分钟。再次清洗载玻片片，然后在盖玻片下用DPX封固剂(Sigma，UK)封固。

用于成骨细胞分化的Von Kossa染色：于4℃下，在70％(v/v)乙醇中固定分化的细胞过夜。在PBS中清洗细胞，然后于黑暗中与5％(w/v)硝酸银(Sigma，UK)孵育5分钟。清洗之后，在包含5％(w/v)碳酸钾的10％(v/v)甲醛溶液中孵育细胞2分钟。细胞在水中充分清洗15-20分钟，然后在Farmers还原剂(0.1％(w/v)硫代硫酸钠和0.1％(w/v)铁氰化钾)中孵育30秒。显像之前，在水中进一步清洗细胞15-20分钟。

用于成脂肪细胞分化的油红O染色：于室温搅拌下，在60％(v/v)异丙醇(Sigma，UK)中清洗固定于70％乙醇中的分化细胞5分钟。于室温搅拌下，用油红O(含0.25％(w/v)油红O(Sigma，UK)的异丙醇)将细胞染色10分钟。在用水清洗和显像之前，细胞在60％(v/v)异丙醇中简单冲洗。

用于成脂肪细胞标记物的RT-PCR

采用(Invitrogen，UK)从OMLP-PC分化的成脂肪细胞中提取RNA。按照厂商的说明，使用随机六聚体引物和莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(Promega，UK)，从0.5μg总RNA中生成cDNA。按照厂商的说明，使用(Promega，UK)进行标准PCR反应，起始变性步骤为94℃，5分钟，接着40个循环：94℃(1分钟)，Ta(30秒)，72℃(1分钟)，以及最后延长步骤为72℃，10分钟。针对脂蛋白脂肪酶的表达[F 5’CCT GCT CGT GCT GAC TCT GG 3’和R 5’CAT CCT GTC CCA CCA GTT TGG 3’]，CAATT/CAATT/增强子结合蛋白α[CEBPα][F 5’CCG GCC TCT TCC CTT ACC AG 3’和R 5’CCA CCG ACT TCT TGG CCT TG 3’]以及过氧化物酶体增殖物激活的受体γ[PPARγ][F 5’CCA CAG GCC GAG AAG GAG AA 3’和R 5’CCA GCA GCC CTG AAA GAT GC3’]分析cDNA。使用Primer3引物设计软件设计(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)设计引物。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并且用0.005％(v/v)溴化乙锭显像。

免疫调节活性

OMLP-PC的细胞培养

如先前所述的，于37℃，5％CO₂下，在含血清的培养基(SCM)中单层培养之前建立的OMLP-PC克隆。对于需要用IFNγ刺激的克隆，在用添加100U/ml IFNγ的SCM刺激之前，使细胞生长至60％融合。将细胞在所述培养基中维持1、2或7天。第3天更换培养基，并且用新鲜IFNγ重新刺激细胞。

OMLP-PC细胞外的HLA I和II表达的FACs分析

OMLP-PC在含有/不含100U/ml IFNγ的情况下生长，并且在刺激后的第1、2和7天通过FACS分析HLA I和II的表达。

去除细胞的条件培养基，并且贮存于-80℃下用于进一步分析。用PBS清洗细胞，然后使用Accutase^TM(Sigma，UK)从塑料制品上分离细胞，然后再次在PBS中清洗。细胞于1700RPM下离心5分钟，除去上清液，并且将细胞重悬于含0.1％牛血清蛋白(BSA)的PBS中。该步骤重复一次。于室温下、黑暗中，将细胞与HLA-I或HLA-II抗体(1∶50稀释；Dako，UK)孵育15分钟。与抗体孵育之后，细胞再次离心，并且在含0.1％BSA的PBS中清洗。细胞再次成团，然后重悬于200ul含0.1％BSA的PBS中，用于如先前所述的FACSCanto^TM流式细胞仪(BD Biosciences，UK)分析。

用于细胞内和细胞外HLA I和II表达分析的Western印迹

OMLP-PC在含有/不含100U/ml IFNγ的情况下生长，并且在刺激后第1、2和7天通过Western印迹分析HLA I和II的表达。在PBS中清洗细胞，然后于包含1％X-100/0.25M蔗糖的Complete^TM蛋白酶抑制剂(Roche Applied Science，UK)中裂解细胞。将蛋白质提取物超声处理以释放细胞内蛋白质，然后使用BCA蛋白分析(Pierce，UK)定量。

在12％丙烯酰胺的分离凝胶上检测蛋白质提取物(5ug)以分离蛋白质，然后于4℃，30V下转移至硝化纤维膜过夜。膜用包含5％脱脂奶粉(Biorad，UK)、0.1％20(TBS-T)的Tris缓冲盐封闭，在含0.1％20(PBS-T)的PBS中清洗3次，与HLA II抗体(1∶250稀释于2％脱脂奶粉；Dako，UK)于室温下孵育1小时。膜在PBS-T中清洗3次，然后用抗小鼠马-辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(1∶3000稀释于2％脱脂奶粉中；Biorad，UK)于室温下孵育1小时。膜随后在PBS-T中清洗2次，在PBS中清洗一次，然后通过ECL^TM检测(GE Healthcare，UK)来检测蛋白。

通过混合的淋巴细胞培养(MLC)确定OMLP-PC对淋巴细胞增殖的作用

OMLP-PC在含有/不含100U/ml IFNγ的情况下生长，并且在刺激后第7天通过MLC分析。细胞在使用Accutase^TM(Sigma，UK)从塑料制品上被分离之前用PBS清洗，并且再次在RPMI培养基中清洗，所述RPMI培养基包含10％人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素、0.25μg/ml两性霉素B。细胞于1700RPM下离心5分钟，然后重悬于上述RPMI培养基中用于计数。细胞用20Gyγ射线辐射，用于确立MLC。

外周血淋巴细胞(PBLs)如先前所述(25)制备。简言之，通过600xg下的Ficoll-Hypaque密度梯度离心20分钟，从肝素化的血液中纯化PBL。在上述RPMI培养基中，应答PBL(A)与来自供体池(Px)或自体同源对照(Ax)的等量的辐射刺激物PBL一起孵育。将辐射的OMLP-PC以相对于应答物100％-0.001％的比率添加至培养物中，并且于37℃，5％CO₂下孵育5天。培养物在氚代胸腺嘧啶脱氧核苷掺入(1uCi)24小时之后的第6天冷冻。第7天，将培养物解冻并且记录增殖。用TomTec收获机(Harvester 96，Tomtec，Orange，CT，USA)于玻璃纤维过滤器上自动收获细胞。

通过混合淋巴细胞培养物确定在T细胞丝裂原存在下对淋巴细胞增殖的作用

如上所述，建立标准混合淋巴细胞培养物(MLC)MLC，以相对于应答细胞1∶1至0.01∶1的比率添加OMLP-PC。将T细胞丝裂原-植物血凝素(PHA)以10ug/ml添加至培养物。如上所述，第4天记录增殖。

确定OMLP-PC诱导的免疫抑制是否为接触依赖性的

如先前所述，在12孔板格式中建立MLC。将OMLP-PC以相对于应答细胞0.1∶1至0.01∶1的比率添加至培养物。接触培养物包括被直接添加至MLC培养物的OMLP-PC。透孔培养物包括被接种至具有0.4um孔径膜的插入物上的OMLP-PC。这将细胞与直接接触应答细胞分开，但是确保它们共有相同的培养基。培养物维持培养5天，然后去除PBL并且再装入96孔板中，然后于37℃下，用氚代胸腺嘧啶脱氧核苷刺激24小时。如先前所述记录增殖。

如下所述，去除一部分PBL用于FACS分析。

针对调节性T细胞和T细胞激活标记物对刺激的PBL的FACS分析

将从透孔和以上接触研究中去除的PBL于1700RPM下离心5分钟。将上清液去除，并且贮存于-80℃下用于进一步研究。于含0.1％BSA的PBS中重悬并且清洗细胞团。如先前所述，制备用于FACS的细胞用于HLA I和II检测。针对CD38、CD3、CD25和CD4或者CD25、CD3、CD127和CD4对细胞进行四重标记。将自体同源对照和A+Px细胞孵育物用作对照。

结果

OMLP中胚胎和发育标记物的表达表明祖细胞群的存在

RT-PCR证实胚胎和多能标记物Nanog和Oct4在整个OMLP组织消化物中的阳性表达。在组织分离物中还检测到人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达，这表明存在位于OMLP中端粒酶阳性的细胞亚群。在整个组织中还存在iPS标记物Sox2和KLF-4(以及Nanog和Oct4)。在整个OMLP消化物中，与Notch信号通路相关的发育标记物Notch受体1、2和3，以及Notch配体Delta 1和Jagged 2的表达也是阳性，表明存在未成熟细胞类型和正在进行Notch信号传输(图7)。

PC群可以从OMLP可靠的分离并且在体外进行快速增殖

在我们的实例中，通过与纤维连接蛋白的粘附区别，已从OMLP分离出PC。如先前报道的，干细胞和祖细胞群的一个特征在于它们通过形成源自单细胞的集落的自我更新能力。这种OMLP纤维连接蛋白粘附的细胞群从单个粘附的细胞成功地生成克隆，并且在发育的集落和扩增的克隆中证明成纤维样形态，本质上的双极性(图8A和B)。这种细胞群的特征在于高的初始增殖率(平均＞4PDs/周)，然后确立1PD/周的恒定水平，并且以大约50-60PD到达细胞衰老(图8C-E)。这些生长动力学参数代表了从所有患者分离和扩增的全部克隆。

OMLP PC表达细胞表面干细胞标记物

在使用在此所述的流式细胞术方法确定干细胞系列标记物STRO-1、CD44、CD146、CD90、CD105、CD166，以及造血和纤维细胞标记物CD34和CD45表达之前，以单层培养扩增克隆。来自所有被测试患者的全部克隆都被证明STRO-1、CD44、CD146、CD90、CD105和CD166的阳性表达，但是CD34和CD45为阴性(图9，STRO-1和CD146的数据未示出)。

OMLP PC表达活性端粒酶

通常认为除了干细胞和淋巴细胞之外，体细胞中端粒酶活性被降低。相反地，已证明人间充质干细胞(MSCs)缺少端粒酶活性，尽管它们具有干细胞特性(3)。通过ICC评估发育的OMLP集落中端粒酶的表达，并且通过Q-TRAP评估来自所有患者的扩增克隆中端粒酶的表达。

在测试的全部发育集落中证明了端粒酶的阳性表达(图10A)，并且在扩增的克隆中维持端粒酶的阳性表达(图10B-D)。在丙烯酰胺凝胶上分离Q-TRAP产物，证实了与端粒重复序列扩增一起观察到典型的“阶梯”效应(图10E)。扩增克隆中的端粒酶的相对水平是患者特异性的，但是相同患者的克隆之间变化不大，与达到细胞衰老的克隆相匹配的患者的总群体倍增(PDs)之间的小差异相关(图8B)。

源自神经嵴的OMLP PC

已证明通过可溶性Jagged 1或γ-分泌酶抑制剂暴露减弱Notch信号传导，这对MSC和神经嵴干细胞(NCSC)的增殖有不同的作用。先前已报道的γ-分泌酶抑制剂N-[N-3，5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸t-丁酯(DAPT)减缓了MSC的生长，最终导致细胞分裂被抑制。相反地，NCSC暴露于可溶性Jagged 1抑制细胞的神经元分化，并且因此使得增殖和扩增增加。

发现在可溶性Jagged 1存在下，OMLP PC的集落形成效率(CFE)显著高于(P＜0.05)对照培养基中的CFE(图11A-B)，支持了在NCSC中观察到的结果，并且由此表明此PC群是神经嵴来源的。为进一步证实OMLP PC的神经嵴来源，在发育集落中通过ICC研究了限定的神经嵴标记物和发育标记物Notch 1的产量。转录因子Sox10、Snail、Slug和Twist肯定主要定位于细胞核，但是还发现于细胞质隔室(compartment)中(图11C-G)。在PC的细胞质中鉴定了Notch 1。这些数据进一步支持此PC群是神经嵴来源的。

在利用与纤维连接蛋白的粘附区别分离的细胞内还发现另外的神经嵴标记物p75神经生长因子(NGF)的表达(图1)。在粘附至发育集落顶部的细胞内发现这种标记物的阳性表达。这些细胞显示出与发育集落中的那些细胞相当不同的形态。这些数据表明，除了在此表征的p75-细胞群外，还存在仍然未表征的p75+细胞群。

OMLP PC为多能的，并且可以生成多细胞系细胞

来自多克隆的OMLP PC向下分化为间充质和神经来源的细胞系。

软骨细胞分化的证据是通过细胞团培养物中胶原蛋白和聚集蛋白聚糖(aggrecan)的产生而证明的(图12A和B)。在成骨细胞分化PC培养物中观察到矿化(图12C)。利用油红O染色在成脂肪细胞刺激的培养物中观察到脂滴，并且针对标记物脂蛋白脂肪酶、CEBP-α和PPARγ的RT-PCR测试为阳性(图12D；RT-PCR数据未示出)。这些数据证实OMLP PC为多能的，并且能够产生间充质细胞类型成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，如先前针对从多个位置如骨髓和牙髓分离的干细胞所证明的。

采用在SCM中以单层连续扩增的PC不可能分化神经元和雪旺细胞(数据未示出)。为了确实地诱导神经元和雪旺细胞分化，克隆在层粘连蛋白包被的平板中在限定的ESC培养基存在下以单层扩增。PC的形态随着在这些限定的条件下的孵育而变化，伴有明显的神经球样体的形成(图2A和4)，与来自SY5Y神经母细胞瘤细胞系的细胞中观察到的现象相似(图3)。利用限定的诱导培养基，扩增的克隆够能向下成功地分化成神经元细胞系，如用ICC通过神经标记物巢蛋白、TUJ-1(β-III微管蛋白)、NFM、GFAP和MAP2的阳性表达所检测的(图6B-F)，以及分化成雪旺细胞系，如通过雪旺细胞特异性标记物MBP和S100的阳性表达而检测的(图6G和H)。在分化之前，克隆仅表达TUJ-1(β-III微管蛋白)、GFAP和S100，但是这比分化时观察到的水平的程度低很多(图5B、C和E)。

OMLP PC具有免疫调节性

OMLP-PC在它们的细胞表面表达HLA I但是不表达HLA II

FACS分析证实未刺激的OMLP-PC克隆在它们的细胞表面表达HLA I，但是不表达HLA II(图13a和b)。用100U/ml IFNγ刺激24小时之后，HLA I表达上调，但是直到第7天才诱导细胞表面表达HLA II(图13c和d)。来自被分析的3位患者中每一个的3个克隆的这些结果是一致的。

用IFNγ刺激24小时之后OMLP-PC表达细胞内HLA II

对来自在含有/不含100U/ml IFNγ下孵育1、2或7天的OMLP-PC克隆的总蛋白提取物进行Western印迹分析。印迹证实在未刺激的OMLP-PC中，细胞外或细胞内都未检测到HLA II的表达(图14)。用IFNγ刺激，24小时之后诱导细胞内HLA II的表达(图14)，但是从上述FACS结果，我们可以假设这种蛋白直到第7天才被转运到细胞膜。这些数据代表被测试的全部克隆和患者。

OMLP-PC的强效免疫抑制性，并且可以直接作用于T细胞增殖

标准的混合淋巴细胞培养物(MLC)培养证明，利用来自其他多种供体的集聚的淋巴细胞孵育观察到对应答细胞的巨大增殖作用。在自体同源对照培养物中观察到，向培养物添加OMLP-PC抑制这种增殖作用回复至基础水平。

有趣地，显示这种作用是非剂量依赖性的，证明98-99％的淋巴细胞增殖被抑制，无论是否以相对于应答细胞10％或0.001％的比率添加OMLP-PC(图15)。还观察到用IFNγ预先刺激7天的OMLP-PC与那些未刺激的细胞有相似的抑制水平，表明这种作用不依赖于HLA II表达(图15)。

当与使用间充质干细胞(MSCs)作为免疫抑制刺激物的培养物直接对比时，显示出对淋巴细胞增殖的剂量依赖性作用(图16)。使用10％比率的MSC实现95％的淋巴细胞增殖，当细胞数量降低至0.001％时，仅观察到有65％的抑制。这等同于以相对于应答细胞0.001％的比率，OMLP-PC抑制淋巴细胞增殖的有效性平均起来为33倍多。另外，与用OMLP-PC克隆观察到的准确重复相比，采用MSC培养物观察到重复序列之间巨大的变化。

在T细胞丝裂原-PHA存在下进行的MLC培养显示OMLP-PC能减少T细胞增殖，直接回复至基础水平，与用IFNγ预先刺激无关(图17)。这些结果证实OMLP-PC可以直接作用于T细胞，虽然仍然不清楚这是否是通过与上述单向MLC淋巴细胞抑制中观察到的机制相同。

使用非接触依赖性机制OMLP-PC具有免疫抑制性

使用OMLP-PC直接接触或与应答细胞一起透孔培养进行单向MLC。获得的数据证明OMLP-PC的强效免疫抑制作用，与PC直接接触的细胞和没有直接接触的细胞相比，淋巴细胞增殖之间没有显著差异(图18)。与处理无关，观察到淋巴细胞增殖被完全抑制，回复到基础水平。这种作用也不依赖于在检测中使用的OMLP-PC的浓度，并且与在MLC检测中使用之前用IFNγ预先刺激细胞无关。

OMLP-PC的免疫抑制机制可能依赖于培养方法

在与OMLP-PC接触和透孔共培养MLC之后，FACS分析恢复的外周血淋巴细胞(PBLs)，确定T细胞亚群的水平。已证明被称为T reg细胞的CD3+、CD4+和CD127低表达的T细胞在与集聚的供体淋巴细胞孵育时数量增至三倍。这些数量似乎并不随着向培养物添加OMLP-PC而变化，与用IFNγ预先刺激或接触无关(图19)。

激活的T细胞水平的变化被再归类为表达C38+和CD3+、CD25+(IL-2受体)的成熟CD3+T细胞，并且对其分析。有趣地，虽然观察到的与细胞-细胞接触相关的免疫抑制水平没有差异，但是在透孔培养系统中观察到激活的CD3+、CD38+T细胞的水平下降(图20)，以及在接触系统中观察到CD3+CD25+T细胞的诱导(图21)。这些作用不依赖于用IFNγ预先刺激。未进行统计分析，生成的图为来自3位患者的平均百分比。

讨论

ASC群已经成为用于许多组织工程应用的多能未分化细胞的值得注意的来源。由于它们在体外快速扩增，但仍然达到有限水平的能力，限制了对移植潜在的致瘤影响的担心，它们具有明显的优于ESC和诱导的多能干细胞(iPS)的优势。此外，这些细胞是多能的，刺激时易于分化，并且没有关于使用干细胞成体来源的现行的伦理或法律问题。

在本研究中，我们首次证明存在固有于OMLP中的新PC群。这些细胞可以在体外由单个细胞克隆扩增，生成用于精确表征的同源细胞群。这种富集过程在产生和扩增足够细胞数量的ASC群用于治疗应用上提供了明显的优势。我们已特意使用细胞的克隆群(而不是来自未分选的整个组织的异源分离物)用于这种表征研究，因为这样能够准确定义纯细胞群。与未分选的或整个组织分离物相比，这还提供了有关移植时这些细胞如何响应和分化的更为精确的表征。干细胞/克隆分选的优势先前已被Kotobuki等人(2004)证明，他们证明用于骨组织工程应用的分选的成骨细胞样细胞的成骨潜能增强(26)。

克隆扩增的OMLP PC通过阳性表达STRO-1、CD44、CD146、CD90、CD105和CD166，而CD34和CD45为阴性而被理想地表征，排除了造血或纤维细胞来源。这些数据还证实OMLP PC具有与骨髓间充质干细胞相似的表达情况(27)。单层培养中的扩增已证实这些细胞将经历快速扩增期，但是寿命有限，在大量细胞群倍增之后(＞50PDs)进入复制衰老。与MSC相反(3)，在发育集落中和大规模传代之后，OMLP PC显示活性端粒酶的表达，为分离的OMLP细胞的干细胞显型提供进一步支持。

在粘附至纤维连接蛋白的发育集落中，CFE在Notch配体、可溶性Jagged 1的存在下增加以及神经嵴标记物Slug、Snail、Twist和Sox10的表达，证实这些细胞的神经嵴来源。这些细胞在体内的颅面位置表明这种细胞群产生于头部神经嵴区域，这由这种细胞群产生间充质和外胚层来源的细胞系的可塑性作为证据支持的证据，所述细胞系包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元细胞和雪旺细胞。有趣地，OMLP PC能够产生的多能性和细胞系情况，可与在颅面区域中限定的NCSC的多能性和细胞系情况相比较。

我们的数据简洁地证明了OMLP-PC的强效免疫调节能力。

在以上讨论的研究中，我们已经证明了OMLP-PC与成体和胎儿MSC类似，在它们的细胞表面表达HLA I而不表达HLA II(28，29)。胎儿和成体MSC中HLA I和II的表达水平之间的差异归因于用IFNγ刺激细胞。此处已证明与IFNγ一起孵育24-48小时，显示成体MSC上调它们的细胞表面表达的HLA II(29)，然而在胎儿MSC中，诱导细胞表面表达HLA II需要刺激7天。在OMLP-PC中，我们证明了对IFNγ刺激胎儿MSC样的应答，直至第7天才观察到细胞表面表达。相反地，在OMLP-PC中，通过Western印迹于刺激24小时内可检测到细胞内HLA II的水平。这是与在成体和胎儿MSC中报道的相似的应答时间(28，29)。

在MLC培养物中，证明OMLP-PC对应答淋巴细胞具有强效免疫抑制作用，抑制淋巴细胞增殖回复至基础水平。在这种应答中，证明98-99％的细胞是有作用的，并且这种作用不依赖于使用的OMLP-PC与应答细胞的比率，以及用IFNγ预先刺激7天以诱导HLA II的表达。这些结果证明通过这些细胞能够抑制淋巴细胞增殖的效率，并且它们的作用方法并不是通过经典陈述的通路。相反地，用成体MSC进行的比较试验证明通过这些细胞作用的免疫抑制方式是剂量依赖性的，并且它们的效率较低-在使用的最低细胞∶细胞比率时降低33倍。

这些结果还证明在用于转化为临床应用的克隆细胞群中进行研究的明显优势。就OMLP-PC而言，克隆和患者之间的复制是高度同源的，然而在MSC培养物中观察到极大的可变性，其包含异源的细胞群(这通过比较图15和16中的数据可见)。

我们使用T细胞丝裂原PHA证明OMLP-PC可以直接作用于T细胞，抑制它们的增殖，而使用透孔培养技术证明在常规MLC条件下观察到的免疫抑制作用是非接触依赖性的，并且不依赖于细胞表面HLA II表达的诱导。接触和透孔试验中使用的应答细胞的FACS分析证明，虽然在接触或透孔培养物中观察到的免疫抑制水平没有差异，但是在2个处理组之间证明了激活的T细胞水平的差异。在接触培养物中诱导了CD3+CD38+T细胞和在透孔研究中抑制了CD3+CD25+T细胞，表明与应答细胞直接接触的OMLP-PC和在透孔系统中的OMLP-PC的作用方式不同。后者的作用直接通过释放至培养基并且影响T细胞的一个或多个可溶性因子。

OMLP-PC能够以非剂量依赖性方式作用，并且不依赖于HLA II在它们的细胞表面或细胞内的表达。这些作用通过非接触依赖性方式发生。

从成体OMLP分离的多能PC提供了优于使用其他ASC来源的几个重要的优势。口腔粘膜是容易得到活组织检查的位置，对在常规牙科处置期间进行活组织检查的患者来说仅要求微创，因此与外科手术如骨髓穿刺用于分离BMSC相比，为患者提供了极大的优势。口腔粘膜中的愈合响应快速和伤痕形成最小也使得PC的分离比从皮肤取样更吸引人，皮肤取样导致疤痕形成。分离任何年龄的自体同源祖细胞也提供了放心的免疫相容性。(患者很少能使用他们自己的骨髓穿刺物用于干细胞应用，而是依赖于异源的供体。这些明显伴随免疫排斥的高风险，这将被使用自体同源PC克服)。此外，我们的数据还表明OMLP-PC对淋巴细胞增殖和抑制异源诱导的免疫应答的强效作用，从而表明成体OMLP PC还应用于异源移植中，并且进一步地，应用于治疗免疫相关疾病，例如但不限于GVHD或自身免疫。

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